Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Questo protocollo è particolarmente rilevante perché consente il rilevamento e la selezione di singole celle da un pool di celle miste per la successiva analisi downstream a una singola risoluzione di cella. Il principale vantaggio di questa tecnica è il potenziale per separare le singole cellule tumorali circolanti, o CTC, dalle cellule del sangue per una serie di analisi che richiedono un'elevata purezza. Inizia avviando il software del micromanipolatore e accendendo il micromanipolatore.

Collegare il micromanipolatore al computer e fare clic su Connetti e inizializza dispositivo per inizializzare il braccio robotico nella fase del microscopio. Pulire le superfici esterne ed interne dell'armadio protettivo con etanolo e chiudere l'armadio protettivo dopo ogni manipolazione della macchina per poter manovrare il dispositivo attraverso il computer. Installare un nuovo capillare di vetro da 20 a 30 micrometri sul braccio robotico e l'olio del sistema di lavaggio attraverso il sistema per rimuovere eventuali bolle nei tubi.

Riempire il serbatoio di sterilizzazione uno con il 70% di etanolo, il serbatoio di sterilizzazione due con acqua sterile priva di nucleasi e il serbatoio tampone con PBS sterile di Dulbecco. Sterilizzare il capillare due volte con il 70%etanolo e sostituire il serbatoio di sterilizzazione uno con serbatoio di sterilizzazione due per utilizzare la funzione di sterilizzazione per lavare il capillare in acqua almeno tre volte. Nel software di micromanipolatore, avviare un nuovo esperimento e selezionare il tipo di esperimento di prelievo dalle modalità di selezione automatica e manuale.

Configurare il vassoio del ponte per specificare le posizioni del serbatoio di sterilizzazione, del serbatoio tampone e del vassoio di deposito e impostare la temperatura dei serbatoi liquidi nel vassoio di deposito selezionato su quattro gradi Celsius. Posizionare una piastra di fissaggio ultra-bassa contenente la soluzione CTC rilasciata al microscopio all'interno dell'armadio del micromanipolatore. Rimuovere il coperchio dalla piastra e chiudere l'armadio.

Centrifugare una piastra di 384 poggia-porri contenente 20 microlitri di mezzo di coltura CTC per pozzo per garantire che il mezzo sia sequestrato nella parte inferiore di ogni pozzo e posizionare la piastra nel bersaglio di una posizione del vassoio di deposito selezionato di quattro gradi Celsius. Selezionare manualmente l'obiettivo del microscopio per il prelievo e il tempo di esposizione di tutti i canali necessari. Selezionate Mostra navigatore pozzo (Show Well Navigator) per visualizzare e selezionare il tipo di piastra di prelievo.

Quindi calibrare una posizione di prelievo al centro del pozzo contenente la soluzione CTC senza celle al centro del campo visivo. Utilizzare il sensore per toccare delicatamente il fondo della piastra con un capillare e impostare la posizione di prelievo su 0,05 millimetri sopra il fondo della piastra. Abbassare con cura il braccio robotico di 10 micrometri alla volta per evitare di danneggiare il capillare.

Selezionare il tipo di cella e i parametri di prelievo. Per il prelievo a cella singola, selezionare la modalità manuale. Utilizzare il joystick per navigare nel capillare di vetro all'interno del pozzo e posizionare il capillare sopra una singola cella di interesse ad almeno un millimetro dal bordo del pozzo.

Quindi aggiungere manualmente particelle e selezionare Scegli particelle attivate per avviare il prelievo. Quando tutte le cellule sono state raccolte, centrifugare la piastra per sedimentare le cellule nella parte inferiore di ogni pozzo. La colorazione bio-ammino con anticorpo della molecola di adesione delle cellule anti-epiteliali consente la visualizzazione delle cellule tumorali nella sospensione con un'accurata distinzione dagli eventi positivi cd45.

Un preciso isolamento CTC è caratterizzato dall'aspirazione solo del bersaglio desiderato senza le cellule contaminanti circostanti. Come sospettato, i cluster CTC dimostrano un aumento della sopravvivenza rispetto ai singoli CTC, dando origine a colonie cellulari entro 56 giorni dalla coltura in vitro. In particolare, i cluster CTC mostrano anche un tasso di proliferazione più elevato e quindi raggiungono numeri di cellule finali più elevati, indicando che il contatto diretto con altre cellule tumorali ha un impatto sia sulla vitalità delle cellule tumorali che sul tasso di proliferazione.

Il sequenziamento dell'RNA a cellule singole dei CTC direttamente isolati dai pazienti con cancro al seno rivela un vicino stocastico distribuito a T che incorpora singole cellule derivate da singoli CTC, cluster CTC o cluster di globuli bianchi CTC. Ricordarsi di installare il capillare di vetro per rimuovere le bolle d'aria all'interno del sistema fluidico del micromanipolatore e calibrare la posizione di prelievo per garantire un efficiente prelievo a cella singola. Le singole celle possono essere sementi o ulteriormente elaborate per il sequenziamento di nuova generazione per consentire l'analisi ex-vivo e la caratterizzazione CTC a una risoluzione a singola cella per indagare il processo metastatico.