Name: Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri i protocolli per generare organoidi neurali umani da cellule staminali pluripotenti per modellare il glioblastoma e la differenziazione dopaminergica. Questi metodi offrono una piattaforma riproducibile per studiare malattie neurologiche umane.

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Gli autori ringraziano la Ligue Genevoise Contre le Cancer (Geneva, Svizzera), la Fondazione ISREC (Losanna, Svizzera) e la Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) per il sostegno finanziario. Inoltre, gli autori ringraziano HES-HO e il Wyss Center per il sostegno finanziario. Ringraziamo il laboratorio del Krause per le discussioni e il supporto utili e il dottor Halah Kutaish per la correzione delle bozze.

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana dell'Università di Ginevra.
1. Manutenzione e coltura di cellule staminali embrionali umane indifferenziate (hESC)
<ol><li>Esegui la manutenzione e l'espansione degli hSEC in condizioni di liberazione dell'alimentatore pre-rivestimento con una specifica matrice extracellulare.<ol>
<li>Scongelare 300 l di matrice extracellulare a 4 gradi centigradi (concentrazione tipica della gamma 18-22 mg/mL, tenere sul ghiaccio) e mescolare delicatamente con 15 mL di mezzo DMEM freddo per evitare una gelazione prematura della matrice extracellulare. Aggiungere 7,5 mL dell'extracellulare matrico a entrambi i flaconi T150.</li>
		<li>Incubare i piatti rivestiti con matrice extracellulare a 37 s per almeno 1 h (massimo durante la notte).</li>
		<li>Rimuovere gli hESC medi e semi a una densità di 6,5 x 104 celle/cm2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenere H1 (linea cellulare hESC) in hESC medio e 1% penicillina/streptomycin.</li>
	<li>Passare le cellule con procedura ezimatica: aggiungere 7,5 mL di soluzione ezimatica a un flacone T75 cm2 per un periodo di 1-2 min a 37 gradi centigradi. Una volta che le cellule sono completamente staccate, aggiungere 7,5 mL di DMEM-F12 quindi centrificare per 5 min a 300 x g. Per consentire una migliore sopravvivenza, ri-piastrare le cellule alla densità desiderata su piatti extracellulari rivestiti a matrice, nello stesso mezzo contenente inibitore della chinasi proteica associata al Rho (ROCK) (10 M) per 24 ore.</li>
</ol>2. organoidi neurali derivati da hESC per studi GBM
<ol><li>24 h prima di iniziare la coltura 3D, sostituire il mezzo hESC con un mezzo privo di siero integrato con 10 inibitori di ROCK di 10 M (entrambi i componenti sono necessari per sostenere la sopravvivenza delle cellule e la formazione spontanea della neurosfera durante la fase di aggregazione in un microwell piatto). Le cellule devono essere al 60% di confluenza. Il giorno successivo (giorno 0), staccare le colonie hESC come singole cellule: rimuovere il mezzo, quindi risciacquare con PBS senza Ca2 oMg2, aggiungere 5 mL di soluzione di dissoluzione enzimatica e incubare a 37 gradi centigradi per 1-2 min.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in un mezzo privo di siero con 10 M di inibitore ROCK e centrificare le cellule a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e contare le cellule in 10 mL di mezzo senza sieri integrato con 10 M di inibitore ROCK.</li>
	<li>In parallelo, sciacquare la piastra microwell con 2 mL di mezzo senza sieri per pozzo e centrifugare la piastra a 1200 x g per 5 min per rimuovere tutte le bolle, che possono prevenire la formazione della neurosfera.</li>
	<li>Preparare 28,2 x 106 cellule in 12,5 mL di mezzo senza sieri integrato con 10 inibitore ROCK m. Distribuisci 1000 cellule/microwell. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi durante la notte (massimo 36 h). Per esempio: per ottenere 30 organoidi neurali umani, utilizzare una fiaschetta T150 al 70%-80% della confluenza (circa 30 milioni di cellule).</li>
	<li>Il giorno successivo (giorno 1), raccogliere le sfere (con un P1000) e metterle in un 6 bene piastra. In ogni pozzo, aggiungere 2 mL di B27 medio e DMEM-F12 GlutaMAX e Neurobasal medio (mix a 1:1), integrato con 1% B27 integratori e 1% aminoacidi non essenziali (NEAA). Per promuovere l'induzione neurale veloce, integrare il mezzo con un doppio cocktail di inibizione SMAD, composto da 10 inibitori di TGF/Nodal e inibitore della proteina morfogena dell'osso 0,5 M (BMP). Da questo passo in avanti, le sfere sono coltivate in rotazione (60 rpm, shaker orbitale). La rotazione è fondamentale per evitare che le sfere si attacchino insieme o alla piastra.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni: piegare la piastra e lasciare cadere le sfere per 5 min, rimuovere metà del mezzo (2 mL), e aggiungere 2 mL di fresco B27 medio integrato con fattori di crescita e inibitori. Non centrifugare le sfere.</li>
	<li>Eseguire l'induzione neurale in base al seguente corso temporale:<ol>
<li>Dai giorni 1-4, la cultura le sfere in B27 medio integrato con dual-SMAD. Il doppio cocktail di inibizione sMAD (10 M TGF/Activin/Nodal inibitore e 0,5 M bMP inibitore) promuove l'induzione neurale.</li>
		<li>Dai giorni 4-11, promuovere la proliferazione di rosette neurali derivate da hESC (nelle sfere), aggiungendo 10 fattore di crescita epidermico ng/mL (EGF) e 10 fattore fibroblasto di base ng/mL (bFGF) al mezzo B27 integrato con cocktail dual-SMAD. NOTA: il giorno 11, la maggior parte delle celle dovrebbe essere positiva per Nestin.</li>
		<li>Dai giorni 11-13, coltura le sfere in B27 medio integrato con 0,5 M inibitore BMP.</li>
		<li>Dai giorni 13-21, coltura le sfere in B27 medio integrato con 10 ng/mL gliale fattore neurotrofico derivato (GDNF), 10 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF) e 1 M di inibitore di z secretasi. GDNF e BDNF promuovono la differenziazione neuronale e gliale. L'inibitore della segretasi a z consente una maggiore maturazione neurale.</li>
		<li>Il giorno 21, placcare le sfere (circa 1.000 sfere) su una membrana idrofila politetrafluoroetilene (PTFE) depositata su un inserto di piastra di coltura progettato per 6 pozzetti. Interrompere qualsiasi rotazione da questo passaggio. La presenza di rosette, osservate con un microscopio a campo luminoso, indicano l'avvio della differenziazione neurale. Le rosette neurali possono essere osservate 2-3 giorni dopo le sfere di placcatura sulla membrana PTFE.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di B27 medio integrato con fattori di crescita e inibitori (come seguito) per ogni ben sotto l'inserto della membrana, ogni 2-3 giorni (di solito il Lunedi, Mercoledì e Venerdì), per un successivo 3 settimane di differenziazione.</li>
		<li>Dai giorni 21-25, coltivare gli organoidi neurali umani nello stesso mezzo di maturazione neurale (Cf. passo 2.7.4).</li>
		<li>Dai giorni 25-28, completa solo il mezzo B27 con 1 - inibitore di segreto.</a0></li>
		<li>Dai giorni 28-39, smetti di aggiungere l'inibitore della segretesi -z e continua la coltura degli organoidi neurali umani solo nel mezzo B27. NOTA: Dopo 3 settimane, gli organoidi neurali sono pronti all'uso per l'impianto GIC. Lungo la maturazione neurale, è stata osservata una diminuzione del marcatore nevralgico immaturo Nestin e un aumento dei marcatori neurali maturi3-tubulina e GFAP.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento e coltivazione di cellule che hanno invitato il glioblastoma (GIC)
<ol><li>Isolare le GIC frammentando una biopsia GBM umana di alto grado. Trasferire il pezzo di tumore in un becher contenente 0.25% di prova in 0.1 mM EDTA (4:1) e mescolare lentamente a 37 s per 30-60 min (a seconda delle dimensioni del tumore).</li>
	<li>Piastra delle cellule dissociate in 75 cm2 flaconi di coltura tissutale placcate a 2.500-5.000 cellule per cm2 nel mezzo GIC: DMEM/F-12 medio (1:1) contenente 1% N2, 1% B27, e 1% G5 integratori (per favorire la sopravvivenza del GIC), integrati con bFGF e EGF (entrambi a 10 ng/Ml, per promuovere la stesità) e l'1% della penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Una volta che il GIC è ben consolidato e in crescita, rimuovere i supplementi N2 e G5 dal supporto GIC.</li>
	<li>Un giorno prima di aggiungere le cellule sull'organoide, dissociare le GIC e contarle.</li>
	<li>Sciacquare la piastra microwell con 2 mL di mezzo GIC e centrifugare la piastra alla velocità massima per rimuovere le bolle (1000 x g). Posizionare le GIC a 1.000 cellule per ottenere una gliomasfera per microwell. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi (Figura1C). Questo passaggio è fondamentale e consente GIC ben calibrate (un esempio di GIF necrotiche e di dimensioni eccessive è illustrato nella Figura 2A,C).</li>
	<li>Per avviare l'invasione GBM, aggiungere una gliomasfera sopra il tessuto neurale con una grande punta del tubo di foro (Figura 1F). Riporre con cura la piastra 6 dell'incubatrice.</li>
</ol>4. organoidi dopaminergici derivati da hESC per studi pd
<ol><li>Giorno 0: amplifica gli hESC nella cultura 2D fino al 60% di confluenza (giorno 0), quindi sostituisci i supporti delle cellule staminali utilizzate per mantenere le caratteristiche di pluripotenza degli HESC con un mezzo privo di siero. Iniziare l'induzione neurale completando il mezzo di coltura con 0,5 M di inibitore di BMP e 10 -M inibitore TGF/Activin/Nodal (cocktail di inibizione a doppio SMAD), quindi aggiungere 10 inibitore ROCK m per 24 h per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio.</li>
	<li>Giorno 1: Preparare la piastra microwell con 2,5 mL per pozzo di mezzo senza siero integrato con 0,5 inibitori BMP, 10 inibitore TGF/Activin/Nodal e 10M inibitore rock. Per specificare le cellule verso il modello ventrale del tubo neurale, aggiungere 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL fattore di crescita fibroblasto 8 (FGF8) e 2 agonista levigato. Centrifugare la piastra (solo con cellule medie e senza cellule) a 1200 x g per 5 min per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzi.<ol>
<li>Dopo 1 giorno di induzione neurale in 2D, rimuovere il mezzo e lavare rapidamente con PBS senza Ca2 o/MgCl2. Dissociare le colonie in sospensione a celle singole aggiungendo 7,5 mL di soluzione enzimatica ricombinante in un flacone T75 cm 2. Incubare per 2 min a 37 s poi completare con 7,5 mL di DMEM-F12.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare e la centrifuga a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e contare le cellule nello stesso mezzo utilizzato per preparare la piastra di microwell.</li>
		<li>Regolare il volume medio per ottenere una sospensione cellulare che consenta di formare neurosfere contenenti 1000 cellule per micropolo (ad esempio, la piastra di microwell utilizzata qui contiene 4.700 micropozzi per pozzo). Quindi, preparare 4,7 milioni di cellule in 2,5 mL di mezzo e aggiungerlo al precedente 2,5 mL di mezzo già collocato nella piastra.</li>
		<li>Al fine di distribuire correttamente le cellule in ogni micropolo, scuotere delicatamente la piastra e centrifugare la piastra microwell 300 x g per 5 min. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 24 h per generare sfere.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 2: Lavare delicatamente i micropozzi con il mezzo e raccogliere quindi trasferire le sfere in una piastra a sei pozzeti trattata con i tessuti. Sostituire medio con mezzo Neurobasal integrato con 1% B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutamine, e 1% di penicillina / streptomicina. Inoltre, aggiungere fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, agonista levigato, e doppia-SMAD inibizione piccole molecole.<ol>
<li>Posizionare le sfere a rotazione a 37 gradi centigradi (60 giri, agitatore orbitale) e cambiare metà medio appena integrato ogni 2-3 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 3: Per migliorare l'induzione neurale e convertirsi in progenitori neurali con un'identità midbrain, integrare il mezzo con 3 inibitori GSK-3, che attiva la via Wnt / - catenina. Mantenere l'inibitore di GSK-3 nel mezzo fino al giorno 13. Dividi litibio in due nuove placche di 6 pozzetti trattati con i tessuti per ridurre sia la densità della sfera per pozzo ed evitare l'aggregazione della sfera. NOTA: al giorno 8, la maggior parte delle celle dovrebbe essere positiva per Nestin.</li>
	<li>Giorno 8: Avviare la maturazione neurale: sostituire i fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, agonista levigato, e doppio-SMAD cocktail inibizione con 0,5 mM dibutyryl cAMP (per favorire la maturazione), 20 nM inibitore di istone deacetylase (per l'uscita del ciclo cellulare), 1 inibitori e fattori di crescita, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL che trasforma il fattore di crescita di trasformazione 3 (TGF) e 5 ng/mL FGF20 (entrambi favoriscono la sopravvivenza del progenitore DA). Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Giorno 21: Generare l'organoide neurale: semi circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido sulla membrana PTFE (6 mm di diametro). Trasferire la membrana in un inserto piastra di coltura (0,4 mm) e aggiungere 1,2 mL di mezzo di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera, come descritto in precedenza.<ol>
<li>Interrompere qualsiasi rotazione da questo passaggio. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino a ottenere il punto di tempo di differenziazione richiesto. NOTA: Per quanto riguarda la maturazione neurale, è stata osservata una diminuzione del marcatore nevralgico immaturo Nestin e l'aumento dei marcatori neurali maturi di 3 tubuline e GFAP. Sono state osservate espressioni TH e NURR1 elevate (Figura 3C) e confermano la maturità degli organidici neurali11.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Quantificazione dell'espressione genica TH e Nurr1 per la convalida della differenziazione dopaminergica
<ol><li>Estrazione dell'RNA: il giorno di differenziazione indicato, lisse 40 neurosfere con 350 l di tampone RLT (fornito nel kit di estrazione dell'RNA) completate da 3,5 :L di 2-mercaptoetanolo. Estrarre l'RNA dalle neurosfere lismi utilizzando un kit di estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Quantificare le concentrazioni totali di RNA.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione inversa di 300 ng dell'estrazione totale dell'RNA utilizzando il kit di trascrizione inversa per la reazione quantitativa della catena di polimerasi in tempo reale (qPCR) e seguire le istruzioni del produttore .</li>
	<li>Eseguire l'analisi qPCR su sistemi di rilevamento PCR in tempo reale, sulla base del rilevamento asimmetrico dei coloranti di cianina. Normalizzare i dati con i geni delle pulidi: dehydrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e fattore di allungamento 1-alfa (EF1). Le sequenze di primer sono descritte nella Tabella 1.</li>
</ol>6. Rilevamento di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC)
<ol><li>Utilizzare cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con rilevamento elettrochimico per rilevare la presenza di dopamina. La dopamina è stata estratta da organoidi neurali lisci in 100 mL di 0,1 N acido perclorico (HClO4) per 15 min a 4 gradi centigradi con un vortice vigoroso ogni 5 min. Dopo la centrifuga, raccogliere e conservare il supernatante a -20 gradi centigradi per il dosaggio della dopamina.</li>
	<li>Utilizzare una colonna C-18 (5 m, 4,6 mm x 150 mm) per separare gli analiti con HPLC in fase invertita in modalità isocratica a una velocità di flusso di 1 mL/minuto. La rilevazione della dopamina deve essere effettuata utilizzando un rilevatore coulometrico con la cella di condizionamento impostata ad un potenziale di 200 mV.</li>
</ol>7. Registrazione dei dati grezzi con piattaforma MEA (microelectode array)
<ol><li>Utilizzare un microscopio a dissezione per trasferire le neurosfere al centro di un dispositivo MEA poroso.</li>
	<li>Utilizzare un amplificatore e un sistema di acquisizione dati per registrazioni elettrofisiologiche. Misurare il rapporto segnale-rumore (SNR) come deviazione standard della tensione durante una registrazione di 5 min, utilizzando il segnale come tensione media picco-picco dei picchi registrati negli stessi 5 periodi min.</li>
</ol>

<ol><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Daphu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+animal+models+for+studying+brain+metastasis%3A+value+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).</li>
<li>Huszthy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+primary+brain+tumors%3A+pitfalls+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives.</a> Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).</li>
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<li>Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Parkinson%27s%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Parkinson's's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).</li>
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<li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New dimensions in cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Uno degli aspetti più critici di questo protocollo include il mantenimento della pluripotenza hESC durante la coltura cellulare e il monitoraggio attento delle sfere e della morfologia degli organili neurali. Gli hESC sono molto sensibili e ogni manipolazione può portare a una differenziazione incontrollata precoce e alla morte cellulare. Al fine di aumentare la riproducibilità sperimentale ed evitare il verificarsi di eventi anormali di cariotipo, si consiglia di crioconservare diversi lotti di hESC al passaggio più basso dopo la convalida della loro stabilità cromosomica. Inoltre, si consiglia di scongelare una nuova fiala per ogni esperimento e controllare il comportamento delle cellule ogni giorno. Se le sfere sono meno rifrattive con dimensioni anormali più alte, probabilmente inizieranno ad aggregarsi e morire.
Un miglioramento di questo sistema è la perfusione o l'implementazione di un sistema vascolarizzato (aggiungendo cellule endoteliali o all'interno di un microchip fluidico 3D)12,13. Tuttavia, il controllo dello spessore dell'organoid neurale (300 m) consente un'efficiente perfusione passiva di ossigeno e nutrimenti e previene la necrosi. Un altro miglioramento è l'introduzione di cellule immunitarie (microglia). Con queste limitazioni in mente, organoidi neurali più un sistema GIC può essere uno strumento rilevante per diversi motivi. In primo luogo, questo sistema consente lo screening farmacologico per monitorare come un composto terapeutico può influenzare una cellula organoide o tumorale. In secondo luogo, le interazioni cellula-cellula possono essere studiate, e determinanti micro-ambientali alla base delle invasioni individuali e collettive possono essere visualizzate ed esplorate5,6,13.
Nel contesto del morbo di Parkinson, un organoide neurale arricchito nei neuroni DA può rappresentare un modello 3D pertinente e accurato per studiare lo sviluppo della malattia. In studi precedenti, le cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal paziente di Parkinson differenziate verso i neuroni DA sono state utilizzate per studiare i sottotipi neuronali colpiti. Da notare che sono stati osservati alcuni fenotipi correlati alla malattia, come l'accumulo di sinucleina e la sensibilità allo stress ossidativo14,15. Inoltre, l'organoid neurale può essere utilizzato come strumento per lo screening delle molecole terapeutiche. Tuttavia, letture specifiche e rilevanti dovrebbero essere istituite per valutare la sopravvivenza e la funzionalità del neurone DA, come la produzione di dopamina e l'attività elettrofisiologica. Complessivamente, questo protocollo fornisce due approcci standardizzati e accurati basati sulle cellule staminali per generare organoidi neurali.

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) classifica gli astrocitomi come di basso grado (grado da I a II) o di alto grado (grado III e IV). Glioblastoma multiforme (GBM) è un astrocitoma di grado IV, il più letale dei tumori cerebrali primari, che è resistente a tutte le forme attuali di trattamenti1. Nonostante la terapia standard di cura tra cui neurochirurgia, chemioterapia e radioterapia, GBM rimane fatale e il tasso di sopravvivenza globale di 15 mesi non è cambiato drasticamente negli ultimi 15 anni2. Per compiere progressi significativi nella comprensione della patogenesi GBM, l'uso di modelli pertinenti è fondamentale. Finora, lo studio di GBM ha fatto affidamento su linee cellulari, fette organotipiche e xenotrapianto di cellule derivate dal paziente in topi o topi transgenici sviluppando tumori spontanei3,4. Anche se questi modelli sono stati utili per studiare la metastasi cerebrale e l'aggressività tumorale, sono limitati da differenze tra le specie, e le conclusioni risultanti possono essere tradotte in modo errato nei tessuti umani. Inoltre, i modelli esistenti con cellule umane sono limitati anche dall'assenza di interazioni tra tessuto ospite3,4. I modelli sperimentali sono fondamentali per la traduzione dalla scienza di base agli obiettivi terapeutici. Pertanto, la descrizione di un protocollo per produrre organoidi neurali umani in vitro co-coltivati con cellule che hanno invitato GBM (GIC) può fornire un sistema rilevante che imita le caratteristiche morfologiche e funzionali dello sviluppo GBM. Questo sistema riproduce alcune caratteristiche in vivo dello sviluppo gbM, come la migrazione diffusa di cellule invasori e aree di necrosi, e mette in evidenza l'espressione genica rilevante per la biologia tumorale. Come rivelato in precedenza, alcuni microRNA critici vengono indotti durante lo sviluppo di GIC all'interno del tessuto nervoso 3D5,6.
La PD è un disturbo neurodegenerativo importante e associata alla degenerazione di più sottotipi neuronali7. Anche se un progressivo insorgenza dei sintomi (ad esempio, bradicinesia, tremore di riposo asimmetrico, rigidità e instabilità della postura) caratterizza la malattia, la sua eziologia esatta non è chiaramente stabilita. Infatti, molti studi hanno evidenziato che i principali fattori di rischio possono derivare da una combinazione di fattori genetici e ambientali. I sintomi di Parkinson sono associati alla degenerazione bilaterale dei neuroni dopaminergici nella substancia nigra (SN), che porta alla scomparsa degli assoni dopaminergici (DA) che si proiettano allo striato8,9. Pertanto, la riduzione dei livelli di dopamina striatale è correlata con la progressione della disfunzione motoria nei pazienti affetti da PD. I neuroni dopaminergici contengono idrossilasi di tirosina (TH), un enzima chiave nella sintesi di neurotrasmettitori catecholaminergici che converte l'amminoacido L-tirosina in L-3,4-diidrossifenilina (L-DOPA, un precursore della dopamina) alla dopamina10. La perdita precoce dell'attività di TH seguita da un declino dell'espressione della proteina TH è un segno distintivo della PD.
Questo studio descrive due protocolli che utilizzano organoidi neurali umani, uno specificamente orientato verso un fenotipo midbrain-like arricchito con cellule TH-positive.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 6 pozzetti (piastra a 6 pozzetti)</td><td>Falcon / Corning</td><td>07-201-588</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento ABI Prism 7900 HT&nbsp; (Sistemi di rilevamento PCR in tempo reale)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 (piastre di coltura per micropozzetti)</td><td>Amplificatore StemCell Technologies</td><td>34421</td><td></td></tr><tr><td>(W2100-HS32)&nbsp; (Amplificatore)</td><td>Sistemi</td><td></td><td></td>multicanale</tr><tr><td>Anticorpo anti-EGFR (fosfo Y1101)</td><td>Abcam</td><td>ab76195</td><td>Diluizione 1/100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP Dako</td><td>&nbsp;</td><td>Z334&nbsp;</td><td>Diluizione 1/1000</td></tr><tr><td>Anti-nestina, anticorpo umano</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>ABD69&nbsp;</td><td>1/400 di diluizione</td></tr><tr><td>Chemicon anticorpo anti-sinapsina I</td><td></td><td>AB1543P&nbsp;</td><td>1/500 di diluizione</td></tr><tr><td>Integratori di B27 (B27)</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>1238</td><td>Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello&nbsp; (BDNF)</td><td>Guida cellulare</td><td>GFH1-2</td><td>Per entrambi i protocolli,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (inibitore GSK-3&beta; )</td><td>Axon Medchem</td><td>ct99021</td><td>Per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 7,5 mM in DMSO, soluzione finale 3 &; M</td></tr><tr><td>Composto E a &gamma; &ndash; inibitore della secretasi (&gamma; &ndash; inibitore della secretasi)</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 209986-17-4</td><td>Per entrambi i protocolli (inibitore della gamma-secretasi XXI),&nbsp; soluzione madre 5 mM in DMSO, soluzione finale 1 &; M</td></tr><tr><td>Coulochem III&nbsp; (Parametri del rivelatore coulometrico)</td><td>Thermo scientifico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dibutirril-ciclico-AMP (Dibutirril cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 0,5 M in DMSO, soluzione finale 0,5 mM</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido puro (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6164</td><td>Compounds solvente, pronto all'uso</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12491-015</td><td>Per colture cellulari, pronto per utilizzare</td></tr><tr><td>la Miscela Media Eagle modificata di Dulbecco F-12 (DMEM-F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Per colture cellulari, pronto all'uso</td></tr><tr><td>EDTA 0,1 mM (EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9912</td><td>Per colture cellulari, pronto all'uso</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td>Per colture GIC,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 20 (FGF20)</td><td>Peprotech</td><td>100-41</td><td>Per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 5 ng/mL</td></tr><tr><td>fattore di crescita dei fibroblasti 8&nbsp; (FGF8)</td><td>Peprotech</td><td>GFH176-5</td><td>per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-base (bFGF)</td><td>Gibco</td><td>PHG0024</td><td>Per coltura GIC,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Integratori G5 (G5)</td><td>Invitrogen</td><td>17503012</td><td>Per coltura GIC, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato da cellule gliali (GDNF)</td><td>Guida cellulare</td><td>GFH2-2</td><td>Per entrambi i protocolli,&nbsp; soluzione madre 100 &; g/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL</td></tr><tr><td>Membrana idrofila in politetrafluoroetilene&nbsp; (membrana in PTFE)</td><td>BioCell-Interface</td><td>Fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 (inibitore BMP)</td><td>Axon Medchem /Stemgen</td><td>04-0072-02 /1509</td><td>Dual/Smad,&nbsp; soluzione madre 5 mM in DMSO, soluzione finale 0,5 &micro; M</td></tr><tr><td>L-glutammina (L-glutammina)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-Glutammina (200 mM), soluzione madre 200 mM, soluzione finale 2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel (matrice extracellulare)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>matrice qualificata hESC, soluzione madre 18-22 mg/mL, soluzione finale 180-220 &; g/mL</td></tr><tr><td>Millicell-CM Inserto per piastra di coltura&nbsp; (0,4 &micro; m) (Inserto della piastra di coltura)</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-beta;-tubulina III</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8660&nbsp;</td><td>Diluizione 1/1000</td></tr><tr><td>MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (agitatore orbitale)</td><td>Major Science</td><td>MS-NRC-30</td><td></td></tr><tr><td>Integratori di N2 (N2)</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Per coltura GIC, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x</td></tr><tr><td>Nanodrop (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Interrotto</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal (Neurobasal)</td><td>Life Technologies / Gibco</td><td>21103049</td><td>Mantenimento e maturazione di popolazioni di cellule neuronali embrionali, aminoacidi non essenziali pronti all'uso</td></tr><tr><td> (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>Aminoacidi non essenziali 100X, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x</td></tr><tr><td>Anticorpo Nurr1 (M-196)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5568</td><td>1/100 diluizione</td></tr><tr><td>Nutristem&nbsp; (hESC medio )</td><td>Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Terreni per cellule staminali, pronti all'uso</td></tr><tr><td>Penicilina / Streptomicina&nbsp; (Penicilina / Streptomicina )</td><td>Life Technologies / Gibco</td><td>15140122</td><td>Per colture cellulari, soluzione madre 5 mg/mL, soluzione finale 50 & micro; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido perclorico 0,1N (HCLO4)</td><td>Merck</td><td>100519</td><td>Per HPLC, soluzione</td></tr><tr><td>salina tamponata con fosfato pronta all'uso senza Ca2+/Mg2+&nbsp; (PBS senza Ca2+/Mg2+)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td>Per la coltura cellulare, pronto all'uso</td></tr><tr><td>Kit PrimeScript RT-PCR (kit di trascrizione inversa)</td><td>Takara</td><td>RR014A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin (agonista levigato)</td><td>Calbiochem</td><td>SML0868</td><td>Per il protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 10 mM in DMSO, soluzione finale 2 &; </td></tr><tr><td>M Rho-associata chinasi Y-27632 (ROCK)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120129-1</td><td>Inibitore della roccia,&nbsp; soluzione madre 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 &; M</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit (kit di estrazione dell'RNA )</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542 (TGF&beta;/Activina/Inibitore nodale )</td><td>Ascent</td><td>Asc- 163</td><td>Dual-Smad,&nbsp; soluzione madre 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 &; M</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog (SHH)</td><td>Guida cellulare</td><td>GFH168-5</td><td>Per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 100 & micro; g/mL in H2O puro, soluzione finale 100 ng/mL</td></tr><tr><td>StemPro Accutase (soluzione enzimatica hESC)</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>soluzione enzimatica hESC, pronta all'uso</td></tr><tr><td>Simmetria C-18,5 mm (4,6 150mm2)&nbsp; (Colonna a fase inversa)</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pallone T150 (Pallone T150)</td><td>Falcon</td><td>08-772-1F</td><td></td></tr><tr><td>TH Anticorpo (F-11)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-25269</td><td>1/200 diluizione</td></tr><tr><td>Fattori di crescita trasformanti beta 3 (TGF&beta; 3)</td><td>Guida cellulare</td><td>GFH109-2</td><td>per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 100 &; micro; g/mL in etanolo puro, soluzione finale 1 ng/mL</td></tr><tr><td>Trichostatine A (inibitore dell'istone deacetilasi)</td> <td>Sigma</td><td>T8552</td><td>Per protocollo dopaminergico,&nbsp; soluzione madre 100 &; M in DMSO, soluzione finale 20 nM</td></tr><tr><td>TrypLE (soluzione enzimatica ricombinante)</td><td>Invitrogen</td><td>12604021</td><td>soluzione enzimatica ricombinante, pronta all'uso</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% (soluzione enzimatica)</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>soluzione enzimatica, pronta all'uso</td></tr><tr><td>W2100, Multi Channel Systems (sistema di acquisizione dati)</td><td></td><td>WAT045905</td><td></td></tr><tr><td>X-vivo (terreno privo di siero)</td><td>Lonza</td><td>BE04-743Q</td><td>terreno senza siero, pronto all'uso</td></tr></tbody></table>

organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

La mancanza di modelli neurali in vitro rilevanti è un ostacolo importante sul progresso medico per le neuropatologie. La creazione di modelli cellulari pertinenti è fondamentale sia per comprendere meglio i meccanismi patologici di queste malattie sia per identificare nuovi obiettivi e strategie terapeutiche. Per essere pertinenti, un modello in vitro deve riprodurre le caratteristiche patologiche di una malattia umana. Tuttavia, nel contesto della malattia neurodegenerativa, un modello in vitro rilevante dovrebbe fornire la sostituzione delle cellule neurali come una preziosa opportunità terapeutica.
Tale modello consentirebbe non solo lo screening di molecole terapeutiche, ma potrebbe anche essere utilizzato per ottimizzare la differenziazione del protocollo neurale [ad esempio, nel contesto del trapianto nella malattia di Parkinson (PD)]. Questo studio descrive due protocolli in vitro di 1) lo sviluppo del glioblastoma umano all'interno di un organoids neurale umano (NO) e 2) differenziazione neurone dopaminergico (DA) generando un organoide tridimensionale (3D). A questo scopo, è stato stabilito un protocollo ben standardizzato che consente la produzione di neurosfere calibrate in base alle dimensioni derivate dalla differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC). Il primo modello può essere utilizzato per rivelare eventi molecolari e cellulari che si verificano durante lo sviluppo del glioblastoma all'interno dell'organoid neurale, mentre l'organoid DA non solo rappresenta una fonte adatta di neuroni DA per la terapia cellulare nella malattia di Parkinson, ma può anche essere utilizzati per il test antidroga.

Le fasi critiche di questo protocollo devono essere ben identificate e gestite correttamente. Pertanto, un diagramma delle condizioni di coltura che indica il time-lapse per ogni passaggio, nonché i composti utilizzati per il protocollo di differenziazione sono illustrati nella figura 1A e nella figura 3A per gli organoid neurali NO più GBM e DA, rispettivamente. Figura 1B,C,D,E,F illustra le cellule, sfere, e NO e mostra la morfologia tipica per ogni passo. Figura1G,H,I illustra la colorazione dell'immunofluorescenza con alcuni marcatori neurali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig1.jpg"> Figura 1 : organoide neurale umano (NO) protocollo di differenziazione. (A) Protocollo standardizzato per la generazione di NO derivato da cellule staminali embrionali umane (hESC). (B) gli hESC sono mantenuti su matrice extracellulare nel mezzo hESC. (C) Le piastre di microwell sono state utilizzate per generare neurosfere calibrate. A 2 settimane, le neurosfere sono state placcate sull'inserto contenente una membrana PTFE (barra di scala n. 50 m). (D) Vista macroscopica di NO nell'inserto in un pozzo di una piastra 6 pozzo. Durante i primi giorni, le rosette sono state osservate (freccia nera) (E). (F) Vista macroscopica di una sfera NO più GIC in alto. (G-I) L'analisi dell'immunofluorescenza della sfera NO più GIC (EGFR-positivo; barra della scala - 50 m) (G) e NO da sola, che ha mostrato reattività immunitaria per il marcatore neuronaleIII-tubulina e leggermente positiva per la nestina; tuttavia, la sinapsi 1 ha mostrato un segnale debole (H,I) (barre di scala : 100 m e 50 m, rispettivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig2.jpg"> Figura 2 : Illustrazione di sfere necrotiche e NO immaturo. Le neurosfere (A) e NO (B) possono subire necrosi quando sono troppo numerose nel pozzo o sovradimensionate (C) (barra di scala 10 m). (D) Un GIC infettato da un giornalista di pomodoro aiuta a rintracciare l'invasione delle cellule tumorali in NO, barra della scala, 10 m. Esempio di NO immaturo con tubi neurali (E) e nessun tubo neurale (F) (barra di scala - 50m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig3.jpg"> Figura 3 : protocollo standardizzato per la generazione di organoide neurale DA e l'analisi elettrofisiologica e morfologica. (A) Protocollo standardizzato per la generazione di organoidi neurali DA. (B) Analisi dell'immunofluorescenza dell'organoide neurale DA; Le cellule TH-immunoreattive co-esprimono Nurr1, un marcatore specifico del midbrain (barra di scala - 50 m). I dati sono rappresentati come media : SEM (n - 3). (C) I grafici rappresentano la cinetica dell'espressione genica di TH e Nurr1 valutata da qRT-PCR. (D) Rappresentante HPLC: picco di dopamina (freccia) è stato rilevato da HPLC da LYsato organoide neurale DA. (E) Esempio di dati grezzi registrati con la piattaforma MEA. Ogni picco viene visualizzato da una linea verticale (timestamp), mentre la traccia rimanente è il rumore. (F) Immagine che rappresenta una neurosfera depositata sul MEA. (G) Superposizione dei picchi tipici (curve blu e rosse) rilevati dai dati grezzi. La curva nera in grassetto indica la media delle curve rosse corrispondenti. (H) Grafico raster che mostra gli indicatori di data e ora associati a ciascun picco rilevato. I diversi colori evidenziano i diversi elettrodi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>gene</td>
			<td>Foward</td>
			<td>fare retromarcia</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nurr1</td>
			<td>GGCTGAGAAGCCATCTCTGT</td>
			<td>GTGAGGTCCATGCTAACTTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th</td>
			<td>GCACCTTGCGCAGTTCT</td>
			<td>CCCGAACTCCACCGTGAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>EEF1</td>
			<td>AGCAAAAATGACCCACCAATG</td>
			<td>GCCTGGATGGTTCAGGATA</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAPDH</td>
			<td>GCACAAGAGAGAAGAAGAAACCACC</td>
			<td>AGGGGAGATTCAGTGTGGGGGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Primer utilizzati in questo protocollo.

Questo studio introduce e descrive protocolli per derivare due organoidi neurali umani specifici come un modello rilevante e accurato per lo studio 1) lo sviluppo del glioblastoma umano all'interno di organoidi neurali umani esclusivamente negli esseri umani e 2) neuronergico differenziazione generando un organoide tridimensionale.

Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

In medicina rigenerativa, un solido protocollo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti verso uno specifico tipo di cellula neurale è uno strumento prezioso. Nel nostro caso, questi protocolli sono stati molto utili per studiare sia lo sviluppo del glioblastoma che il morbo di Parkinson. Quindi, in primo luogo, la generazione di organoide tridimensionale ha il vantaggio di imitare da vicino lo sviluppo fisiologico, e anche la produzione di neurosfere calibrate dalle dimensioni da cellule staminali pluripotenti ha un'alta riproducibilità.La seguente procedura sarà dimostrata da Manon Locatelli, dottorando del nostro laboratorio. 24 ore prima di iniziare la coltura triD, sostituire il mezzo hESC con un mezzo privo di siero integrato con un inibitore ROCK a 10 micromolari. Le celle devono essere al 60% di confluenza.Il giorno dopo, staccare le colonie hESC come singole cellule rimuovendo il mezzo e risciacquando con PBS privo di calcio e magnesio. Quindi, aggiungere cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissoluzione e incubare a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Successivamente, raccogliere le cellule in mezzo privo di siero con inibitore ROCK 10 micromolare e centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, controllare le dimensioni del pellet cellulare. Rimuovere il supernatante e contare le cellule in 10 millilitri di mezzo privo di siero integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. In parallelo, sciacquare la piastra microwell con due millilitri di mezzo privo di siero per pozzo e centrifugare la piastra a 1.200 volte g per cinque minuti per rimuovere tutte le bolle al fine di prevenire la formazione di neurosfera.Successivamente, preparare 28,2 milioni di cellule in 12,5 millilitri di mezzo privo di siero integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. Erogare 1.000 cellule per microwell. Centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti e controllare la ripartizione omogenea delle cellule nella piastra del microwell al microscopio.Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, esaminare la piastra del microwell per controllare la dimensione delle sfere formate in ogni microwell. Trasferire le sfere su una piastra a sei porti utilizzando il mezzo integrato con un cocktail di inibizione dual-SMAD per promuovere una rapida induzione neurale.Da questo passo in avanti, le sfere sono coltivate in rotazione a 60 giri/min per evitare che si attacchino insieme o alla piastra. Dal primo al quarto giorno, cambia il mezzo ogni due o tre giorni prima di eseguire l'induzione neurale. Dal quarto all'11° giorno, promuovere la proliferazione delle rosette neurali derivate da hESC aggiungendo EGF e bFGF a 10 nanogrammi per millilitro al mezzo B27 integrato con cocktail dual-SMAD.Dal giorno 11 al 13, coltura le sfere in mezzo B27 integrate con inibitore BMP 0,5 micromolare. Dal giorno 13 al 21, coltura le sfere in mezzo B27 integrate con GDNF e BDNF a 10 nanogrammi per millilitro e un inibitore della gamma-secretasi micromolare. Il giorno 21, posizionare un inserto in una piastra di coltura in un unico pozzo di un nuovo piatto a sei pozzi.Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo B27 integrato con fattori di crescita e inibitori ad ogni pozzo sotto l'inserto della membrana. Successivamente, placcare le sfere su una membrana PTFE idrofila depositata su un inserto di piastra di coltura e cambiare il mezzo ogni due o tre giorni per le successive tre settimane di differenziazione. Interrompere la rotazione da questo passaggio.La presenza di rosette indica l'inizio della differenziazione neurale. Dal giorno 21 al 25, coltivare organoidi neurali umani nello stesso mezzo di maturazione neurale. Quindi, dal giorno 25 al 28, integrare solo il mezzo B27 con un inibitore della gamma-secretasi micromolare.Dal giorno 28 al 39, smetti di aggiungere l'inibitore della gamma-secretasi e continua la coltura organoide neurale umana solo nel mezzo B27. Dopo tre settimane, gli organoidi neurali sono pronti per l'uso per l'impianto GIC. Il giorno zero, amplificare gli HESC in impostazioni cultura two-D fino al 60% di confluenza.Quindi, sostituire il mezzo di cellule staminali utilizzato per mantenere le caratteristiche di pluripotenza degli hESC con un mezzo privo di siero contenente cocktail di inibizione dual-SMAD per iniziare l'induzione neurale e l'inibitore rock 10-micromolare per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio il giorno successivo. Il primo giorno, preparare la piastra microwell con 2,5 millilitri per pozzo di mezzo privo di siero contenente la stessa concentrazione di molecole di inibitore ROCK e doppia inibizione SMAD. Per differenziare le cellule verso il modello ventrale del tubo neurale, aggiungere SHH e FGF8 a 100 nanogrammi per millilitro e due micromolari levigati agonisti.Dopo aver aggiunto il mezzo, centrifugare la piastra a 1.200 volte g per cinque minuti per rimuovere le bolle d'aria dai microwell. Una volta che la piastra microwell è pronta per l'uso con mezzo mezzo di differenziazione, rimuovere il mezzo di hESC e lavare rapidamente con PBS privo di calcio e magnesio. Dissociare le colonie in una sospensione monoscheda aggiungendo 7,5 millilitri di soluzione enzimatica ricombinante in un pallone T75.Incubare le cellule per due minuti a 37 gradi Celsius e quindi aggiungere 7,5 millilitri di DMEM F12. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare e la centrifuga a 300 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e contare le cellule nello stesso mezzo utilizzato per preparare la piastra del microwell.Regolare il volume medio per ottenere una sospensione cellulare che consenta di formare neurosfere contenenti 1.000 cellule per microwell preparando 4,7 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo e aggiungendolo ai precedenti 2,5 millilitri di mezzo già collocati nella piastra. Per distribuire correttamente le cellule in ogni microwell, agitare delicatamente la piastra e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti. Successivamente, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore per generare sfere.Il secondo giorno, sciacquare delicatamente i microlitri con mezzo e trasferire le sfere in una piastra a sei pozzi trattata con tessuti. Posizionare le sfere in rotazione a 37 gradi Celsius e cambiare metà del mezzo con mezzo fresco ogni due o tre giorni. Dal terzo al 13° giorno, per migliorare l'induzione neurale e convertirsi in progenitori neurali con un'identità di midbrain, integrare il mezzo con inibitore GSK-3-beta a tre micromolari.Dividere il campione in due nuove piastre a sei pozzi trattate con tessuti per ridurre la densità della sfera ed evitare l'aggregazione della sfera. All'ottavo giorno, inizia la maturazione neurale passando a un nuovo mezzo con fattori di crescita e cambia il mezzo ogni due o tre giorni. Il giorno 21, posizionare un inserto in una piastra di coltura in un pozzo di una nuova piastra a sei porsi e aggiungere 1,2 millilitri di mezzo di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera sotto l'inserto della membrana.Quindi, deporre la membrana PTFE su un inserto di piastra di coltura. Infine, per generare l'organoide neurale, seminare circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido sulla membrana PTFE. Interrompere la rotazione da questo passaggio e cambiare il mezzo ogni due o tre giorni fino a raggiungere il punto di differenziazione richiesto.Ecco uno schema di un protocollo standardizzato per la generazione di organoidi neurali dopaminergici. L'analisi dell'immunofluorescenza degli organoidi neurali dopaminergici mostrata in queste immagini indica cellule immunoreattive TH coesprimendo Nurr1, un marcatore specifico del midbrain. Questi due grafici rappresentano la cinetica dell'espressione genica TH e Nurr1 valutata da RT-PCR quantitativo.Ecco un esempio di dati grezzi registrati con la piattaforma MEA. Ogni picco viene visualizzato da una linea verticale, mentre la traccia rimanente è rumore. E questa immagine rappresenta una neurosfera depositata sul MEA.Questi grafici mostrano la sovrapposizione dei picchi tipici rilevati dai dati grezzi. La curva grassetto nera indica la media delle curve rosse corrispondenti. Questo grafico raster mostra i timestamp associati a ogni picco rilevato.I diversi colori evidenziano i diversi elettrodi. Questi protocolli consentono al ricercatore di rispondere a domande sull'interazione delle cellule tumorali con organoide neurale e lo screening diretto con organoide dopaminergico.

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Il video dimostra un metodo per generare organoidi cerebrali umani da cellule staminali pluripotenti indotte. Mostra come la neurosfera formi uno strato neuroectodermico, che sopprime la formazione di altri strati germinali. Le neurosfere sono incorporate in una matrice di gel 3D e formano gemme neuroepiteliali. Quando vengono incubate con terreni organoidali, queste gemme neuroepiteliali si differenziano in specifiche regioni cerebrali, con conseguente formazione di organoidi cerebrali maturi.

Un metodo in vitro per generare organoidi cerebrali umani

In questo video, viene dimostrato un protocollo graduale per le cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali. Il metodo prevede l'induzione della formazione di rosette neuronali, seguita da una maturazione controllata e dalla coltura finale su una membrana idrofobica per ottenere organoidi neurali completamente sviluppati.

Differenziazione e maturazione di cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali

La modellazione dello sviluppo del cervello umano è stata ostacolata a causa della complessità senza precedenti del tessuto epiteliale neurale. Qui viene descritto un metodo per la generazione robusta di organoidi cerebrali per delineare gli eventi precoci dello sviluppo del cervello umano e per modellare la microcefalia in vitro.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

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In questo studio, forniamo una tecnica dettagliata per un sistema di coltura organoide corticale semplice ma robusto che utilizza colture hPSC standard prive di alimentatore. Questo è un protocollo rapido, efficiente e riproducibile per la generazione di organoidi che modellano aspetti della senescenza cerebrale in vitro.

Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro

Qui, descriviamo un protocollo per il trapianto e il tracciamento di cellule neurali marcate in organoidi cerebrali umani.

Un modello di organoide cerebrale umano di trapianto di cellule neurali

Qui, delineiamo un protocollo completo per la generazione e l'utilizzo di organoidi di glioblastoma ingegnerizzati in laboratorio (LEGO) per studiare le dipendenze genotipo-fenotipo e selezionare potenziali farmaci per il trattamento del glioblastoma.

Coltura di organoidi di glioblastoma ingegnerizzata in laboratorio e screening farmacologico

Pinzette plasmoniche e nanostrutture a cristalli fotonici sono mostrati utili per produrre miglioramenti nel controllo efficienza e l'orientamento ottico cattura micro-e nano-particelle.

L&#39;utilizzo di nanostrutture di cristallo plasmoniche e fotonici per Enhanced manipolazione micro e nanoparticelle

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Scopri i protocolli per generare organoidi neurali umani da cellule staminali pluripotenti per modellare il glioblastoma e la differenziazione dopaminergica. Questi metodi offrono una piattaforma riproducibile per studiare malattie neurologiche umane.

Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

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