Name: Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Scopri come analizzare varianti missenso in proteine umane utilizzando Drosophila melanogaster come modello in vivo. Questo metodo rapido ed economico facilita la diagnosi di malattie rare e lo studio dei meccanismi patologici.

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Ringraziamo Jose Salazar, Julia Wang e la dottoressa Karen Schulze per la lettura critica del manoscritto. Riconosciamo i dottori Ning Liu e Xi Luo per la caratterizzazione funzionale delle varianti TBX2 discusse qui. Undiagnosed Diseases Network Model Screening Center è stato supportato attraverso il National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. è stato inoltre sostenuto dal NIH[CNCDP-K12 and NINDS (1K12 NS098482)], dall'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), dal Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), dalla Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman) e il NIH Director's Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. è stato inoltre sostenuto dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479). S. Y. è stato inoltre sostenuto dalla NIH (R01 DC014932), dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), dall'Alzheimer(New Investigator Research Grant: 15-364099), dal Naman Family Fund for Basic Research e dal Caroline Wiess Law Fund for Research in Medicina molecolare. La microscopia confocale al BCM è supportata in parte da NIH Grant U54HD083092 al Nucleo di Neurovisualizzazione dell'Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Studi sperimentali che utilizzano la Drosophila melanogaster forniscono un robusto sistema di analisi per valutare le conseguenze delle varianti umane associate alla malattia. Ciò è dovuto al grande corpus di conoscenze e ai diversi strumenti genetici che sono stati generati da molti ricercatori nel campo del volo nel corso dell'ultimo secolo89. Proprio come qualsiasi altro sistema sperimentale, tuttavia, è importante riconoscere le avvertenze e le limitazioni che esistono.
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I pazienti con malattie rare spesso subiscono un viaggio arduo indicato come "odissea diagnostica" per ottenere una diagnosi accurata1. Si ritiene che la maggior parte delle malattie rare abbia una forte origine genetica, rendendo critici gli elementi critici dell'elaborazione genetica/genomica dell'elaborazione clinica. Oltre all'analisi delle variazioni dei pannelli genici e dei numeri di copie candidati, oltre all'analisi delle variazioni dei numeri cromosomici, all'intero esoma (WES) e al sequenziamento dell'intero genoma sono diventati strumenti sempre più preziosi nell'ultimo decennio2, 3. Attualmente, il tasso diagnostico per identificare una variante patogena nota in WES e WGS è di 25% (superiore nei casi pediatrici)4,5. Per la maggior parte dei casi che rimangono non diagnosticati dopo WES/WGS clinici, un problema comune è che ci sono molti geni e varianti candidati. Il sequenziamento di nuova generazione spesso identifica varianti nuove o ultrarare in molti geni e interpretare se queste varianti contribuiscono ai fenotipi della malattia è difficile. Ad esempio, anche se la maggior parte delle mutazioni senza senso o frameshift nei geni sono ritenute come alleli di perdita di funzione (LOF) a causa del decadimento mediato da sciocchezze della trascrizione codificata, mutazioni troncanti trovate negli ultimi esoni sfuggono a questo processo e possono funzionare come benigni o gain-of-function (GOF) alleli6.
Inoltre, prevedere gli effetti di un allele missense è un compito scoraggiante, dal momento che può portare a una serie di diversi scenari genetici come descritto per la prima volta da Herman Muller negli anni '30 (cioè amorfi, ipomorfi, ipomorfi, antimorfi, antimorfi, neomorfi o isomorfi)7 . Numerosi programmi e metodologie in silico sono stati sviluppati per prevedere la patogenicità delle varianti missense basate sulla conservazione evolutiva, il tipo di cambiamento degli amminoacidi, la posizione all'interno di un dominio funzionale, la frequenza allele nella popolazione generale, e altri parametri8. Tuttavia, questi programmi non sono una soluzione completa per risolvere il complicato problema dell'interpretazione delle varianti. È interessante notare che, un recente studio ha dimostrato che cinque algoritmi di previsione della patogenicità variante ampiamente utilizzati (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) concordano sulla patogenicità 80% delle volte8 . In particolare, anche quando tutti gli algoritmi sono d'accordo, restituiscono una previsione errata della patogenicità fino all'11% del tempo. Questo non solo porta a un'interpretazione clinica imperfetta, ma può anche dissuadere i ricercatori dal seguire le nuove varianti elencandole falsamente come benigne. Un modo per completare l'attuale limitazione della modellazione in silico consiste nel fornire dati sperimentali che dimostrino l'effetto della funzione variant in vitro, ex vivo (ad esempio, cellule coltivate, organoidi) o in vivo.
Gli studi funzionali in vivo sulle varianti associate alle malattie rare nel MO hanno punti di forza unici13 e sono stati adottati da molte iniziative di ricerca sulle malattie rare in tutto il mondo, tra cui la Rete delle Malattie Non Diagnosi (UDN) negli Stati Uniti e Rara Malattie Modelli & Meccanismi (RDMM) Reti in Canada, Giappone, Europa e Australia14. Oltre a questi sforzi coordinati per integrare i ricercatori MO nel flusso di lavoro della diagnosi di malattie rare e degli studi meccanicistici su scala nazionale, una serie di studi di collaborazione individuale tra ricercatori clinici e MO hanno portato alla scoperta e caratterizzazione di molti nuovi geni e varianti che causano malattie umane82,83,84.
Nell'UDN, un Centro di screening centralizzato degli organismi modello (MOSC) riceve la presentazione di geni e varianti candidati con una descrizione delle condizioni del paziente e valuta se la variante è probabilmente patogena utilizzando strumenti informatici e in vivo Esperimenti. Nella Fase I (2015-2018) dell'UDN, il MOSC comprendeva un Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] e il nucleo di pesce zebra (Università dell'Oregon) che ha lavorato in collaborazione per valutare i casi. Utilizzando l'analisi informatica e una serie di diverse strategie sperimentali in Drosophila e pesce zebra, il MOSC ha finora contribuito alla diagnosi di 132 pazienti, l'identificazione di 31 nuove sindromi55, scoperta di diversi nuovi i geni della malattia (ad esempio, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e l'espansione fenotipica della malattia nota (ad esempio, CACNA1A21, ACOX122).
Oltre ai progetti all'interno dell'UDN, i ricercatori del MOSC Drosophila Core hanno contribuito a nuove scoperte geniche della malattia in collaborazione con i Centers for Mendelian Genomics e altre iniziative (ad esempio, ANKLE223, TM2D3 24 , NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizzando lo stesso insieme di informatica e genetica strategie sviluppate per l'UDN. Dato il significato degli studi di MO sulla diagnosi di malattia rara, il MOSC è stato ampliato per includere un C. elegans Core e un secondo nucleo di pesce zebra (entrambi alla Washington University di St. Louis) per la fase II (2018-2022) dell'UDN.
Questo manoscritto descrive un protocollo di studio funzionale in vivo che viene utilizzato attivamente nel nucleo di Drosophila UDN MOSC per determinare se le varianti missense hanno conseguenze funzionali sulla proteina di interesse utilizzando mosche transgeniche che esprimono l'uomo Proteine. L'obiettivo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori MO a lavorare in collaborazione con gruppi di ricerca clinica per fornire prove sperimentali che una variante candidata in un gene di interesse ha conseguenze funzionali, facilitando così la diagnosi clinica. Questo protocollo è particolarmente utile in uno scenario in cui un ricercatore della Drosophila viene avvicinato da un ricercatore clinico che ha un paziente a malattia rara con una variante candidata specifica in un gene di interesse.
Questo protocollo può essere suddiviso in tre elementi: (1) raccogliere informazioni per valutare la probabilità che la variante di interesse sia responsabile del fenotipo del paziente e la fattibilità di uno studio funzionale in Drosophila, (2) raccolta strumenti genetici esistenti e stabilirne di nuovi, e (3) svolgere studi funzionali in vivo. Il terzo elemento può essere ulteriormente suddiviso in due sottoelementi in base al modo in cui può essere valutata la funzione di una variante di interesse (esperimento di salvataggio o strategie basate su sovraespressioni). È importante notare che questo protocollo può essere adattato e ottimizzato a molti scenari al di fuori della ricerca sulle malattie monogeniche rare (ad esempio, malattie comuni, interazioni genetico-ambiente e schermi farmacologici/genetici per identificare gli obiettivi terapeutici). La capacità di determinare la funzionalità e la patogenicità delle varianti non solo gioverà al paziente di interesse fornendo una diagnosi molecolare accurata, ma avrà anche un impatto più ampio sulla ricerca scientifica traslazionale e di base.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Stock per la transgenesi UAS-cDNA umano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection ceppi per la transgenesi (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Reagente specifico: VK33 (3° cromosoma) Linea di iniezione</td></tr><tr><td>Ceppi di iniezione per la transgenesi (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Reagente specifico: VK37 (2° cromosoma) Linea di iniezione</td></tr><tr><td><forte>DNA plasmidico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vettore di clonaggio</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Reagente specifico: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila vettore di transgenesi</td><td>Dono dei dottori Johannes Bischof e Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Reagente specifico: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Kit e reagenti per biologia molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Reagente specifico: Agarosio (grado di biologia molecolare)</td></tr><tr><td>Cellule chimicamente competenti (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Reagente specifico: DH5&alfa;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel di DNA</td><td>Reagente specifico Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>: Kit di estrazione del gel PureLink</td></tr><tr><td>Kit di isolamento e purificazione del DNA</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Reagente specifico: Kit QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Reagente specifico: Kit polimerasi Q5</td></tr><tr><td>Sistema di clonazione mediato dalla ricombinasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Reagente specifico: Kit Gateway BP Clonasi</td></tr> Sistema <tr><td>di clonazione mediato dalla ricombinasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Reagente specifico: Kit enzimatico Gateway LR Clonasi II</td></tr><tr><td>Kit per mutagenesi diretta al sito</td><td>Agilent</td><td>#200523</td><td>Reagente specifico: Kit per mutagenesi Quick Change II</td></tr><tr><td>Elettroretinogramma Attrezzatura relativa al rig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analisi</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Reagente specifico: Axon pCLAMP 10 Data Software Package ERG Data</td></tr><tr><td>Collection</td><td>LabX</td><td></td><td>#R150358 Reagente specifico: Amplificatore biologico isolato ISO-DAM</td></tr><tr><td>Reagente ERG</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Reagente specifico: Stimolatore a impulsi quadrati</td></tr></tbody></table>

studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

I progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno reso i set di dati dell'intero genoma e dell'intero esoma più accessibili sia per la diagnosi clinica che per la ricerca sulla genetica umana all'avanguardia. Sebbene siano stati sviluppati diversi algoritmi in silico per prevedere la patogenicità delle varianti identificate in questi set di dati, gli studi funzionali sono fondamentali per determinare come specifiche varianti genomiche influiscono sulla funzione delle proteine, in particolare per un errore Varianti. Nella rete di ricerca sulle malattie non diagnosticate (UDN) e in altri consorzi di ricerca sulle malattie rare, gli organismi modello (MO) tra cui la Drosophila, i c. elegans, ipesci zebra e i topi sono utilizzati attivamente per valutare la funzione di malattia umana putativa che causa Varianti. Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione funzionale delle varianti umane rare utilizzate nel Centro di screening degli organismi modello Drosophila Core dell'UDN. Il flusso di lavoro inizia con la raccolta di informazioni umane e MO da più database pubblici, utilizzando la risorsa web MARRVEL per valutare se la variante potrebbe contribuire alle condizioni di un paziente e progettare esperimenti efficaci basati su quelli disponibili conoscenze e risorse. Successivamente, vengono generati strumenti genetici (ad esempio, linee CDNA T2A-GAL4 e UAS-umani) per valutare le funzioni delle varianti di interesse per la Drosophila. Dopo lo sviluppo di questi reagenti, è possibile eseguire analisi funzionali su due punte basate su esperimenti di salvataggio e sovraespressione per valutare la funzione di variante. Nel ramo del salvataggio, i geni della mosca endogena vengono "umanizzati" sostituendo il gene ortologo della Drosophila con transgeni umani di riferimento o variante. Nel ramo della sovraespressione, le proteine umane di riferimento e variante sono esogenamente guidate in una varietà di tessuti. In entrambi i casi, qualsiasi fenotipo setabile (ad esempio, letalità, morfologia degli occhi, elettrofisiologia) può essere utilizzato come lettura, indipendentemente dalla malattia di interesse. Le differenze osservate tra gli alleli di riferimento e varianti suggeriscono un effetto specifico della variante, e quindi probabilmente patogenicità. Questo protocollo consente valutazioni rapide e in vivo delle varianti putative che causano malattie umane di geni con funzioni note e sconosciute.

Studio funzionale della variante missense de novo in EBF3 collegato ai fenotipi neurosviluppo In un maschio di 7 anni con fenotipi di neurosviluppo tra cui ipotonia, atassia, ritardo dello sviluppo globale e disturbi del linguaggio espressivo, medici e genetisti umani presso il National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identificato una variante di errore de novo (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un gene che codifica u...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la progettazione e le prestazioni degli esperimenti in vivo nella Drosophila melanogaster per valutare le conseguenze funzionali delle varianti genetiche rare associate alle malattie umane.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Questo protocollo ci permette di determinare se le varianti di missense nei geni umani collegate alle malattie influenzano la funzione proteica. Questo è difficile da realizzare computazalmente anche con algoritmi all'avanguardia. Questa tecnica consente una rapida analisi delle varianti di missense nelle proteine umane utilizzando un sistema in vivo Drosophila melanogaster che è più veloce ed efficiente in termini di costi rispetto agli organismi modello dei vertebrati.Dimostrare che una variante specifica influisce sulla funzione proteica contribuisce direttamente alla diagnosi di malattie rare e funge da punto di partenza per l'analisi del meccanismo delle malattie e potenziali terapie. Questo protocollo è particolarmente utile quando si studiano varianti legate alle malattie rare, ma può essere applicato a malattie più comuni come l'autismo e il cancro. Identificare fenotipi riproducibili nelle mosche che riflettono la funzione proteica può essere impegnativo.I fenotipi possono variare da un gene all'altro e possono essere sottili. Studi funzionali di varianti di proteine umane utilizzando Drosophila possono essere eseguiti sulla base di esperimenti di salvataggio o studi di sovraespressione. Prima di iniziare la procedura, raccogliere informazioni sul gene umano di interesse e sui suoi ortologi dell'organismo modello.Per testare la funzione variante sovraesprimendo le proteine umane di riferimento e varianti nel sistema visivo fly, generare mosche transgeniche che esprimono riferimenti o varianti di cDNA umani di interesse sotto il controllo della sequenza di attivazione upstream Gal4 o del sistema UAS. Per selezionare una specifica linea Gal4 per esprimere le proteine umane in uno specifico tessuto di mosca, attraversare da tre a cinque femmine vergini dalla linea Gal4 con da tre a cinque maschi da ciascuna delle linee transgeniche della CDNA umana UAS in singole fiale o in duplicati. Trasferire le croci ogni due o tre giorni per ottenere il maggior numero possibile di animali che si racchiudono da una singola croce ed esaminare l'animale chiuso al microscopio a dissezione per identificare eventuali differenze tra i ceppi di riferimento e varianti.Se c'è un difetto visibile, immagini le mosche per documentare i fenotipi. Per generare mosche per testare difetti funzionali nel sistema visivo, incrociare le femmine vergini dalla linea rodopsina 1 Gal4 ai maschi con transgeni cDNA umani UAS di riferimento o variante per esprimere le proteine umane di interesse nei fotorecettori da R1 a R6 nella retina di mosca. Una volta che le mosche iniziano a chiudersi, raccogliere la progenie in fiale fresche e riportare le fiale in un incubatore impostato alla temperatura sperimentale appropriata per altri tre giorni per consentire al sistema visivo di maturare.Alla fine dell'incubazione, immobilizzare le mosche con un metodo di anestesia appropriato e incollare delicatamente un lato di ogni mosca su uno scivolo al microscopio di vetro. Dopo aver installato un impianto elettroretinogramma, posizionare un capillare di vetro di 1,2 millimetri in un estrattore di ago e rompere il tubo capillare per ottenere due elettrodi affusolata cavi affilati con diametri inferiori a 0,5 millimetri. Riempire i capillari con una soluzione salina da 100 millimolare facendo attenzione ad evitare bolle d'aria e far scorrere i capillari di vetro sugli elettrodi di filo d'argento.Blocca i capillari in posizione e acclimata le mosche per completare l'oscurità per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'assunzione, posizionare lo scivolo contenente le mosche sull'apparecchio di registrazione e spostare i micromanipolatori che trasportano gli elettrodi di riferimento e di registrazione vicino alla mosca di interesse. Guardando la punta dell'elettrodo, posizionare con cura l'elettrodo di riferimento nel torace della mosca penetrando nella cuticola e posizionare l'elettrodo di registrazione sulla superficie dell'occhio.Per registrazioni elettroretinografiche di successo, fare attenzione ad applicare una quantità appropriata di pressione all'elettrodo di registrazione in modo che causi una piccola fossette senza penetrare nell'occhio. Quando gli elettrodi sono stati posizionati, spegnere la luce primaria per tre minuti per riassociare le mosche all'ambiente buio. Al termine del periodo di ri-acclimatazione, aprire e chiudere l'otturatore una volta al secondo per 20 secondi registrando gli elettroretinogrammi da almeno 15 mosche per scorrimento per genotipo per condizione utilizzando gli stessi elettrodi.Quando le registrazioni delle mosche di riferimento e variante sono complete, confrontare le registrazioni dell'elettroretinogramma dal riferimento, dalla variante e dai controlli per valutare le differenze. Quindi valutare i dati dell'elettroretinogramma per le variazioni nei transitori, la depolarizzazione, i transitori spenti e la ripolarizzazione. In questo esperimento rappresentativo, sono stati eseguiti studi basati sull'iperespressione per TBX2 poiché il riferimento umano TBX2 non è stato in grado di sostituire funzionalmente il gene della mosca ortologa rendendo impossibili le strategie basate sul salvataggio.Quando il TBX2 umano di riferimento è stato sovraespresso nell'occhio in via di sviluppo e in parti del cervello utilizzando Gal4 senza occhi, l'iperespressione si traduce in una letalità di circa l'85% e in una significativa riduzione delle dimensioni degli occhi. Al contrario, la variante transgene è meno potente nel causare letalità e induce un piccolo fenotipo oculare usando lo stesso driver in condizioni sperimentali identiche suggerendo che la variante influisce sulla funzione proteica. Inoltre, quando un TBX2 umano di riferimento è sovraespresso nei fotorecettori usando rodopsina Gal4, la sovraespressione provoca un'alterazione significativa nella traccia dell'elettroretinogramma.Questo fenotipo è più lieve quando la proteina variante è espressa fornendo ulteriori prove che la variante di interesse influisce sulla funzione proteica in vivo. È importante notare che ogni gene è unico, quindi non esiste un singolo esperimento in grado di valutare l'impatto di tutte le varianti associate alla malattia. Oltre a lavorare con i cDNA umani, si può anche determinare se la variante ha conseguenze funzionali introducendo varianti analoghe nei residui evolutivamente conservati del gene della mosca ortologa.Utilizzando questo metodo, abbiamo contribuito a una serie di studi sulla scoperta di geni delle malattie umane in collaborazione con la rete di malattie non diagnosticate e altri gruppi.

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