Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l'iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.

Il melanoma è ampiamente diagnosticato in tutto il mondo, con una crescente incidenza. Questi protocolli consentono di controllare attentamente le prime fasi dell'iniziazione del melanoma, facilitando lo studio del suo sviluppo. Controllando il tempo e la posizione dell'attivazione delle cellule staminali melanociti, abbiamo la capacità di discernere i cambiamenti all'interno della popolazione di cellule staminali e il suo nuovo ceppo di iniziazione al melanoma.

A dimostrare la procedura saranno Dahihm Kim e Luye An, studenti laureati del laboratorio. Due o tre giorni prima di iniziare la procedura, utilizzare un trimmer elettrico per radere la pelle dorsale da ogni topo anestetizzato di sette settimane. Il giorno dell'esperimento, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare un sottile strato di crema depilatoria sulla pelle esposta.

Una volta che la crema è stata applicata uniformemente, utilizzare tamponi di cotone puliti per rimuovere la crema, seguiti da una pulizia delicata con un panno umido per rimuovere qualsiasi crema residua. Quindi riportare ogni topo nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per l'irradiazione UV-B, coprire la pelle dorsale con materiale protettivo UV-B in modo che venga esposta solo la regione desiderata e coprire la camera UV con un coperchio resistente ai raggi UV.

Quindi accendere la lampada UV-B per irradiare il mouse per l'appropriato periodo di tempo sperimentale prima di riportare il mouse in una gabbia vuota con monitoraggio fino al completo recupero. Per isolare i campioni della pelle, utilizzare un trimmer elettrico per rimuovere eventuali capelli dall'area della pelle dorsale dei topi irradiati eutanasiati e spazzolare leggermente la pelle esposta con un tessuto privo di pelucchi per liberare l'area. Fai una piccola incisione con forbici affilate appena sopra la base della coda e inserisci grandi forbici smussate nell'incisione per separare i tessuti connettivi subdermici.

Utilizzando forbici affilate, tagliare con cura lungo il bordo della regione della pelle di interesse per isolare il campione di tessuto e posizionare il tessuto cutaneo asportato su un tovagliolo di carta pulito. Quindi utilizzare le forcep opache per allungare la pelle in modo che aderisca all'asciugamano ed è tesa. Una volta raccolti tutti i campioni, posizionare un campione di pelle e un tovagliolo di carta che si appoggiano in un pezzo di carta da filtro piegata immediatamente adiacente alla piega, facendo attenzione che il campione sia liscio e non piegato o accartocciato.

Chiudere i lati della carta da filtro con graffette e tagliare la carta. Quindi immergere completamente i campioni in formalina tamponata al 10% neutra per tre o cinque ore a temperatura ambiente prima di lavare i tessuti con due lavaggi di cinque minuti in acqua deionizzata. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con cura qualsiasi materiale residuo dai tessuti della pelle e tagliare i bordi dei campioni in modo che non siano frastagliati.

Successivamente, effettuare tre tagli sagittali in ogni campione in modo che la larghezza delle strisce non sia superiore a cinque millimetri e fare tagli trasversali in modo che i campioni non siano larghi più di 20 millimetri. Posizionare uno stampo crio contenente temperatura di taglio ottimale o mezzo OCT con orientamento verticale e posizionare da quattro a cinque pezzi di pelle sopra lo Strumento di personalizzazione di Office. Quando tutti i pezzi sono in posizione, utilizzare due paia di forcep fini per portare il bordo lungo di ogni pezzo di pelle sul fondo dello stampo criogenico in modo che i campioni siano verticali all'interno dello STRUMENTO di personalizzazione di Office e perpendicolari alla base dello stampo.

Quindi riempire lo stampo con OCT aggiuntivo al secondo labbro e posizionare lo stampo su una superficie piana di un pezzo di ghiaccio secco, utilizzando le forcep per regolare eventuali pezzi di pelle che potrebbero aver spostato durante il trasferimento quando il blocco inizia a congelarsi se necessario. Quando i topi sono sette settimane post-natale, la loro pelle dorsale è in telogen. Durante il telogeno, il follicolo pilifero e le cellule staminali melanociti sono noti per essere in uno stato di riposo quiescente e la pelle non dovrebbe mostrare una crescita significativa dei capelli dopo la rasatura.

La depilazione chimica, tuttavia, può indurre l'attivazione delle cellule staminali del follicolo pilifero, inducendo una significativa crescita dei capelli all'interno della regione di interesse. Poiché la depilazione chimica può indurre significativamente l'attivazione sia del follicolo pilifero che delle cellule staminali melanociti, le cellule staminali melanociti soggette a melanoma in uno stato attivo possono formare tumori e l'iniziazione microscopica del melanoma può essere osservata entro due settimane dalla depilazione chimica. L'irradiazione UV-B può anche indurre l'iniziazione tumorale da cellule staminali melanociti quiescenti e soggette a tumore.

È importante sottolineare che UV-B induce la traslocazione diretta delle cellule staminali melanociti dalla loro nicchia di cellule staminali follicolari all'epidermide inter-follicolare. Inoltre, UV-B può indurre la formazione di melanociti di melanociti che originano il melanoma cutaneo in tutta l'epidermide interfollicolare. Simile alla pelle dorsale, l'iniziazione del melanoma indotta da UV-B può essere osservata in particolare in altre aree della pelle, come la pelle dell'orecchio.

Infatti, rispetto al controllo della pelle dell'orecchio, coperto da un panno resistente ai raggi UV, la pelle dell'orecchio esposta a UV-B dimostra una maggiore pigmentazione a causa di un maggiore carico di iniziazione al melanoma. Diverse dosi di UV-B possono avere effetti diversi sulla pelle del topo e sull'attività dei melanociti. Pertanto, è importante determinare e ottimizzare la dose di irradiazione prima di iniziare l'esperimento.