Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Questo protocollo ci permette di determinare se le varianti di missense nei geni umani collegate alle malattie influenzano la funzione proteica. Questo è difficile da realizzare computazalmente anche con algoritmi all'avanguardia. Questa tecnica consente una rapida analisi delle varianti di missense nelle proteine umane utilizzando un sistema in vivo Drosophila melanogaster che è più veloce ed efficiente in termini di costi rispetto agli organismi modello dei vertebrati.

Dimostrare che una variante specifica influisce sulla funzione proteica contribuisce direttamente alla diagnosi di malattie rare e funge da punto di partenza per l'analisi del meccanismo delle malattie e potenziali terapie. Questo protocollo è particolarmente utile quando si studiano varianti legate alle malattie rare, ma può essere applicato a malattie più comuni come l'autismo e il cancro. Identificare fenotipi riproducibili nelle mosche che riflettono la funzione proteica può essere impegnativo.

I fenotipi possono variare da un gene all'altro e possono essere sottili. Studi funzionali di varianti di proteine umane utilizzando Drosophila possono essere eseguiti sulla base di esperimenti di salvataggio o studi di sovraespressione. Prima di iniziare la procedura, raccogliere informazioni sul gene umano di interesse e sui suoi ortologi dell'organismo modello.

Per testare la funzione variante sovraesprimendo le proteine umane di riferimento e varianti nel sistema visivo fly, generare mosche transgeniche che esprimono riferimenti o varianti di cDNA umani di interesse sotto il controllo della sequenza di attivazione upstream Gal4 o del sistema UAS. Per selezionare una specifica linea Gal4 per esprimere le proteine umane in uno specifico tessuto di mosca, attraversare da tre a cinque femmine vergini dalla linea Gal4 con da tre a cinque maschi da ciascuna delle linee transgeniche della CDNA umana UAS in singole fiale o in duplicati. Trasferire le croci ogni due o tre giorni per ottenere il maggior numero possibile di animali che si racchiudono da una singola croce ed esaminare l'animale chiuso al microscopio a dissezione per identificare eventuali differenze tra i ceppi di riferimento e varianti.

Se c'è un difetto visibile, immagini le mosche per documentare i fenotipi. Per generare mosche per testare difetti funzionali nel sistema visivo, incrociare le femmine vergini dalla linea rodopsina 1 Gal4 ai maschi con transgeni cDNA umani UAS di riferimento o variante per esprimere le proteine umane di interesse nei fotorecettori da R1 a R6 nella retina di mosca. Una volta che le mosche iniziano a chiudersi, raccogliere la progenie in fiale fresche e riportare le fiale in un incubatore impostato alla temperatura sperimentale appropriata per altri tre giorni per consentire al sistema visivo di maturare.

Alla fine dell'incubazione, immobilizzare le mosche con un metodo di anestesia appropriato e incollare delicatamente un lato di ogni mosca su uno scivolo al microscopio di vetro. Dopo aver installato un impianto elettroretinogramma, posizionare un capillare di vetro di 1,2 millimetri in un estrattore di ago e rompere il tubo capillare per ottenere due elettrodi affusolata cavi affilati con diametri inferiori a 0,5 millimetri. Riempire i capillari con una soluzione salina da 100 millimolare facendo attenzione ad evitare bolle d'aria e far scorrere i capillari di vetro sugli elettrodi di filo d'argento.

Blocca i capillari in posizione e acclimata le mosche per completare l'oscurità per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'assunzione, posizionare lo scivolo contenente le mosche sull'apparecchio di registrazione e spostare i micromanipolatori che trasportano gli elettrodi di riferimento e di registrazione vicino alla mosca di interesse. Guardando la punta dell'elettrodo, posizionare con cura l'elettrodo di riferimento nel torace della mosca penetrando nella cuticola e posizionare l'elettrodo di registrazione sulla superficie dell'occhio.

Per registrazioni elettroretinografiche di successo, fare attenzione ad applicare una quantità appropriata di pressione all'elettrodo di registrazione in modo che causi una piccola fossette senza penetrare nell'occhio. Quando gli elettrodi sono stati posizionati, spegnere la luce primaria per tre minuti per riassociare le mosche all'ambiente buio. Al termine del periodo di ri-acclimatazione, aprire e chiudere l'otturatore una volta al secondo per 20 secondi registrando gli elettroretinogrammi da almeno 15 mosche per scorrimento per genotipo per condizione utilizzando gli stessi elettrodi.

Quando le registrazioni delle mosche di riferimento e variante sono complete, confrontare le registrazioni dell'elettroretinogramma dal riferimento, dalla variante e dai controlli per valutare le differenze. Quindi valutare i dati dell'elettroretinogramma per le variazioni nei transitori, la depolarizzazione, i transitori spenti e la ripolarizzazione. In questo esperimento rappresentativo, sono stati eseguiti studi basati sull'iperespressione per TBX2 poiché il riferimento umano TBX2 non è stato in grado di sostituire funzionalmente il gene della mosca ortologa rendendo impossibili le strategie basate sul salvataggio.

Quando il TBX2 umano di riferimento è stato sovraespresso nell'occhio in via di sviluppo e in parti del cervello utilizzando Gal4 senza occhi, l'iperespressione si traduce in una letalità di circa l'85% e in una significativa riduzione delle dimensioni degli occhi. Al contrario, la variante transgene è meno potente nel causare letalità e induce un piccolo fenotipo oculare usando lo stesso driver in condizioni sperimentali identiche suggerendo che la variante influisce sulla funzione proteica. Inoltre, quando un TBX2 umano di riferimento è sovraespresso nei fotorecettori usando rodopsina Gal4, la sovraespressione provoca un'alterazione significativa nella traccia dell'elettroretinogramma.

Questo fenotipo è più lieve quando la proteina variante è espressa fornendo ulteriori prove che la variante di interesse influisce sulla funzione proteica in vivo. È importante notare che ogni gene è unico, quindi non esiste un singolo esperimento in grado di valutare l'impatto di tutte le varianti associate alla malattia. Oltre a lavorare con i cDNA umani, si può anche determinare se la variante ha conseguenze funzionali introducendo varianti analoghe nei residui evolutivamente conservati del gene della mosca ortologa.

Utilizzando questo metodo, abbiamo contribuito a una serie di studi sulla scoperta di geni delle malattie umane in collaborazione con la rete di malattie non diagnosticate e altri gruppi.