Name: Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per unidentificazione efficiente dellRNA legato alle proteine nei testis del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Scopri il metodo eCLIP per identificare gli RNA legati alle proteine nei testis del topo. Questo protocollo non radioattivo offre elevata specificità del segnale per studiare la regolazione post-trascrizionale durante la spermatogenesi.

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Ringraziamo Eric L Van Nostrand e gene W Yeo per una guida utile con il protocollo originale. K.Z. è stato supportato da National Key R & D programma della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31771653). L.Y. è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81471502, 31871503) e dal programma innovativo e imprenditoriale della provincia di Jiangsu.

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<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS20,32,33, 34,35. Il protocollo qui descritto rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.
Una sfida ne...

Il testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell'emergere dell'inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l'inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi3. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale, in cui le proteine leganti l'RNA (RBPs) svolgono un ruolo cruciale, modellando il trascrittoma e mantenendo la fertilità maschile.
Per identificare gli obiettivi di RNA in buona fede di un singolo RBP in vivo, è stato sviluppato il metodo reticolazione immunoprecipitazione (clip)4,5, basato ma oltre l'immunoprecipitazione dell'RNA regolare (RIP)6,7 , per incorporazione di passaggi chiave tra cui cross-linking ultravioletti (UV), lavaggio rigoroso e trasferimento di gel per migliorare la specificità del segnale. L'applicazione avanzata della CLIP combinata con il sequenziamento ad alto rendimento ha suscitato grande interesse nella profilazione dell'interazione proteina-RNA a livelli di genoma8. Oltre agli studi genetici sulla funzione RBP, tali metodi biochimici che identificano l'interazione diretta di proteina e RNA endogeni sono stati indispensabili per chiarire accuratamente i ruoli normativi dell'RNA nei RPB. Ad esempio, MOV10L1 è una elicasi di RNA specifica per i testicoli necessaria per la fertilità maschile e la biogenesi9dell'RNA che interagisce con PIWI (Pirna). Il suo paralogo MOV10 è conosciuto come un onnipresente e multifunzionale RNA elicasi con ruoli in molteplici aspetti della biologia dell'RNA10,11,12,13,14 , 15 anni di , 16 anni di , 17 anni di , 18. impiegando le clip-Seq convenzionali, abbiamo scoperto che MOV10L1 lega e regola i precursori Pirna primari per avviare l'elaborazione iniziale di Pirna19,20, e che MOV10 lega le UTR di mRNA 3' e così come RNA non codificante specie nelle cellule germinate testicolari (dati non mostrati).
Tuttavia, CLIP è in origine una laboriosa, procedura radioattiva seguita da sequenza di preparazione della libreria con una notevole perdita di tag CLIP. Nella CLIP convenzionale, una libreria cDNA viene preparata utilizzando adattatori ligati ad entrambe le estremità dell'RNA. Dopo la digestione delle proteine, i polipeptidi corti reticolati restano attaccati ai frammenti di RNA. Questo segno di reticolazione blocca parzialmente la progressione della trascrittasi inversa (RTase) durante la sintesi di cDNA, risultando in cDNA troncati che rappresentano circa il 80% della libreria cDNA21,22. Pertanto, vengono sequenziati solo i frammenti cDNA risultanti da RTase che bypassano il sito di reticolazione (read-through). Recentemente, diversi approcci di CLIP, come PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, sono stati impiegati per identificare i siti Crosslink di RBPs nelle cellule viventi. PAR-CLIP prevede l'applicazione di 365 nm di radiazione UV e analoghi nucleotidici fotoattivabili ed è quindi esclusivo per le cellule viventi in-coltura, e l'incorporazione di analoghi nucleosidici in trascrizioni di nuova sintesi è incline a produrre pregiudizi dove RNA interagisce fisicamente con la proteina23,24. In iCLIP, solo un singolo adattatore è legato all'estremità 3' di frammenti di RNA reticolati. Dopo la trascrizione inversa (RT), i cDNA troncati e read-through sono ottenuti mediante circolarizzazione intramoleularmente e re-linearizzazione seguita dall'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)25,26. Tuttavia, l'efficienza della circolarizzazione intramolecolare è relativamente bassa. Sebbene i vecchi protocolli clip debbano etichettare l'RNA reticolato con un radioisotopo, il reticolazione ultravioletta e la purificazione dell'affinità (uvclap), con un processo di rigorosa purificazione dell'affinità di tandem, non si basano sulla radioattività27. Tuttavia, uvCLAP è limitato alle cellule coltivate che devono essere trasfected con il vettore di espressione portando il 3x FLAG-HBH tag per la purificazione di affinità tandem.
In eCLIP, gli adattatori sono stati legati prima all'estremità 3' dell'RNA seguita da RT, e successivamente all'estremità 3' dei cDNA in modalità intermolecolare. ECLIP è quindi in grado di catturare tutti i cDNA28troncati e read-through. Inoltre, non è limitato all'etichettatura radioattiva, né all'utilizzo di linee cellulari basate sul suo principio, pur mantenendo la risoluzione a singolo nucleotide.
Qui, forniamo una descrizione passo-passo di un protocollo eCLIP adattato per testis del mouse. Brevemente, questo protocollo eCLIP inizia con reticolazione UV dei tubuli testicolari, seguita da digestione parziale della RNAsi e immunoprecipitazioni utilizzando un anticorpo specifico per le proteine. Successivamente, l'RNA legato alla proteina è defosforilato e l'adattatore è legato alla sua estremità 3'. Dopo l'elettroforesi del gel proteico e il trasferimento da gel a membrana, l'RNA è isolato tagliando l'area della membrana di una gamma di dimensioni attese. Dopo RT, l'adattatore DNA è legato all'estremità 3' del cDNA seguita dall'amplificazione della PCR. Lo screening dei subcloni prima del sequenziamento ad alto throughput è considerato un controllo di qualità della libreria. Questo protocollo è efficace nell'identificare le principali specie di RNA legato alle proteine di RBPs, esemplificato dai due RNA che esprimono i testicoli MOV10L1 e MOV10.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse MOV10&nbsp; anticorpo</td><td>Proteintech, Cina</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MOV10L1 di topo</td><td>Zheng et al.20109</td><td>antisieri policlonali UP2175</td><td>forniti da P. Jeremy Wang lab, Università della Pennsylvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio IgG</td><td>Beyotime, Cina</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Sonificatore digitale</td><td>BRANSON, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watt; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnete</td><td>Invitrogen, USA</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Modulo Blot</td><td>Invitrogen, USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Grinder per tessuti, Dounce</td><td>PYREX, USA</td><td>1234F35</td><td>solo... il pestello "sciolto" viene utilizzato in questo protocollo</td></tr><tr><td>TProfessional standard 96 Gradient</td><td>Biometra, Germania</td><td>numero di serie: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Revolver a tubo&nbsp;</td><td>Cristallo, USA</td><td>numero di serie: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>reticolante</td><td>a luce UVP, USA</td><td>CL-1000<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-treated Culture Dish Corning</td><td>, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Microprovette</td><td>AXYGEN , USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Reagenti&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenolo acido/cloroformio/alcool isoamilico&nbsp;</td><td>Solarbio, Cina</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzyme</td><td>Agilent, USA</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidant</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; batteri competenti</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>18265017</td><td>queste celle economiche producono >1 x 106 trasformanti/&micro; g DNA di controllo per 50 &micro; L.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL</td><td>Vazyme, Cina</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td>aggiungere fresco</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, USA</td><td>78201</td><td>PCR Product Cleanup Reagent&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzima FastAP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarosio&nbsp;</td><td>lonza, Svizzera</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Estrazione di gel MiniElute</td><td>QIAGEN, Germania</td><td>28604</td><td>magazzino di colonne a 4 ?; tampone QG=tampone di dissoluzione del gel; tampone PE= tampone di lavaggio (per il passaggio 14)</td></tr><tr><td>MyONE Perle di silano</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>37002D</td><td>Estrazione di acidi nucleici perle magnetiche</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen,USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&ndash; Kit tampone NuPAGE MOPS SDS da 12%, 1,5 mm, 15 pozzetti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tubo pesante in gel ad aggancio di fase (PLG)&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, Cina</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, USA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Miscela master PCR Q5&nbsp;</td><td>NEB, Nuova Inghilterra&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>tampone RLT</td><td>QIAGEN, Germania</td><td>79216</td><td>tampone di lisi per purificazione dell'RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA pulito e Concentratore-5 colonne&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, USA</td><td>R1016</td><td>Colonne di purificazione e concentrazione</td></tr><tr><td>dell'RNA RNasi I&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNasi</td><td>Promega,USA</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Agente riducente del campione</td><td>Invitrogen,USA</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr> <tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>30970</td><td>proteggere da enzima</td></tr><tr><td>leggero T4 PNK</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi 1 alto conc</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, Cina</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Pellicole a raggi X</td><td>Caresteam, Canada</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eclip) per un'identificazione efficiente dell'rna legato alle proteine nei testis del topo

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

La spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l'importanza della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell'RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l'uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3' regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.

La procedura eclip e i risultati sono illustrati nella figura 1, figura 2, Figura 3, figura 4. I topi sono stati eutanizzati con anidride carbonica e una piccola incisione è stata fatta nel basso addome utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2a</str...

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

Le proteine leganti l'RNA sono essenziali per la fisiologia cellulare. È importante sottolineare che gli RBP sono altamente espressi in tutta la spermatogenesi e sono stati ben documentati come regolatori post-trascrittivi essenziali durante tutte le fasi delle cellule germinali. L'identificazione di obiettivi vincolanti è fondamentale per chiarire i ruoli meccanicistici di RBP.Questo protocollo rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP per catturare obiettivi endogeni di RNA diretto e stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli dei mammiferi. Il vantaggio principale di questo metodo è che non è radioattivo, richiede meno tempo e fornisce un rapporto segnale-rumore più forte perché l'ingresso abbinato alle dimensioni fungerà da sfondo appropriato per obiettivi autentici. Infine, riteniamo che il sequenziamento su piccola scala dei subclones sia utile per seguire il sequenziamento profondo.A dimostrare la procedura sarà Xu Qiushi, il mio collega. Per iniziare questa procedura, raccogliere circa 100 milligrammi di tester da topi di età appropriata per ogni esperimento di immunoprecipitazione. Posizionare i tessuti in PBS ghiacciato.Utilizzando un paio di pinzette a punta fine, rimuovere delicatamente la tunica albuginea. Aggiungere tre millilitri di PBS ghiacciato a una smerigliatrice di tessuto e utilizzare un pestello di vetro sciolto per triturare il tessuto con una leggera forza meccanica. Successivamente, trasferire la sospensione del tessuto in un piatto di coltura cellulare e aggiungere PBS ghiacciato fino a sei millilitri.Agitare rapidamente il piatto in modo che il liquido copra il fondo del piatto in modo uniforme. Incrociare la sospensione sul ghiaccio tre volte con 400 millijoule per centimetro squadrato a 254 nanometri. Assicurarsi di mescolare la sospensione tra ogni irradiazione.Quindi, raccogliere la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1.200 volte g e a quattro gradi per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS. Successivamente, trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per due minuti, e scartare il supernatante. In primo luogo, aggiungere 125 microlitri di proteine A perline magnetiche per campione a un tubo di centrifuga fresco. Posizionare il tubo sul magnete per separare le perline dalla soluzione.Dopo 10 secondi, rimuovere il supernatante e lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lysis ghiacciato. Rimescolare le perline in 100 microlitri di tampone di lysis fredda con 10 microgrammi di anticorpo eCLIP. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 45 minuti.Quindi, lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lisi ghiacciata. Per iniziare, rimescolare il pellet di tessuto in un millilitro di tampone di lisi fredda contenente 22 microlitri di cocktail inibitore proteico privo di EDTA 50x e 11 microlitri di inibitore della RNasi. Continuare a lysing i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.Sonicare ogni campione come delineato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere quattro microlitri di DNasi a ciascun tubo e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti tremando a 1.200 giri/min.Dopodiché, aggiungere 10 microlitri di RNasi diluita e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti tremando a 1.200 giri/min. Quindi, centrifuga a 15.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti per cancellare il lisato.Raccogliere con cura il supernatante e salvare campioni di input per campioni RWB e RRI. In primo luogo, aggiungere un millilitro del lysate alle perline preparate e ruotare i campioni a quattro gradi Celsius per due ore o durante la notte. Dopo questo, raccogli le perline con un supporto magnetico e scarta il supernatante.Lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone ad alto sale, quindi lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Quindi, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di fosforilazione 1x. In primo luogo, scartare il supernatante e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo.Aggiungere 25 microlitri di mix principale di ligation a tre primi a ciascun campione e pipettare con cura per mescolare. Aggiungere 2,5 microlitri di adattatore RNA X1A e 2,5 microlitri di adattatore RNA X1B a ciascun campione. Mescolare con cura pipettando o sfogliando.Incubare a 25 gradi Celsius per 75 minuti, assicurandosi di scorrere il tubo per mescolare ogni 10 minuti. Lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo. Successivamente, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone freddo ad alto sale e quindi con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo.Ripeti entrambi questi lavaggi ancora una volta. Separare magneticamente le perline e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Rimostrare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio a freddo e spostare 20 microlitri in nuovi tubi come campioni di RWB.Aggiungere 7,5 microlitri di tampone campione LDS 4x e tre microlitri di agente riducente del campione 10x ai campioni rimanenti. Incubare a 70 gradi Celsius per 10 minuti mentre si trema a 1.200 giri/min. Dopo questo, raffreddare i campioni sul ghiaccio per un minuto e centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per un minuto.Per il gel RWB, posizionare i tubi su un magnete e separare l'eluito proteico dalle perline. Caricare 15 microlitri di campione in ogni pozzo. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di antiossidante a 500 millilitri di 1x tampone di funzionamento SDS.Eseguire il gel a 200 volt, 1 tampone di funzionamento SDS per 50 minuti o fino a quando la parte anteriore del colorante è nella parte inferiore. Trasferire i complessi proteina-RNA dal gel a una membrana di nitrocellulosa a 10 volt per 70 minuti in tampone di trasferimento 1x con 10%metanolo. Bloccare la membrana RWB nel 5% di latte in TBST a temperatura ambiente per un'ora.Risciacquare la membrana in TBST e incubare con anticorpi primari in TBST durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo questo, lavare due volte con TBST, con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Incubare con anticorpi secondari in TBST a temperatura ambiente per un'ora.Quindi, lavare la membrana tre volte con TBST. Quindi, mescolare volumi uguali di tampone ECL A e tampone B.Aggiungere questa miscela alla membrana e incubare per un minuto. Coprire la membrana con un involucro di plastica ed esporla a una pellicola a raggi X a temperatura ambiente per due o tre minuti prima di sviluppare il film.In questo studio, MOV10 eCLIP nei teste di topi adulti di tipo selvatico con RNasi I che tratta il lisato reticolato, la proteina bersaglio, che è di circa 114 kilodaltoni, viene arricchita con successo. I risultati qPCR del cDNA diluito uno a 10 da vari campioni rivelano che i campioni non collegati a croce mostrano una diminuzione del recupero dell'RNA. Si osserva che i valori Ct del gruppo non reticente sono generalmente cinque volte superiori al gruppo uv-crosslinked.Qui sono riportati i risultati rappresentativi per l'amplificazione della PCR e la selezione delle dimensioni tramite elettroforesi del gel di agarosio. Il prodotto primer-dimer appare a circa 140 coppie di basi. La vista UCSC Genome Browser di due sequenze rappresentative di subclone mostra che i tag eCLIP associati a MOV10 si trovano all'interno dell'UTR a tre numeri primi del gene Fto.Il tasso approssimativo di destinazioni UTR a tre numeri primi rappresenta il 75% è coerente con la maggior parte degli obiettivi MOV10 nelle celle HEK293 e nei teste. Al contrario, i tag eCLIP associati a MOV10L1 si trovano all'interno di un cluster di piRNA, indicando che MOV10L1 prende di mira i precursori di piRNA. Il tasso approssimativo di obiettivi precursori del piRNA rappresenta il 42% che riflette una tendenza degli studi precedenti.MOV10L1 eCLIP con una digestione RNasi I da 40 unità per millilitro produce relativamente più sequenze con meno di 20 coppie di basi. Questo protocollo qui descritto rappresenta un impiego del metodo eCLIP nella riproduzione, un'area in cui la conoscenza dell'interazione RNA-RBP è piuttosto insufficiente.

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La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Questo video mostra il metodo di immunoprecipitazione reticolante potenziata (eCLIP) per identificare le proteine leganti l'RNA nel testicolo del topo. eCLIP consente l'identificazione precisa dei siti di legame in cui le proteine leganti l'RNA (RBP) interagiscono con i loro RNA bersaglio.

Un metodo avanzato di immunoprecipitazione reticolante per l'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testicoli di topo

Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

È descritta una procedura di isolamento di RNA (viaggio) tandem per il recupero dei complessi in modo endogeno formato mRNA-proteina. In particolare, complessi RNA-proteina sono reticolate in vivo, poliadenilazione RNAs sono isolati dagli estratti con i branelli di oligo e particolare mRNA vengono catturati con oligonucleotidi antisenso RNA modificati. Proteine legate a mRNA vengono rilevati dall'analisi del immunoblot.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire i siti endogeni di legame dell'RNA o "impronte" di nasi: proteine (RNP) complessi da cellule di mammiferi. Questo approccio comporta due immunoprecipitazioni di sottounità RNP ed è quindi soprannominato immunoprecipitazioni di RNA in tandem (RIPiT).

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Qui, descriviamo l'immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell'RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L'allevamento strategico e un'attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Un metodo ChIRP basato su UV per identificare interazioni dirette lncRNA-proteina.

Un metodo ChIRP a base di UV per l'identificazione verificabile di proteine che interagiscono direttamente con lncRNA: dalle cellule coltivate al testicolo del topo

Scopri il metodo eCLIP per identificare gli RNA legati alle proteine nei testis del topo. Questo protocollo non radioattivo offre elevata specificità del segnale per studiare la regolazione post-trascrizionale durante la spermatogenesi.

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