Name: Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare lespressione proteica nel cervello del roditore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Scopri come quantificare l'espressione proteica nel cervello del roditore mediante immunohistochimica con fluorocromi near-infrared e scansione ad alta risoluzione. Questo protocollo semplificato permette di analizzare vie di segnalazione molecolare e marcatori cognitivi in regioni specifiche come l'ippocampo dorsale e l'amigdala.

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La ricerca in questo rapporto è stata finanziata da una sovvenzione bersaglio dai NIGMS (1P20GM103653) assegnato a DK.

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Delaware. Maschi Sprague Dawley ratti circa 55 – 75 giorni di età sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. estrazione del cervello e preparazione dei tessuti
<ol><li>Anestetizzare ratto con isoflurano in anestesia camera di induzione fino a quando il ratto non presenta più una risposta al piede pizzico.</li>
	<li>Sacrifica i ratti attraverso una rapida decapitazione usando una ghigliottina.</li>
	<li>Tagliare la pelle sul cranio posteriore a anteriore e chiaro dalla parte superiore del cranio.</li>
	<li>Utilizzare i ossivore per rimuovere con cautela la parte posteriore del cranio, e quindi utilizzando piccole forbici dissezione tagliare la linea mediana del cranio, spingendo verso l'alto contro la parte superiore del cranio in ogni momento per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.</li>
	<li>Utilizzare i ossivore per staccare la metà destra e sinistra del cranio per esporre il cervello.</li>
	<li>Utilizzare una piccola spatola per misurarsi sotto il cervello e recidere i nervi, elevare accuratamente cervello e congelare i cervelli in isopentano refrigerati su ghiaccio secco (almeno-20 ° c). Dopo questo, conservare i cervelli in un-80 ° c congelatore fino a affettare.</li>
	<li>Tagliare il cervello in regioni di interesse a 30 – 50 μm in un criostato mantenuto tra-9 ° c e-12 ° c. Montare direttamente le fette su vetrini di vetro e conservare in un congelatore-80 ° c fino al momento del saggio immunocitochimico. Nota: In questo protocollo le regioni cerebrali di interesse erano l'ippocampo e l'amigdala.</li>
</ol>2. singola reazione immunoistochimica
Nota: Per la doppia reazione immunoistochimica, il protocollo è lo stesso della singola reazione immunoistochimica, ad eccezione di questa reazione ha due anticorpi primari di diversi host (ad esempio, coniglio e topo) e due anticorpi secondari per il corrispondente primarie devono essere da un singolo ospite (ad esempio, antirabbit di capra e antimouse di capra). Gli anticorpi secondari devono essere anche da due diversi spettri che sono disponibili in scanner ad alta risoluzione. Ad esempio, un anticorpo secondario con un picco dello spettro di emissione a 680 Nm e un anticorpo secondario 800CW (picco dello spettro di emissione a 780 nm).
<ol><li>Rimuovere i vetrini di vetro dal congelatore e consentire di equilibrare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Sotto una cappa aspirante, fissare il tessuto cerebrale in 4% paraformaldeide in 0,1 M fosfato salina tamponata (PBS) per 1 − 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in 0,1 M di soluzione salina tampone (TBS) tre volte per 10 min ciascuno. Permeabilizzare le membrane cellulari incubando le diapositive in un detergente delicato (ad esempio, 0,01% di detergente) per 30 − 60 min.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in TBS tre volte per 15 min ciascuno.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario per la proteina di interesse in PBS nella concentrazione corretta. Per esempio, per rilevare l'immediato gene precoce c-fos, preparare un coniglio primario anti c-Fos anticorpo in una concentrazione di 1:500.</li>
	<li>Pipettare la soluzione di anticorpi primari direttamente sul tessuto cerebrale (circa 200 μL per slitta da 3 pollici x 1 pollice).</li>
	<li>Utilizzare i coprioggetti per incubare il tessuto cerebrale su vetrini in diluizione degli anticorpi primari per 1 − 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte (~ 17 h) a 4 ° c.</li>
	<li>Rimuovere i coprioggetti e lavare i vetrini in TBS che ha una piccola quantità di detergente aggiunto (ad esempio, 0,01% detergente, "TBS-T") quattro volte per 15 min ciascuno.</li>
	<li>Utilizzare coprioggetti per incubare le sezioni cerebrali in un anticorpo secondario a temperatura ambiente per 2 h. Nota: L'anticorpo secondario deve essere alla diluizione corretta e in un diluente contenente TBS, detergente e 1,5% di siero ospite. Ad esempio, un anticorpo secondario di capra in una diluizione di 1:2000 conterrebbe 1,5% di siero di capra e 0,05% detergente.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in TBS-T quattro volte per 20 min ciascuno, e poi in TBS quattro volte per 20 min ciascuno.</li>
	<li>Scivoli asciutti a temperatura ambiente nel buio durante la notte. Quando le diapositive sono asciutte, sono pronte per l'imaging.</li>
</ol>3. l'imaging
<ol><li>Posizionare le diapositive sull'interfaccia di scansione vicino all'infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso. Un'immagine una diapositiva di vetro o più diapositive alla volta utilizzando uno strumento di selezione.</li>
	<li>Immagini diapositive utilizzando l'impostazione di alta qualità con un offset di 0 Nm e una risoluzione di 21 μm. La scansione in genere prenderà 13 − 19 h a seconda dell'apparecchiatura di scansione utilizzata.</li>
	<li>Importare immagini nel software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageStudio) per visualizzare e contrassegnare l'analisi delle proteine semi-quantitative.</li>
</ol>4. analisi dell'espressione proteica
<ol><li>Aprire il software di analisi delle immagini e selezionare l' area di lavoro in cui è stata acquisita l'immagine.</li>
	<li>Aprire l'immagine acquisita nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda visualizzate, nonché il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento mostrati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione quantificata totale.</li>
	<li>Identificare le aree chiave per la quantificazione e selezionare la scheda analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare Disegna rettangolo (o Disegna ellisse/disegna mano libera) per disegnare un rettangolo sull'area che sarà quantificato.</li>
	<li>Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare forme lungo la parte inferiore sinistra dello schermo, quindi selezionare colonne lungo in basso a destra. Aggiungere colonne altezza e larghezza per identificare la dimensione della forma. Nota: È importante controllare la dimensione della forma quando si confronta la quantificazione. Si consiglia di utilizzare forme identiche collocate all'interno della posizione di quantificazione desiderata, al fine di ottenere un campionamento accurato delle emissioni per quella regione.</li>
	<li>Quindi denominare la forma e ripetere. Una volta che tutte le regioni sono campionati i dati disponibili dalla scheda colonne possono essere aggregati e analizzati.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I risultati presentati in questo articolo dimostrano che l'immunocitochimica vicino all'infrarosso in combinazione con la scansione ad alta risoluzione può essere utilizzata per ottenere misure semi-quantitative dell'espressione proteica nel tessuto cerebrale. Può anche essere usato per etichettare due proteine contemporaneamente nella stessa regione del cervello. In precedenza abbiamo usato immunoistochimica vicino all'infrarosso per misurare l'immediata espressione genica precoce in più regioni cerebrali<sup class="xre...

Lo studio della neuroscienza riguarda un'indagine su come le cellule nel cervello mediano funzioni specifiche1. Questi possono essere di natura cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule glia conferiscono immunità nel sistema nervoso centrale o possono coinvolgere esperimenti che mirano a spiegare come l'attività dei neuroni nell'ippocampo dorsale conduce alla navigazione spaziale. In senso ampio, la funzione cellulare è determinata dalle proteine che si esprimono in una cellula e dall'attività di queste proteine2. Di conseguenza, la misurazione dell'espressione e/o dell'attività delle proteine nelle cellule cerebrali è critica per lo studio delle neuroscienze.
Una serie di tecniche sono disponibili per misurare l'espressione proteica nel cervello. Questi includono metodi in vivo come la topografia di emissione di positroni per le densità dei recettori3 e la microdialisi per i piccoli peptidi4. Più comunemente, i metodi ex vivo vengono utilizzati per esaminare la funzione e l'espressione delle proteine. Questi includono tecniche di spettrometria di massa5, Western blot e saggio immunosorbente legato all'enzima (ELISA)6e immunocitochimica7. L'immunocitochimica è ampiamente utilizzata nel campo delle neuroscienze. Questa tecnica prevede l'uso di un anticorpo primario per rilevare una proteina (o antigene) di interesse (ad esempio, c-fos) e un anticorpo secondario coniugato per rilevare il complesso di anticorpi proteina-primario (Figura 1). Per consentire il rilevamento del complesso anticorpale-anticorpo primario-derivato di proteina-primaria, gli anticorpi secondari hanno agenti ossidanti come la perossidasi di rafano (HRP) coniugato a loro. Questo permette la formazione di precipitati in cellule che possono essere rilevati utilizzando la microscopia leggera7. Gli anticorpi secondari possono anche avere prodotti chimici fluorati coniugati (cioè fluorofori). Quando stimolato queste sostanze chimiche emettono luce, che può essere utilizzato per rilevare proteina-primario anticorpo-anticorpi secondari complessi7. Infine, a volte gli anticorpi primari hanno agenti riducenti e sostanze chimiche a fluorescenza attaccate direttamente negando la necessità di anticorpi secondari7 (Figura 1).
È interessante notare che, molti metodi di immunocitochimica consentono la visualizzazione delle proteine nelle cellule cerebrali, ma non la capacità di quantificare la quantità di proteine in una regione specifica della cellula o del cervello. Utilizzando la microscopia leggera per rilevare i precipitati dalle reazioni di riduzione consente la visualizzazione di neuroni e glia, ma questo metodo non può essere utilizzato per quantificare l'espressione proteica nelle cellule o in una specifica regione del cervello. In teoria, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per questo, perché la luce emessa dall'anticorpo secondario fluorescente è una misura del complesso anticorpale-anticorpo primario-secondario proteina-primaria. Tuttavia, l'autofluorescenza nel tessuto cerebrale può rendere difficile l'uso della microscopia a fluorescenza per quantificare l'espressione proteica nel tessuto cerebrale8. Di conseguenza, la luce emessa dalle immagini fluorescenti del tessuto cerebrale è raramente utilizzata per quantificare l'espressione proteica nel cervello.
Molti di questi problemi possono essere affrontati utilizzando immunocitochimica Near-Infrared in combinazione con scansione ad alta risoluzione9,10. In questo articolo descriviamo come l'immunocitochimica accoppiata con i fluorofori negli spettri di emissione Near-Infrared può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione (ad esempio, 10 – 21 μm) per ottenere immagini nitide che consentano la semi quantificazione delle proteine in distinte regioni cerebrali.

<table><tbody>Camera di <tr><td>induzione per anestesia</td> per estrazione <td></td><td></td> cerebrale Kent Scientific VetFlo-0530SM <td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>utilizzato per rimuovere la parte posteriore del cranio</td></tr><tr><td></td> Forbici da dissezione delicate Fischer Scientific 08-951-5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>utilizzato per tagliare verso l'alto lungo la linea mediana del cranio</td></tr><tr><td>Micro Spatola</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>utilizzato per estrarre il cervello</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Reazione</td><td></td><td></td><td></td> immunoistochimica</tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Utilizzato come detergente delicato per permeabilizzare le cellule dopo il fissaggio in Paraformaldeide, utilizzato anche come detergente delicato in combinazione con siero ospite e anticorpi secondari.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Utilizzato come una piccola quantità di detergente aggiunto a TBS&nbsp; per produrre TBS-T dopo vetrini coprioggetto con anticorpo primario</td></tr><tr><td>Licor Odyssey scanner</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Studio Immagine:</td><td>Licor Biotecnologia, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo della fluorescenza near-infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

La neuroscienza è lo studio di come le cellule nel cervello mediare varie funzioni. Misurare l'espressione proteica nei neuroni e nella glia è fondamentale per lo studio delle neuroscienze poiché la funzione cellulare è determinata dalla composizione e dall'attività delle proteine cellulari. In questo articolo, descriviamo come l'immunocitochimica può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso per fornire una misura semi-quantitativa di espressione proteica in regioni cerebrali distinte. Questa tecnica può essere utilizzata per un'espressione proteica singola o doppia nella stessa regione cerebrale. La misurazione delle proteine in questo modo può essere utilizzata per ottenere un cambiamento relativo nell'espressione proteica con una manipolazione sperimentale, la firma molecolare dell'apprendimento e della memoria, l'attività nei percorsi molecolari e l'attività neurale in diverse regioni cerebrali. Utilizzando le proteine corrette e l'analisi statistica, è possibile determinare anche la connettività funzionale tra le regioni cerebrali. Data la facilità di implementazione di immunocitochimica in un laboratorio, utilizzando l'immunocitochimica con scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso può espandere la capacità del neuroscienziato per esaminare i processi neurobiologici a livello di sistemi.

Prima di utilizzare la scansione ad alta risoluzione per l'immunoistochimica, si dovrebbe verificare che il protocollo funzioni. Questo può essere realizzato utilizzando un saggio di validazione in cui le sezioni cerebrali dello stesso animale sono incubate con anticorpi primari e secondari, anticorpo secondario da solo, o nessun anticorpo primario o secondario. I risultati di tale saggio di convalida sono illustrati nella Figura 2. In questa reazione stavamo...

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Questo protocollo è significativo perché consente la quantificazione di due proteine nella stessa regione cerebrale. Questo permette allo sperimentatore di guardare l'attività nelle vie di segnalazione molecolare nelle regioni cerebrali saggiando pan e fosfoproteine. Può anche essere usato per saggiare proteine che sono marcatori di diversi fenomeni cognitivi.Stiamo usando una tecnica relativamente semplice, come l'immunoistochimica, per rispondere a domande che in genere richiedono tecniche più coinvolte. Compreso l'esame dell'attività delle vie di segnalazione molecolare, l'esame del rapporto AMPA/NMDA. Utilizzando un criostato mantenuto tra meno 9 gradi Celsius e meno 12 gradi Celsius, tagliare il cervello di ratto precedentemente isolato e congelato in regioni di interesse a 30-50 micrometri.Montare direttamente le fette su vetrini e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'immunocitochimica. Rimuovere i vetrini dal congelatore e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavorando sotto una cappa aspirante, posizionare gli scivoli in paraformaldeide al 4% in PBS molare da una a due ore a temperatura ambiente per la fissazione dei tessuti.Quindi sciacquare le diapositive in 0,1 TBS molare tre volte per 10 minuti ciascuna. Per permeabilizzare le membrane cellulari, incubare le diapositive in un detergente delicato per 30-60 minuti. E risciacquare di nuovo in TBS tre volte per 15 minuti ciascuno.Diluire l'anticorpo primario per proteine di interesse per pbs nella corretta concentrazione come descritto nel manoscritto. Soluzione di anticorpi primari pipetta direttamente sul tessuto cerebrale. Posizionare gli scivolamenti di copertura sulle diapositive e incubare il tessuto cerebrale nella diluizione degli anticorpi primari per 1-2 ore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, rimuovere le foglietti di copertura e lavare gli scivoli in TBS che ha una piccola quantità di detergente aggiunto, quattro volte per 15 minuti ciascuno. Diluire l'anticorpo secondario in un diluente contenente TBS, detergente e l'1,5% del siero ospite. Aggiungere anticorpi secondari alle diapositive, coprire con scivolamenti di copertura e incubare a temperatura ambiente per due ore.Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in TBS-T quattro volte per 20 minuti ciascuna e quindi in TBS quattro volte per 20 minuti ciascuna. Asciugare gli scivoli a temperatura ambiente al buio, durante la notte. Posizionare le diapositive sull'interfaccia di scansione del vicino infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso.Immagini più diapositive alla volta usando lo strumento di selezione. Immagini le diapositive utilizzando l'impostazione di altissima qualità con una risoluzione di 21 micrometri. In un offset di zero nanometri, importare immagini nel software di analisi delle immagini per visualizzare e contrassegnare per l'analisi semiquantitativa delle proteine.Dopo aver aperto il software di analisi delle immagini, selezionare l'area di lavoro in cui è stata digitalizzata l'immagine. Quindi apri l'immagine digitalizzata nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda, il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento mostrati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione quantificata totale. Dopo aver identificato le aree chiave per la quantificazione, selezionare la scheda analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare disegna rettangolo per disegnare un rettangolo sull'area che verrà quantificata.Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare le forme in basso a sinistra dello schermo. Quindi selezionare le colonne in basso a destra. Aggiungere quindi colonne di altezza e larghezza per identificare le dimensioni della forma.Infine, denominare la forma e ripetere. Una volta campionare tutte le aree, procedere con la combinazione e l'analisi dei dati disponibili nella scheda colonne. Per verificare che questo protocollo funzioni, le sezioni cerebrali sono state incubate con anticorpi primari e secondari, solo anticorpi secondari o né anticorpi primari né secondari.L'espressione precoce del gene c-jun immediato è stata rilevata nell'ippocampo dorsale e nell'amigdala solo quando gli anticorpi primari e secondari sono stati applicati al tessuto cerebrale. La sotto-unità GluR1 del recettore AMPA e la sotto-unità NR2A del recettore NMDA sono state testate nel rilevamento delle proteine delle feci nei nuclei di amigdala. Ciò ha permesso di esaminare il rapporto dei recettori NMDA AMPA nei sotto-nuclei dell'amigdala che è una firma neurobiologica dell'apprendimento e della memoria.Misure media e normalizzate dell'espressione proteica sono state ottenute da scansioni ad alta risoluzione nell'ippocampo ventrale. Utilizzando il software di analisi delle immagini, un rettangolo viene posizionato nella regione di interesse e l'intensità media della luce dalla forma è stata utilizzata come misura dell'espressione del fluoroforo, che è una misura dell'espressione proteica. Per ottenere la curva normalizzata, una forma è stata posizionata attraverso una regione che esprime un segnale elevato e un segnale basso nell'area sotto la curva è stata utilizzata come misura dell'espressione proteica.La più grande lotta con questa procedura è trovare un anticorpo e assicurarsi che funzioni. L'applicazione è semplice. Il mio consiglio sarebbe quello di tentare prima una normale procedura immunoistochimica, poi provare questa tecnica.Eseguire sempre prima un test di convalida. La cosa più importante da ricordare è controllare la diluizione degli anticorpi e assicurarsi che sia applicata correttamente. Senza questi passaggi, la procedura fallirà.

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di una fetta di cervello di topo per quantificare la distribuzione di una specifica proteina presinaptica. Il processo prevede il blocco di siti aspecifici, l'applicazione di anticorpi primari per la proteina bersaglio e un marcatore di riferimento, seguiti dalla marcatura degli anticorpi secondari e dalla controcolorazione nucleare. Il marcatore di riferimento garantisce una quantificazione accurata fornendo una linea di base coerente...

Quantificazione della distribuzione di una proteina presinaptica nel cervello di topo mediante immunofluorescenza

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. Utilizzo della fluorescenza nel vicino infrarosso e della scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione delle proteine nel cervello dei roditori. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra una fluorescenza nel vicino infrarosso e un metodo di scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore.

Misurazione dell'espressione proteica nel cervello dei roditori mediante fluorescenza nel vicino infrarosso e scansione ad alta risoluzione 

Fonte: Lacin, E., et al. Costruzione di reporter ingegnerizzati fluorescenti per neurotrasmettitori cellulari (CNiFER) per il rilevamento ottico di neurotrasmettitori in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica per l'imaging del rilascio di neurotrasmettitori in vivo utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti di neurotrasmettitori basati su cellule (CNiFER), cellule reporter specializzate pre-iniettate nella corteccia del topo. Posizionato sotto un microscopio a due...

Imaging del rilascio di neurotrasmettitori utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti con neurotrasmettitore basato su cellule

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la tecnica di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare tipi specifici di cellule neurali per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dei marcatori epigenetici e/o dell'espressione proteica.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

La sintesi proteica è un processo biologico critico per le cellule. Nel cervello, è necessario per le modifiche adattive. La misurazione dei tassi di sintesi proteica nel cervello intatto richiede un'attenta considerazione metodologica. Qui presentiamo il metodo autoradiografico quantitativo L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali in vivo.

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Scopri come quantificare l'espressione proteica nel cervello del roditore mediante immunohistochimica con fluorocromi near-infrared e scansione ad alta risoluzione. Questo protocollo semplificato permette di analizzare vie di segnalazione molecolare e marcatori cognitivi in regioni specifiche come l'ippocampo dorsale e l'amigdala.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare lespressione proteica nel cervello del roditore (Video) | JoVE Journal

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

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