Name: Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Impara un metodo enzimatico efficace per isolare cellule endoteliali aortiche primarie da suini in miniatura. Questa tecnica consente di ottenere pAECs con oltre il 97% di purezza per studiare risposte immunitarie e coagulative nella xenotrapianto.

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Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation della provincia del Guangdong, numero di sovvenzione/premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJ-201703141713575556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ2016042814204444545455 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: 2017013; National Key R&D Program of China, Numero Grant/Award: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Numero di sovvenzione/premio: S201412020; Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong (2019); Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen, numero di sovvenzione/premio: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number : S'XJ2017021 e S-XJ2018059. Ringraziamo Hancheng 'hang e 'hicheng 'ou dell'Università di Shenzhen per aver assistito nella preparazione del manoscritto.

L'uso degli animali è stato approvato dal Comitato di revisione etica dell'Ospedale del Secondo Popolo di Shenzhen, in conformità con i principi del benessere degli animali.
1. Preparazione di animali, medie e tamponi
<ol><li>Preparare il maiale in miniatura. NOTA: Tutti i maiali in miniatura erano maiali cinesi Wuzhishan o Bama (maschio). L'età e il peso dei suini erano rispettivamente di 100 giorni , 8 giorni e 5,7 kg , 1,0 kg (media , SD, n - 3).</li>
	<li>Preparare il mezzo di coltura: mezzo di cellule endoteliali (ECM) integrato con 10% (v/v) siero bovino fetale inattivato (FBS), 1% (v/v) penicillina / streptomicina (P/S) e 1% (v/v) di crescita del supplemento di cellule endoteliali (ECGS).</li>
	<li>Preparare il buffer di lavaggio: 1x soluzione PBS (pH 7.4) con 1% (v/v) P/S.</li>
	<li>Preparare una soluzione digestiva 0.005% collagenae IV: 1 mg di polvere di collagenae IV in 20 mL di soluzione PBS. Preriscaldare la soluzione digestiva di collagena a 37 gradi centigradi prima della digestione.</li>
	<li>Preparare il buffer di arresto: il mezzo di Ala (DMEM) modificato di Dulbecco integrato con FBS inattivati per il 10% e 1% di P/S.</li>
</ol>2. Chirurgia e preparazione per l'isolamento delle cellule endoteliali dei porci
<ol><li>Disinfettare la sala operatoria con luce UV per 1 h e il liquido medico 84 (il contenuto di cloro disponibile è del 4,0% - 5,0%, tabella dei materiali) prima di eseguire un intervento chirurgico.</li>
	<li>Dopo che il maiale in miniatura ha ricevuto un'iniezione intramuscolare formata da 15 mg/kg di Ketamina, 15 mg/kg di cloruro di Xylazine e 0,05 mg/kg di idrocloruro di Fenacetin( Volumi: 100L/kg, Tabella dei materiali) ( Figura 1A ), confermano l'animale di idrocloruro( Volumi: 100L/kg, Tabella dei materiali ) ( Figura1A), confermano l'animale stato di anestesia con controllo dello stimolo doloroso porcina (ad esempio pizzicare un orecchio o scuotere un anteriore) e indice fisiologico (ad esempio pressione sanguigna, frequenza cardiaca e respiratoria). NOTA: Un'altra iniezione di mezza dose potrebbe essere somministrata al maiale se mostra i segni di risveglio.</li>
	<li>Tagliare l'addome con un bisturi, esporre la vena cava inferiore e di conseguenza iniettare eparina sodio (5.000 U, tavolo dei materiali) nella vena cava inferiore con siringa da 5 mL.</li>
	<li>Cinque minuti dopo, inserire un catetere nell'aorta addominale per sangue, tagliare la pelle del torace e incitare il diaframma con un bisturi e successivamente tagliare il ventricolo sinistro. NOTA: Assicurarsi che il maiale sia eutanasia controllando l'impulso aortico dopo aver insanguinato e tagliato il cuore.</li>
	<li>Accisa le costole con pinze ossee (Tabella dei materiali), ed espongono il cuore e i polmoni. Trova l'aorta posteriore al cuore e ai polmoni e blocca le due estremità. Lavare l'aorta una volta con tampone di lavaggio pre-raffreddato (Figura 1B,C).</li>
	<li>Tagliare l'aorta con le forbici e tenere l'aorta bloccata ad ogni estremità. Accise tessuto in eccesso intorno all'aorta con pinze sterili e forbici. Mettere l'aorta in un tubo di centrifuga di 50 mL, lavare l'aorta con tampone di lavaggio pre-raffreddato 3x (30 mL per lavaggio) e trasferire l'aorta al laboratorio (Figura 1D).</li>
</ol>3. Isolamento delle cellule endoteliali aortiche porcine
<ol><li>In condizioni asettiche, togliere l'aorta di maiale dal buffer di lavaggio e posizionarlo su un piatto Petri da 150 mm (Figura 2A).</li>
	<li>Tagliare delicatamente le due estremità dell'aorta e le accise in eccesso di tessuto intorno all'aorta con pinze sterili e forbici di nuovo (Figura 2B). Lavare l'esterno e l'interno dell'aorta (sopra il piatto di coltura a temperatura ambiente) con 20-50 mL di tampone di lavaggio. NOTA: Cercare di tagliare solo l'area in cui sono stati posizionati i morsetti durante l'intervento chirurgico poiché alcune EC sono state danneggiate in questa zona e rimuovere i tessuti in eccesso e i rami laterali arteriosi.</li>
	<li>Passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e poi legare un'estremità dell'aorta utilizzando la sutura chirurgica (5-0, 90cm, Tabella dei materiali). Mantenere la sutura chirurgica all'interno dell'aorta (Figura 2C,D).</li>
	<li>Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con pinze, quindi tirare lentamente la sutura chirurgica per invertire l'aorta fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta è esposta (Figura 2E-G). NOTA: Assicurarsi di fissare l'aorta vicino all'estremità legata e non fissare l'aorta ermeticamente, altrimenti l'aorta non può essere invertita tirando la sutura chirurgica.</li>
	<li>Lavare la superficie endoteliale dell'aorta con il tampone di lavaggio 3x (10 mL per lavaggio), quindi scartare questa soluzione. Mettere l'aorta in un tubo di centrifuga di 15 mL e coprire l'aorta con 10 mL di 0,005% soluzione digestiva collagenae IV nel tubo (Figura 2H). NOTA: Preriscaldare la soluzione digestiva di collagenasi IV dello 0,005% a 37 gradi centigradi prima della digestione.</li>
	<li>Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. Mettere l'aorta digerita e la soluzione digestiva in un piatto di coltura di 100 mm e fermare gli effetti di 0,005% collagenasi IV con l'aggiunta di 10-15 mL di cuscinetto di arresto pre-raffreddato. NOTA: il tempo di digestione consigliato è compreso tra 10 e 20 minuti. Assicurarsi che la superficie endoteliale dell'aorta sia coperta dal buffer di arresto.</li>
	<li>Raschiare delicatamente i pAEC dalla superficie interna dell'aorta utilizzando un raschietto cellulare (Figura 2I). Lavare l'aorta raschiata 3x con tampone di lavaggio (5 mL per volta). Mettere la soluzione dal piatto di coltura in un tubo di centrifuga 50 mL. Lavare il fondo della coltura piatto 2x con tampone di lavaggio (5 mL per volta), e mettere la soluzione in un tubo di centrifugazione 50 mL di nuovo. NOTA: Raschiare in una direzione delicatamente e non comprimere. Non toccare il tessuto vicino ai bordi e ai fori. Si raccomanda un raschio da 5-8x.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 600 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e lasciare 10 mL di soluzione sul fondo di un tubo di centrifuga 50 mL. Aggiungere 20 mL di buffer di lavaggio al tubo centrifuga da 50 mL e sospendere nuovamente i pellet. Evitare le bolle durante questa fase.</li>
	<li>Centrifuga a 600 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Scarta lentamente il super-natante. Risospendere i pellet cellulari con 1 mL di mezzo di coltura e mescolare bene. NOTA: Il numero medio di EC per cm aorta è 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (media : SD, n - 3).</li>
	<li>Contare le celle con un contatore di celle. Piastra e coltura le cellule in un vaso senza rivestimento di alcun materiale in base al numero di cellulare. Se il numero di cella è minore o uguale a 1,0 x 106, le celle di coltura in un pallone da 25 cm2. Se il numero di cella è maggiore di 1,0 x 106, le cellule di coltura in diversi flaconi 25 cm2 (1,0 x 106 celle per fiaschetta). Posizionare il pallone in un'incubatrice (senza agitare) a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e sostituire il mezzo ogni 2/3 giorni. NOTA: Alcune celle sono danneggiate dal raschiatore cellulare. Un saggio di fattibilità cellulare ha rilevato che la percentuale di cellule vive è del 95,7% : 1,7% (media : SD, n - 3). Il tempo di raddoppio delle cellule isolate è di circa 1/2 giorni.</li>
</ol>4. Raccolto e caratterizzazione delle cellule endoteliali pure
<ol><li>Lascia che le cellule crescano per circa 4/5 giorni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza (Figura 3A), digerire le cellule con 0,25% trypsin e passare le cellule. Quindi, raccogliere alcune delle cellule isolate (Giorno 3, Passaggio 1 e Passaggio 2) e identificare dalla citometria di flusso (con un anticorpo anti-CD31).</li>
	<li>Etichetta pAEC isolati (numero di cellule: 1 x 105) (Giorno 3, Passaggio 1 e Passaggio 2) con anticorpo coniugale anti-porcina anti-porcina a 4 gradi centigradi per l'analisi della citometria di flusso.</li>
	<li>Cancello popolazione totale di cellule vive con un terreno sparso in avanti, campione incontaminato come controllo negativo. Poi presenta le cellule positive CD31 delle cellule gated con istogramma. NOTA: l'efficacia delle cellule CD31-positive è del 97,4% , pari rispettivamente all'1,2% (giorno 3), al 94,4% (P1) e al92,4% (P2) (media - SD).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le cellule endoteliali sono comunemente utilizzate nella ricerca di disfunzione vascolare, diabete, rigenerazione tissutale, trapianto e cancro14,15,16,17,18. Per comprendere e caratterizzare la biologia e la funzione delle EC in queste malattie, sono stati riportati numerosi metodi per isolare le EC di diversi organi o tessuti malati8<...

La carenza di organi disponibili per i trapianti è un problema eccezionale in tutto il mondo1. Secondo la Croce Rossa della Cina, solo un piccolo numero di pazienti con insufficienza di organi allo stadio finale ha ricevuto un organo adatto in Cina nel 2018.
Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere il problema della carenza di organi. Gli organi di maiale sono considerati gli organi più adatti per gli esseri umani a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche2,3. Il fallimento di un xenotrapianto di suino è in gran parte legato al rigetto immunitario dei primati e alle risposte di coagulazione. Le cellule endoteliali dei porcini (EC) sono fondamentali poiché queste cellule sono le prime a interagire con il sistema immunitario dei primati, che include anticorpi, complementi, citochine e cellule immunitarie (ad esempio, cellule T, cellule B e macrofagi)4,5. Le EC suine svolgono un ruolo vitale nell'organodi maiale e nello xenotrapianto 6,7. Pertanto, le EC sono cellule importanti per studiare le risposte di rigetto e coagulazione a un innesto di suini. L'isolamento delle EC su suini di alta qualità è necessario per la ricerca sugli xenotrapianto.
Nel tentativo di isolare le EC da diversi organi (ad esempio, cuore, rene, fegato e aorta), diversi protocolli sono stati segnalati in un'impostazione xenotrapianto8,9,10,11,12. Tuttavia, mantenere una cultura ultrapura dei EC isolati è un problema eccezionale nei protocolli standard. L'aumento della concentrazione della soluzione digerita, il tempo di digestione inappropriato e l'intensità dei graffi possono contribuire all'aumento della contaminazione del fibroblasto negli studi attuali8,10,13. Inoltre, il metodo dei pAEC isolati dai maiali in miniatura è meno studiato. Qui, descriviamo un metodo enzimatico ottimizzato per isolare i pAEC altamente purificati dai maiali in miniatura (Wuzhishan o Bama). Diversi passaggi del protocollo sono stati progettati per ridurre la contaminazione da fibroblasti e ottenere EC ad alta purezza.

<table><tbody><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boneforceps</td><td>Pechino HeLi KeChuang Technology Development CO., Ltd. Cina</td><td>HL-YGQ&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SIRINGA monouso BOON (10ml)</td><td>Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1746F</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3010 #</td><td></td></tr> <tr><td>Collagenasi IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138 # -1G</td><td></td></tr><tr><td>Composto ketamina iniezione &nbsp;</td><td>Fabbrica farmaceutica veterinaria di Shenyang, Cina</td><td></td><td>ketamina cloridrato?0,3 g / 2 ml, xilazina cloridrato: 0,3 g / 2 ml, fenacetina cloridrato? 1 mg / 2 ml</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo, dicloridrato)</td> <td>Life Technologies</td><td>D1306 #</td><td></td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965118 #</td><td></td></tr> <tr><td>ECM</td><td>Sciencell</td><td>1001 #</td><td></td></tr> <tr><td>ECGS</td><td>Sciencell</td><td>1052#</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microprovetta con tappo a scatto (1,5 ml)&nbsp;</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C #</td><td></td></tr> <tr><td>Falcon 100mm Piatto per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>353003 #</td><td></td></tr> <tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GIBCO</td><td>10270-106 #</td><td></td></tr> <tr><td>Flowjo v10.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincipe</td><td>ShangHai medical instruments Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>Jiangsu WanBang biofarmaceutica Co., Ltd.Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tintura di iodio</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maiale in miniatura (Bama o Wuzhishan)</td><td>Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Mshot...</td>Fornitore verificato - <td>Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>Piastre di Petri <td>M152</td><td></td></tr><tr><td>(150 x 15 mm)</td><td>Biologixgroup</td><td>66-1515#</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063#</td><td></td></tr><tr><td>Pallone rettangolare per colture cellulari a collo inclinato con tappo di sfiato ? T25?</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3289 #</td><td></td></tr> <tr><td>Forbici</td><td>ShangHai strumenti medici Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento sierologico (10 ml)</td> <td>JET Biofil</td><td>GSP010010#&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sterile Pasteur</td><td>GeneBrick</td><td>GY0025 #</td><td></td></tr> <tr><td>Filtro siringa sterile (0,22 & micro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS#</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi chirurgico</td><td>ShangHai medical instruments Co., Ltd.China</td><td>22#</td><td></td></tr><tr><td>Sutura chirurgica</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>5-0#</td><td></td></tr><tr><td>Siringa?5mL?</td><td>Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), fenolo rosso</td><td>GIBCO</td><td>25200056#</td><td></td></tr><tr><td>75% Alcool medico</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 x PBS soluzione (pH 7,4, senza nucleasi)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B540627#</td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante medico 84 liquido</td><td>Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td><td>450ml/bottiglia</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere la carenza di organi umani per i pazienti con insufficienza d'organo allo stadio finale, e il maiale è considerato una fonte di organo adatta. Il rigetto immunitario e la coagulazione sono due ostacoli principali per il successo dello xenotrapianto. Le lesioni e disfunzioni delle cellule endoteliali (EC) sono importanti per lo sviluppo delle risposte di infiammazione e coagulazione nello xenotrapianto. Pertanto, l'isolamento delle cellule endoteliali aortiniche porcine (pAEC) è necessario per studiare il rigetto immunitario e le risposte di coagulazione. Qui, abbiamo sviluppato un semplice approccio enzimatico per l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione di pAEC altamente purificati da maiali in miniatura. In primo luogo, il maiale in miniatura è stato anestetizzato con chetamina, e una lunghezza di aorta è stata assortata. In secondo luogo, la superficie endoteliale dell'aorta è stata esposta allo 0,005% di collagenasi IV digestiva per 15 min. Terzo, la superficie endoteliale dell'aorta è stata raschiata in una sola direzione con un raschietto cellulare (<10 volte), e non è stata compressa durante il processo di Raschiare. Infine, i pAEC isolati del terzo giorno e dopo il passaggio 1 e il passaggio 2 sono stati identificati dalla citometria di flusso con un anticorpo anti-CD31. Le percentuali di cellule CD31-positive erano rispettivamente del 97,4% , 1,2%, 94,4% , 1,1% e 92,4% - 1,7% (media - SD). La concentrazione di Collagenasi IV, il tempo digestivo, la direzione e la frequenza e l'intensità della raschiatura sono fondamentali per ridurre la contaminazione fibroblasta e ottenere un'elevata purezza e un gran numero di EC. In conclusione, il nostro metodo enzimatico è un metodo altamente effctivo per isolare gli EC dall'aorta di maiale in miniatura, e le cellule possono essere espanse in vitro per studiare le risposte immunitarie e di coagulazione nello xenotrapianto.

Il nostro metodo mira a fornire un modo efficace per isolare le EC altamente purificate dalle aorte dai maiali in miniatura. Il processo di chirurgia dell'aorta è illustrato nella figura 1. Il primo passo è che l'intera aorta viene espulsa dal maiale. Prevenire altre cellule o contaminazioni batteriche è molto importante. Pertanto, non ferire altri organi o tessuti nel caso in cui cellule o batteri non bersaglio contaminano l'aorta e lavano l'aorta con buffer di lavaggio pre-raffreddato 3x (...

Viene descritto un metodo enzimatico efficace per l'isolamento delle cellule endoteliali sui porcili primari (pAEC) dai suini in miniatura. I pAEC primari isolati possono essere utilizzati per studiare la risposta immunitaria e di coagulazione nello xenotrapianto.

Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Il metodo è un metodo altamente efficace per isolare le cellule endoteliali dal maiale in miniatura. E anche le cellule possono essere espanse, indagare la risposta immunitaria e coagulazione nello xenotrapianto. Il principale vantaggio della tecnica è che non è solo facile, altamente efficace isolare le cellule di endotelio altamente purificate dal maiale, ma anche meglio per mantenere altri pAEC quando vengono passaggi.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del dolore nel maiale anestetizzato, lavare la parete addominale suina tre volte con il 75% di alcol medico e una tintura di iodio. Dopo l'ultimo lavaggio, usa un bisturi per fare un'incisione addominale per esporre la vena cava inferiore e usa una siringa da cinque millilitri per iniettare 5000 unità di sodio eparina nella vena cava inferiore. Dopo cinque minuti, inserire un catetere nell'aorta addominale e utilizzare un bisturi per incidere il diaframma.Con l'aiuto di un secondo investigatore, rimuovere il ventricolo sinistro e usare le forze ossee per asportare le costole per esporre il cuore e i polmoni. Individuare l'aorta posteriore al cuore e ai polmoni e bloccare le estremità. Usa le forbici per asportare l'aorta e lavala una volta con un tampone di lavaggio pre-raffreddato.Rimuovere il tessuto in eccesso intorno all'aorta con forcelle e forbici sterili e posizionare il recipiente in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente tampone di lavaggio fresco pre-raffreddato per il trasferimento in laboratorio. Per l'isolamento delle cellule endoteliali aortiche suine, trasferire l'aorta suina in una piastra di Petri di 150 millimetri in condizioni asettiche e rimuovere delicatamente entrambe le estremità del vaso. Tagliare qualsiasi tessuto in eccesso aggiuntivo in cui il recipiente era stato bloccato, con pinze e forbici sterili, e utilizzare da 20 a 50 millilitri di tampone di lavaggio fresco per risciacquare l'esterno e l'interno dell'aorta.Successivamente, passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e legare liberamente un'estremità del vaso, mantenendo la sutura all'interno del lume. Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con le forcep e quindi tirare lentamente la sutura chirurgica, per invertire l'aorta, fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta è esposta. Lavare la superficie endoteliale dell'aorta tre volte con 10 millilitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio e posizionare l'aorta in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Coprire il campione con 10 millilitri di 37 gradi Celsius riscaldati 0,005%collagenasi IV soluzione digestiva e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, trasferire l'intero contenuto del tubo in un piatto di coltura da 100 millimetri e arrestare la digestione con da 10 a 15 millilitri di tampone di arresto pre-raffreddato. Utilizzando un raschietto cellulare, rimuovere delicatamente le cellule endoteliali aortiche dalla superficie interna del vaso e lavare il vaso tre volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e lavare il fondo del piatto di coltura due volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio fresco, per lavaggio, tirando i lavaggi nel tubo da 50 millilitri. Raccogliere le cellule per centrifugazione e scartare tutti tranne gli ultimi 10 millilitri di supernatante. Aggiungere 20 millilitri di tampone di lavaggio per rimospendare il pellet, facendo attenzione a evitare bolle e raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione.Rimostrare il pellet in un millilitro di mezzo di coltura cellulare per il conteggio e placcare le cellule a una volta per dieci alle sei cellule per 25 centimetri di concentrazione quadrata di pallone. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, rinfrescando il mezzo ogni due o tre giorni. Dopo l'isolamento, le cellule endoteliali vengono ispezionate il giorno zero, uno e due, e dopo i passaggi uno e due per la contaminazione e la loro valutazione morfologica.L'analisi citometrica del flusso utilizzando un anticorpo anti-CD31-FITC indica una popolazione positiva tipicamente superiore al 97% del marcatore cellulare endoteliale il terzo giorno di coltura, che viene mantenuta a una purezza superiore al 90% anche dopo due passaggi. La superficie endoteliale dell'aorta è stata raschiata in una sola direzione, con un raschietto cellulare, per meno di 10 volte, e non è stata compressa durante il processo di raschiatura. La migliore risposta, metodo ottimizzato di isolamento dei PAEC, possiamo utilizzare pAEC purificati per eseguire singoli esperimenti e indagare il rifiuto immunitario e la risposta alla coagulazione nello xenotrapianto.

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Biologia

Forniamo un metodo per isolare e popolazioni coltura pura di cellule endoteliali valvola cardiaca (VEC). VEC può essere isolato da entrambi i lati della cuspide o depliant e subito dopo, alla base di cellule interstiziali (VIC) isolamento è semplice.

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Isolamento dell'aorta suina: una procedura chirurgica per asportare l'aorta toracica da maiali in miniatura per l'analisi a valle

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule endoteliali dall'aorta addominale di un modello di maiale utilizzando la digestione della collagenasi in un solo passaggio. Le cellule endoteliali possono essere coltivate per ulteriori applicazioni a valle.

Isolamento delle cellule endoteliali aortiche suine (pAEC): un metodo basato su enzimi per isolare le cellule endoteliali dall'aorta addominale suina raccolta

La capacità di isolare le cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) è fondamentale per comprendere i meccanismi di sviluppo, mantenimento e malattia delle valvole.  Qui descriviamo l'isolamento di VEC da topi Tie2-GFP embrionali e adulti utilizzando FACS che consentiranno studi che determineranno il contributo dei VEC nei processi di sviluppo e malattia.

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Le cellule endoteliali vascolari svolgono un ruolo significativo in molti importanti disturbi cardiovascolari. Questo articolo descrive un metodo semplice per isolare ed espandere le cellule endoteliali dall'aorta del topo senza l'uso di attrezzature speciali. Il nostro protocollo fornisce un mezzo efficace per identificare i meccanismi nella fisiopatologia delle cellule endoteliali.

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Sono necessari nuovi metodi di isolamento delle cellule endoteliali primarie dai vasi sanguigni. Questo protocollo descrive una nuova tecnica che inverte completamente i vasi sanguigni di interesse, esponendo solo il lato endoteliale alla digestione enzimatica. La coltura di cellule endoteliali pure risultante può essere utilizzata per studiare le malattie cardiovascolari, la modellizzazione delle malattie e l'angiogenesi.

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Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

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Questo protocollo descrive la raccolta di valvole aortiche umane estratte durante le procedure chirurgiche di sostituzione della valvola aortica o dal tessuto cadaverico e il successivo isolamento, espansione e caratterizzazione delle cellule endoteliali e interstiziali della valvola primaria specifiche del paziente. Sono inclusi importanti dettagli riguardanti i processi necessari per garantire la vitalità cellulare e la specificità fenotipica.

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