Name: Trapianto di subcapsulare renale di 2-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara un metodo semplice ed efficiente per il trapianto subcapsulare renale di timo murino trattato con 2'-deossiguanosina. Questa tecnica facilita lo studio della funzione delle cellule epiteliali timiche e della maturazione dei linfociti T in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto iniziale della Jinan University a S.J. e dal programma di scienza e tecnologia di Guangzhou Cina (Grant No. 201704020209 a S.J.). Ringraziamo Amy Botta (Dipartimento di Biologia, Università di York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) per la revisione e la modifica del manoscritto.

Il protocollo presentato aderisce alle linee guida del comitato etico della Jinan University per quanto riguarda la cura degli animali.
NOTA: i materiali utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Isolamento del timo embrionale
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'esperimento, e sterilizzare la panca / cappuccio con 70% etanolo.</li>
	<li>Utilizzando l'anidride carbonica, anestesizzare ed eutanasia il topo femminile incinta (18,5 giorni dopo l'accoppiamento di successo). Quindi pulire la regione addominale con 70% etanolo. N.B.: Qui abbiamo accoppiato le femmine Insm1 e i maschi Insm1.  L'iniezione intraplacentaria del pentobarbital sono state eseguite prima dell'isolamento degli embrioni dall'utero e la decapitazione è stata eseguita per ogni embrione.</li>
	<li>Utilizzando le forbici, fare un taglio a forma di "V" sull'addome a partire dalla vescica e in esecuzione fino a ogni corno dell'utero.</li>
	<li>Usando le forbici, tagliare il mesotrium e la cervice/vagina e raccogliere l'utero. Collocare l'utero in una piastra Petri contenente su ghiaccio una salina fredda con tamponamenti di fosfato (PBS). Successivamente, esporre gli embrioni che sono nella decidua avvolta, tagliando la parete uterina anteriore da un corno uterino all'altro. Utilizzando una pinzetta fine, staccare i tessuti decidua avvolti e tagliare il cordone ombelicale per rilasciare gli embrioni. Mettere tutti gli embrioni in una nuova teglia Petri sul ghiaccio fino all'isolamento del timo.</li>
	<li>Pulire un embrione con il 70% di alcol e metterlo in una nuova teglia Petri. Da questo passaggio, assicurarsi che le condizioni sterili siano mantenute.</li>
	<li>Tagliando vicino alla mascella inferiore con le forbici, rimuovere la testa dell'embrione e drenare il sangue con un tovagliolo di carta. Quindi, fissare l'embrione sullo stesso piatto Petri in posizione supina. NOTA: Abbiamo tagliato un pezzo della coda di ogni embrione per la genotipizzazione Insm1 e lac.</li>
	<li>Utilizzando le forbici, tagliare la parete laterale del torace orizzontalmente lungo la parte anteriore ascellare, quindi tagliare il diaframma per aprire il torace. Il timo dovrebbe ora essere visibile come due lobi bianchi situati di fronte alla trachea e adiacenti al cuore.</li>
	<li>Posizionare le pinze piegate dietro il timo e poi estrarre delicatamente il timo. Assicurarsi di controllare l'integrità del timo per confermare che contiene due lobi congiunti.</li>
	<li>Lavare il timo con 1x PBS e tagliare i tessuti connettivi e i vasi sanguigni sotto uno stereomicroscopio.</li>
</ol>2. Cultura del timo embrionale isolato
<ol><li>Aggiungete al pozzo di un pozzo di una piastra di 24 pozzetto 100 U/mL di penicillina e 100 streptomici g/mL. Trasferire la timia pulita nei pozzi con un timo per pozzo. Figura 1 mostra il timo isolato nei mezzi di coltura.</li>
	<li>Ad ogni timo-contenente bene aggiungere 2'-deoxygranosine ad una concentrazione finale di 1,25 mM.</li>
	<li>Cultura il timo isolato per otto giorni, rinfrescando sia i media di coltura e 2'-deoxygranosine ogni due giorni.</li>
</ol>3. Stabilire lo spazio del sottocapsulatore nella capsula renale
<ol><li>Per preparare l'ago e il tubo di infusione ritagliato (Figura 2), tagliare l'ago della vena del cuoio capelluto sulla parte del tubo con un angolo di 45 gradi utilizzando le forbici.</li>
	<li>Pesare il topo nudo e poi anesazzarlo con un pentobarbital (1,5%) iniezione (75 g/g di peso corporeo).</li>
	<li>Quando non viene osservato alcun riflesso dopo il pizzico dell'aldidello, posizionare il mouse sul tavolo operatorio in una posizione laterale destra.</li>
	<li>Con uno 0,5% di tampone di iodio povidone, disinfettare la pelle due volte nell'area chirurgica dall'interno all'esterno del corpo.</li>
	<li>Utilizzando le forbici, fare un'incisione cutanea da 5-9 mm parallela alla colonna vertebrale nell'area renale sinistra (tra l'ultima costola e la cresta iliaca). Successivamente, aprire la cavità addominale tagliando attraverso il tessuto sottocutaneo e il muscolo ed esporre il rene.</li>
	<li>Con il rene esposto, utilizzare un paio di pinzette in una mano per sollevare il muscolo e il tessuto adiposo dal bordo dell'incisione lato colonna vertebrale. Con l'altra mano, spremere delicatamente il rene (in alternativa, il rene può essere spremuto con le dita di entrambe le mani).</li>
	<li>Per garantire che la capsula renale sia umida durante l'intervento chirurgico, bagnate la superficie del rene con salina (0,9% NaCl).</li>
	<li>Creare un nick nella capsula renale e graffiare delicatamente la capsula renale nella parte inferiore destra utilizzando la punta dell'ago preparata al passaggio 3.1. La dimensione del nick deve essere 1/2–2/3 larghezze del rene; non graffiare sul rene.</li>
	<li>Far scorrere il tubo di infusione preparato al punto 3.1 nel nick della capsula renale. Dissociare delicatamente la capsula renale con il rene lungo il lato lungo del rene fino a raggiungere 3-4 mm all'interno della capsula renale. Disegnare indietro il tubo di infusione; viene stabilito lo spazio del sottocapsulatore renale.</li>
</ol>4. Trapiantare il timo murino embrionale
<ol><li>Lavare il timo coltivato al passo 2.3 due volte in salina per esaurire i mezzi di coltura.</li>
	<li>Collegare il tubo di infusione ritagliato preparato nel passaggio 3.1 a una siringa alla sua interfaccia di collegamento della siringa. Aspirare lentamente il timo preparato nel tubo di infusione.</li>
	<li>Inserire delicatamente il tubo di infusione ritagliato nella capsula renale e raggiungere il palo superiore. Consegnare il timo nella capsula renale; ritrarre lentamente il tubo spingendo contemporaneamente lo stantuffo della siringa delicatamente.</li>
	<li>Utilizzando una lampada alcool, riscaldare leggermente l'ago preparato al punto 3.1. Dopo aver assicurato che l'intero timo sia all'interno dello spazio del sottocapsulare, utilizzare l'ago riscaldato per cauterizzare il nick.</li>
	<li>Dopo la cauterizzazione, ripristinare il rene nella cavità addominale. Suturare il peritoneo e il muscolo.</li>
	<li>Utilizzando una sutura verticale del materasso interrotta modificata, chiudere l'incisione cutanea (legare almeno tre nodi e tagliare qualsiasi filo in eccesso).</li>
	<li>Utilizzando un tampone di iodio povidone, disinfettare l'incisione. Per alleviare il dolore, l'iniezione sottocutanea di flunixina (2 g/g di peso corporeo) è stata eseguita durante l'intervento chirurgico e poi per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Fino a quando completamente recuperato dall'anestesia, mantenere il mouse caldo sotto la lampada a infrarossi.</li>
	<li>Mantenere il timo nella capsula renale del ricevente per 8 settimane prima di sezionare il timo trapiantato e condurre l'analisi fenotipica come precedentemente descritto5,8,9.</li>
</ol>

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host-reactive+and+MHC-restricted+T+cells+in+a+transplanted+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+patient+suggest+positive+selection+and+absence+of+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion.</a> Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).</li>
<li>Nagamine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+APECED+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the APECED gene.</a> Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).</li>
<li>Yanagihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+regulation+of+Aire+expression+by+Jmjd6+for+self-tolerance+induction+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus.</a> Nature Communications. 6 (8820), (2015).</li>
<li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+2-dGuo-Treated+Thymus+Organ+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22T-Cell+Development%3A+Methods+and+Protocols%22">T-Cell Development: Methods and Protocols</a>. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+Orchestrates+a+Thymic+Program+of+Self-Antigen+Expression+for+Immune+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).</li>
<li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Withdrawal+I%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Blood Withdrawal I.</a> Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc-finger+factor+Insm1+%28IA-1%29+is+essential+for+the+development+of+pancreatic+beta+cells+and+intestinal+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells.</a> Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).</li>
<li>Tao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+Insm1+Impairs+Postnatal+Baseline+%CE%B2-Cell+Mass%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass.</a> Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Il trapianto di subcapsulare renale del timo embrionale è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e il processo di maturazione delle cellule T in vivo. Anche se ci sono diversi studi sperimentali sulla coltura embrionale dell'organo timo e il trapianto6,7, il nostro protocollo fornisce una semplice procedura alternativa sulla coltura del timo embrionale murino e subcapsulare renale trapianto per timo più vecchio.
<p clas...

Il timo è l'organo immunitario centrale, all'interno dei timociti sottoposti a selezione positiva e negativa, e diventano cellule T mature1,2. La selezione positiva o negativa anomala provoca immunodeficienza o patologie autoimmuni rispettivamente3,4. Pertanto, il trapianto di organo timo è un approccio importante per studiare il processo di selezione delle cellule T nel timo del donatore. Questo metodo è particolarmente importante quando si analizza la funzione epiteliale timica mediata da mutazioni genetiche che causano fenotipo letale embrionale quando mutato5.
Per studiare la maturazione delle cellule T di un ricevente nel timo trapiantato, è necessario ridurre i linfociti del donatore all'interno del timo. A questo scopo, il timo embrionale di 14, 15 o 16 giorni (E14, E15, E16) viene solitamente selezionato6,7. Il timo da stadi più maturi può anche essere esaurito con successo dei linfociti del donatore trattando con 2'-deossiaguanosina. Tuttavia, un protocollo dettagliato per esaurire i linfociti e l'uso della vecchia coltura del timo non è stato descritto in precedenza8,9. Mentre i protocolli di trapianto sono stati introdotti da diversi studi10,11, ulteriore modifica e miglioramento di questi protocolli è necessario.
Il nostro protocollo è diviso in due parti: (i) Depletion of T lymphocites from late developmental stage E18.5 thymus by culture in 2'-deoxyguanosine-containing media. ii) Trapianto del timo colto in destinatari. In questa procedura, abbiamo sviluppato un modo semplice per fornire il grande tessuto (E18.5 timo) nella capsula renale con ridotta probabilità di lesioni renali. Mentre ci si concentra sul timo dello stadio successivo, il nostro protocollo può anche essere utilizzato direttamente o con modifiche per il trapianto di timo in varie fasi di sviluppo o altri tessuti di dimensioni simili.

<table><tbody><tr><td>0,5% iodio povidone</td><td>Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd</td><td>20171113</td><td></td></tr><tr><td>0,9% cloruro di sodio iniezione</td><td>Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd</td><td>2C17112101</td><td></td></tr><tr><td>1 mL siringa sterile</td><td>Solarbio</td><td>YA1090</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossiguanosina</td><td>MEC</td><td>HY-17563</td><td>1M in DMSO, 1:800 utilizzando (finale 1,25mM)</td></tr> <tr><td>24 pozzetti Piastra</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Aghi per sutura chirurgica con filo</td><td>NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory Cina</td><td>YY0166-2002</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 60 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>70% ETOH</td><td>LIRCON</td><td>20181221</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpi CD8a anti-topo</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Pinze fini a punta piegata, JZ 10 cm</td><td>Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd.</td><td>JD1060</td><td>Per sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Cefmetazolo sodico per iniezione</td><td>Sichuan Hexin Pharmaceutical co, Ltd</td><td>17062111 079</td><td>6mg in 0,5 ml 0,9% soluzione NaCl, 7,5 ul / g peso corporeo</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, JZ 10 cm</td><td>Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd.</td><td>JC2303</td><td>Per sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>il siero fetale bovino (FBS?</td><td>GIBCO</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine, JZ 10 cm</td><td>Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd.</td><td>JD1050</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Citometria a flusso</td><td>BD</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Flunixin meglumina</td><td>MACLIN</td><td>F810147</td><td>1 mg in 1 ml di soluzione di NaCl allo 0,9%, 2ul/g di peso corporeo</td></tr><tr><td>Pincipe, Dumont#5</td><td>World Precision Instruments</td><td>14098</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi</td><td>OTLAN</td><td>MT-810</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi, JZ 14 cm</td><td>Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd.</td><td>J32010</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>PE anti-topo CD4</td><td>Biolegend</td><td>100511</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Miscela penicillina-streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Pentobarbital sale sodico</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5% soluzione in PBS, 75ug/g peso corporeo</td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>GIBCO</td><td>C14-11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Ago</td> <td>per vene del cuoio capellutoShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td><td>XC001</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>VANNAS</td><td>S11014-12</td><td>Per sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>stereomicroscopio</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di cotone sterile da 15 cm</td><td>Guangzhou Haozheng</td><td>20150014</td><td></td></tr><tr><td>Garza sterile 5 cm x 7 cm-8P</td><td>Guangzhou Haozheng</td><td>20172640868</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile (1x)</td><td>GENOM</td><td>GNM20012</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti, JZ 12,5 cm</td><td>Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd.</td><td>J41010</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr></tbody></table>

trapianto di subcapsulare renale di 2'-deoxyguanosine-treated murine embryonic thymus in topi nudi

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Il timo è un importante organo immunitario centrale, che svolge un ruolo essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T. Il trapianto di timo è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e la maturazione delle cellule T in vivo. Qui descriveremo i metodi sperimentali utilizzati all'interno del nostro laboratorio per trapiantare 2'-deossiguanosina (per esaurire i linfociti del donatore) trattati tiromo embrionale nella capsula renale di un topo nudo alatico. Questo metodo è semplice ed efficiente e non richiede abilità o dispositivi speciali. I risultati ottenuti con questo semplice metodo hanno mostrato che il timo trapiantato può sostenere efficacemente la produzione di cellule T del ricevente. Inoltre, diversi punti chiave per quanto riguarda il protocollo saranno ulteriormente chiariti.

Qui mostriamo il timo isolato E18.5 contenente due lobi completi (Figura 1). Inoltre, mostriamo l'ago della vena del cuoio capelluto che è stato ritagliato per formare uno smusso sul tubo di infusione (Figura 2). Successivamente, mostriamo anche un'immagine rappresentativa della posizione del timo che è stato trapiantato nella capsula renale (Figura 3A) e il timo dopo 8 settimane di crescita all'interno dei topi ricitati (<strong cl...

Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2'-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...

Il trapianto di timo è un metodo importante per indagare la funzione cellulare epiteliale del timo e la maturazione delle cellule T in vivo. Questo protocollo semplice ed efficiente può essere utilizzato per isolare e coltura il topo 18,5 timo per il successivo trapianto in una capsula renale. Il protocollo per il trapianto di timo 18.5 può essere modificato per il trapianto timico in altre fasi di sviluppo o per altri tessuti di dimensioni simili.Inoltre, questa procedura è molto semplice. I dettagli per alcuni dei francobolli della custodia devono essere esaminati attentamente quando si esegue questa tecnica per la prima volta. Questa procedura contiene manipolazioni dettagliate che possono essere meglio illustrate con la visualizzazione.Dopo il sacrificio, pulire il giorno embrionale 18,5 topo incinta con 70%etanolo e utilizzare strumenti sterilizzati autoclavati per fare un taglio a forma di V sull'addome dalla vescica fino a ogni corno dell'utero. Utilizzare le forbici per tagliare il mesometrio e le aree cervicali e vaginali e raccogliere l'utero in una piastra di Petri contenente PBS freddo sul ghiaccio. Tagliare la parete uterina anteriore da un corno uterino all'altro per esporre gli embrioni all'interno dell'involucro alla decidua e utilizzare pinzette fini per sbucciare i tessuti deciduali.Tagliare il cordone ombelicale per rilasciare gli embrioni per il trasferimento in una nuova piastra di Petri sul ghiaccio. Per raccogliere il primo timo, pulire un embrione con il 70% di alcol e trasferire l'embrione in una nuova piastra di Petri. Dopo la decapitazione, fissare l'embrione nel piatto in posizione supina e utilizzare forbici sterili per tagliare la parete laterale del torace orizzontalmente lungo il fronte ascellare.Taglia il diaframma per aprire il petto. Il timo dovrebbe essere visibile come due lobi bianchi situati di fronte alla trachea e adiacenti al cuore. Inserire con cura le fasci piegate dietro il timo e tirare delicatamente verso l'alto per raccogliere il tessuto.Controllare l'integrità del timo per confermare che contiene due lobi articolari. Quindi lavare il timo con PBS prima di utilizzare un microscopio stereo per tagliare via i tessuti connettivi e i vasi sanguigni. Una volta raccolto tutto il thymi, trasferire ogni tessuto pulito in singoli pozzi di una piastra di 24 porri contenente 500 microlitri di mezzo di coltura per pozzo.E aggiungere 2'deossigranosina ad una concentrazione finale di 1,25 millimolare per pozzo. Quindi posizionare il thymi isolato nell'incubatore di coltura cellulare per otto giorni. L'ultimo giorno di coltura, usa le forbici per tagliare un ago della vena del cuoio capelluto sulla parte del tubo dell'infusione con un angolo di 45 gradi e confermare la mancanza di risposta al dito del piedino in un animale ricevente nudo.Posizionare il mouse sul tavolo operatorio in una posizione laterale destra e utilizzare un tampone di iodio di iodio allo 0,5% per tamponare la pelle nell'area chirurgica due volte dall'interno all'esterno del corpo. Usa il bisturi per fare un'incisione cutanea da cinque a nove millimetri parallela alla colonna vertebrale nella zona renale sinistra e tagliare il tessuto sottocutaneo e il muscolo per aprire la cavità addominale. Usando un paio di pinzette con una mano, sollevare il muscolo e il tessuto adiposo dal bordo di incisione laterale della colonna vertebrale del rene esposto e utilizzare l'altra mano per spremere delicatamente il rene.Per mantenere la capsula renale umida durante l'intervento chirurgico, bagnare la superficie del rene con soluzione salina e utilizzare l'ago del cuoio capelluto per graffiare delicatamente la capsula renale in basso a destra circa 1/2 a 2/3 della larghezza del rene. Far scorrere il tubo di infusione nel nick della capsula e staccare delicatamente la capsula renale dal rene lungo il lato lungo del rene di circa tre o quattro millimetri nella capsula renale. Quindi ritrarre il tubo di infusione.Per impiantare il timo nello spazio subcapsulare creato, lavare un timo di coltura due volte in soluzione salina fresca e collegare il tubo di infusione tagliato a una siringa. Aspirare lentamente il timo preparato nel tubo di infusione modificato. E inserire delicatamente il tubo di infusione nella capsula renale fino a raggiungere il polo superiore.Per consegnare il timo nella capsula renale, ritrarre il tubo lentamente mentre allo stesso tempo deprimere delicatamente lo stantuffo. Usando una lampada alcolica, riscaldare leggermente l'ago del cuoio capelluto e dopo aver confermato che l'intero timo si trova all'interno dello spazio sottocapsulare, utilizzare l'ago riscaldato per cauterizzare il nick. Ripristinare il rene cauterizzato nella cavità addominale e chiudere il peritoneo e il muscolo con suture.Utilizzando una sutura del materasso verticale interrotta modificata, chiudere l'incisione cutanea con almeno tre nodi e utilizzare un tampone di iodio povidone per disinfettare l'incisione. Quindi fornire un'iniezione sottocutanea di antibiotico e analgesia e posizionare il mouse sotto una lampada a infrarossi con monitoraggio fino al pieno recupero. Qui, si può osservare un giorno embrionale isolato di 18,5 timo contenente due lobi completi.Immediatamente dopo l'impianto, il timo può essere visualizzato sotto la capsula renale sulla punta del rene ricevente. Dopo otto settimane di crescita all'interno dell'animale ricevente di topo nudo, il timo rimane sotto la capsula, ma aumenta robustamente di dimensioni. Le cellule T sono prodotte sia nel timo trapiantato che nel sangue periferico dei riceventi di topi nudi.Ma come previsto, non vengono rilevate cellule T nella periferica di animali nudi non trapiantati. Inoltre, in questo esperimento rappresentativo, non è stato rilevato alcun gene LacZ nelle cellule T periferiche raccolte dal sangue periferico dei riceventi di topi nudi trapiantati con lobi di timo contenenti l'allele LacZ, indicando che le cellule T periferiche sono state generate dagli animali riceventi. Sii delicato quando scivoli il tubo in una capsula renale.Evitare di rompere la capsula. E assicurati di avere abbastanza spazio nella per la consegna del timo. Le popolazioni di cellule T timiche o periferiche possono essere analizzate usando il citometro a flusso.Dove, le risposte immunitarie nei tessuti periferici del ricevente possono essere analizzate dall'I2d e dall'analisi istochimica immunitaria.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.

Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto

Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata del trapianto di timo murino da diversi topi donatori anziani sotto la capsula renale di riceventi di topi immunodeficienti. L'obiettivo di questo approccio è quello di modellare lo sviluppo delle cellule T e gli eventi di selezione timica in vivo.

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -&gt; C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle.

Murine tutto spessore trapianto della pelle

Abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione di epatectomia parziale (PHx) e trapianto di cellule via della milza nel cenno del capo. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) topi. In questo protocollo, un'incisione è fatta per esporre e resecare il lobo sinistro del fegato seguito da un'altra incisione per il trapianto di cellule intrasplenic.

Intrasplenic trapianto di epatociti dopo epatectomia parziale in NOD. Topi SCID

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.

L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Impara un metodo semplice ed efficiente per il trapianto subcapsulare renale di timo murino trattato con 2'-deossiguanosina. Questa tecnica facilita lo studio della funzione delle cellule epiteliali timiche e della maturazione dei linfociti T in vivo.

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

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