Name: Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara la miografia a filo per valutare la tensione isometrica delle arterie mesenteriche di topi, analizzando il ruolo del tessuto adiposo perivascolare nella modulazione della reattività vascolare e nelle malattie cardiovascolari.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni del Research Grant Council di Hong Kong [17124718 e 17121714], dal fondo di ricerca sanitaria e medica di Hong Kong [13142651 e 13142641], dal fondo di ricerca collaborativa di Hong Kong [C7055-14G] e dal National Basic Programma di ricerca della Cina [973 programma 2015CB553603].

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Oltre alle cellule endoteliali, i segnali derivati da PVAT giocano un ruolo importante nella regolazione della reattività del tono muscolare liscio30. Sana pvat rilascia No e anti-infiammatori adiponectina per esercitare un effetto anti-contrattile sulle arterie, che si perde in condizioni patologiche come l'obesità e la sindrome metabolica31,32. Negli Stati di malattia, la pvat contribuisce allo sviluppo della disfunzione endoteliale e di...

Le dilatazioni e le costrizioni delle arterie sono raggiunte da rilassanti e contrazioni, rispettivamente, delle loro cellule muscolari lisce vascolari. I cambiamenti nella reattività vascolare delle piccole arterie contribuiscono alla regolazione omeostatica della pressione arteriosa da parte dei nervi autonomici e degli ormoni presenti nel sangue (ad esempio, catecolamine, angiotensina II, serotonina, vasopressina). A livello locale, le risposte vascolari delle cellule muscolari lisce sono modulate dai segnali provenienti sia dalle cellule endoteliali dell'intima che dal tessuto adiposo che circonda le arterie (Figura 1).
L'endotelio non è solo una barriera passiva, ma funge anche da superficie per scambiare segnali tra il sangue e le cellule muscolari lisce vascolari sottostanti. Rilasciando varie sostanze vasoattive, l'endotelio svolge un ruolo critico nel controllo locale delle risposte di tono vascolare1. Ad esempio, in risposta all'acetilcolina, l'ossido nitrico sintasi (eNOS) endoteliale viene attivato nell'endotelio per produrre ossido nitrico (no), che induce il rilassamento del muscolo liscio vascolare sottostante attivando guanil ciclasi solubile (SGC) 2. altre sostanze vasoattive includono i prodotti di cicloossigenasi (ad esempio, prostaciclina e trombossano a2), lipossigenasi (ad es., 12-idrossietilosatetraenoico, 12-HETE) e monoossigenasi del citocromo P450 (HETEs e acido epoxyeicosatrienoico, S.e.t.), specie reattive dell'ossigeno (ROS) e peptidi vasoattivi (ad es., endothelin-1 e angiotensina II), e fattori iperpolarizzanti derivati dall'endotelio (EDHF)3. Un delicato equilibrio tra vasodilatatori e vasocostrittori derivati dall'endotelio mantengono il tono vasomotore locale4,5.
La disfunzione endoteliale è caratterizzata dalla compromissione dell'endothelio-dipendente vasodilatazione6, un segno distintivo di invecchiamento vascolare7. Con l'età, la capacità di endotelio per promuovere la vasodilatazione è progressivamente ridotta, dovuto in gran parte a una diminuzione della biodisponibilità NO, così come l'espressione anormale e la funzione di eNOS nell'endotelio e sGC nelle cellule muscolari lisce vascolari8 , 9 il , 10. riduzione della biodisponibilità non potenzia la produzione di vasocostrittori dipendenti dall'endotelio11,12. Nelle arterie invecchiate, la disfunzione endoteliale provoca iperplasia nei media, come riflessa dai marcati aumenti dello spessore della parete, numero di nuclei mediali, che ricordano l'ispessimento arterioso nell'ipertensione e l'aterosclerosi osservata negli esseri umani pazienti13,14. Inoltre, le condizioni fisiopatologiche come l'obesità, il diabete o l'ipertensione accelerano lo sviluppo della disfunzione endoteliale15,16.
Tessuto adiposo perivascolare (pvat) rilascia numerosi adipochine per regolare la struttura vascolare e la funzione17. L'effetto anti-contrattile di pvat è mediato da fattori rilassanti, come adiponectina, no, perossido di idrogeno e solfuro di idrogeno18,19,20. Tuttavia, a seconda della posizione e della condizione patofisiologica, PVAT può anche migliorare le risposte contrattili in varie arterie21. Le sostanze pro-contrattili prodotte da pvat includono l'angiotensina-II, la leptina, la resistina e la Ros22,23.  Nella maggior parte degli studi sui vasi sanguigni isolati, il PVAT è stato considerato come un semplice supporto strutturale per la vascolarizzazione e quindi rimosso durante la preparazione dei segmenti di anello dei vasi sanguigni. Poiché la disfunzione adiposa rappresenta un fattore di rischio indipendente per l'ipertensione e le complicanze cardiovascolari associate24, il pvat che circonda i vasi sanguigni deve essere considerato quando si studia la reattività vascolare di diverse arterie.
I sistemi di miografo multifilo sono stati ampiamente utilizzati per indagare le funzioni vasomotore di una varietà di vasi sanguigni, tra cui l'aorta, mesenterica, renale, femorale, cerebrale e arterie coronarie25,26. I protocolli qui descritti utilizzeranno la Miografia dei fili per valutare la reattività vascolare nelle arterie mesenteriche isolate da modelli murini geneticamente modificati, con particolare attenzione alla modulazione da parte di PVAT.

<table><tbody><tr><td>Acetilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td><forte>Concentrazione di riserva</forte>: 10-1 M <forte>Concentrazione di lavoro</forte>: da 10-10 a 10-5 M</td></tr><tr><td>L-NAME (estere metilico N&omega;-nitro-L-arginina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td>Concentrazione di base: 3 x 10-2 M Concentrazione di lavoro: 10-4 M</td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126</td><td>Concentrazione di stock: 10-2 M Concentrazione di lavoro: da 10-10 a 10-5 M</td></tr><tr><td>U46619 (9,11-dideossi-9&alfa;,11&alfa; metanoepoxy prostaglandina F2&alfa;)</td><td>Enzo</td><td>BML-PG023-0001</td><td>Concentrazione stock: 10-5 M Concentrazione di lavoro: 1-3 x 10-8</td></tr><tr><td>M Miografo</td><td>multifilo Danish MyoTechnology (DMT)</td><td>620M</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/26</td><td>ADInstruments</td><td>ML848</td><td></td></tr><tr><td>Labchart7</td><td>ADInstruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Adipo-SIRT1 topi wild type</td><td>Unità di animali da laboratorio, Università di Hong Kong</td><td>CULATR NO.: 4085-16</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri rivestite in silicone</td><td>Danish MyoTechnology (DMT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fili di tungsteno</td><td>Danish MyoTechnology (DMT)</td><td>300331</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Alterazione del tono vascolare reattività agli stimoli fisiopatologici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di malattie cardiovascolari e metaboliche. La disfunzione endoteliale rappresenta un grave colpevole per la ridotta vasodilatazione e una maggiore vasocostrizione delle arterie. Adiposo (grasso) tessuti che circondano le arterie svolgono ruoli importanti nella regolazione del rilassamento endotelio-dipendente e/o contrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. I colloqui incrociati tra l'endotelio e i tessuti adiposi perivascolare possono essere valutati ex vivo utilizzando vasi sanguigni montati da un sistema di Miografia a filo. Tuttavia, dovrebbero essere stabilite impostazioni ottimali per le arterie derivate da animali di diverse specie, età, background genetici e/o condizioni fisiopatologiche.

Esame delle relazioni di lunghezza/tensione per ottenere il fattore di normalizzazione k
La quantità di tratto applicato a un segmento di vaso influenza l'entità dell'interazione actina-miosina e quindi la forza attiva massima sviluppata. Così, per ogni tipo di vaso sanguigno, determinare la quantità di tratto necessario per la massima forza attiva è necessaria per gli studi di Miografia corretta. Qui, ...

Il protocollo descrive l'uso della Miografia dei fili per valutare la tensione isometrica transmurale delle arterie mesenteriche isolate dai topi, con particolare attenzione alla modulazione da fattori rilasciati da cellule endoteliali e tessuti adiposi perivascolare.

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

È necessario un protocollo molto rigoroso in modo da poter confrontare validamente i preparati degli stessi animali o di diversi animali o arterie in presenza o assenza del grasso che li circonda o in presenza o assenza dell'endotelio. Il vantaggio principale di questa tecnica sperimentale è che possiamo confrontare anelli della stessa arteria in condizioni isometriche e quindi trarre validamente conclusioni sull'impatto dei fattori sperimentali che studiamo. Questo protocollo fornisce approfondimenti sulla modulazione della reattività vascolare da parte dei tessuti adiposi perivascolari di diversi animali geneticamente modificati.Le disfunzioni del tessuto adiposo rappresentano un fattore di rischio indipendente per l'ipertensione e le relative complicanze cardiovascolari. Il nostro miografo prevede più passaggi complicati che richiedono estrema cautela in ogni punto per evitare di danneggiare la nave, specialmente durante il montaggio, e per garantire che la nave risponda in modo appropriato a vari stimoli. Iniziare questa procedura con i preparativi e la dissezione degli anelli arteriosi mesenterici come descritto nel protocollo di testo.Accendere il computer e aprire il software di registrazione dati. Salvare l'esperimento come file di dati del grafico lab con un nuovo nome per evitare di sovrascrivere il file di impostazione originale. Aprire la finestra delle impostazioni di normalizzazione e impostare il fattore K su uno.Accettare i valori predefiniti per la calibrazione degli IP, la pressione di destinazione, il tempo medio online e il tempo di ritardo. Fare clic su OK per salvare le impostazioni. Selezionare i canali di interesse e inserire il diametro del filo, i punti finali dei tessuti e la lettura iniziale del micrometro nella finestra di normalizzazione.Per avviare la procedura di normalizzazione, applicare il primo tratto passivo al vaso sanguigno ruotando la vite del micrometro in senso antiorario. Dopo aver atteso tre minuti per la stabilizzazione della nave, inserire la nuova lettura del micrometro nella finestra di normalizzazione. La tensione della parete viene calcolata automaticamente e visualizzata come punto sul grafico.Dopo ogni allungamento passivo, sostituire il tampone krebs di controllo con un krebs iso-osmotico ad alto potassio contenente 150 cloruro di potassio millimolare. Quando la contrazione raggiunge un plateau a circa tre minuti, registrare la forza attiva sottraendo la forza passiva ad ogni tratto dalla forza attivata dal potassio. Calcola la tensione della parete e i valori di circonferenza interna.Rimuovere l'elevata condizione di potassio sostituendo l'alto tampone di potassio con un tampone di krebs fresco. Ripetere il lavaggio per tre volte più di cinque minuti. Ripetere i passaggi di normalizzazione inducendo tratti passivi seguiti da contrazione attiva in curve alternative fino a quando la tensione attiva inizia a diminuire.Lavare accuratamente l'alto tampone di krebs di potassio ed equilibrare i preparati per altri 30-45 minuti. Reimpostare le tensioni basali a zero in modo che durante l'esperimento successivo venga registrata solo le risposte a contrattili attive. Preparare e montare anelli arteriosi accoppiati come descritto nel protocollo di testo dalle sezioni adiacenti di ogni arteria.Preparare un anello arterioso con PVAT intatto e l'altro con PVAT rimosso. Dopo la normalizzazione, precontrattuare i segmenti arteriosi con tampone di krebs ad alto potassio aggiungendo 115 millimolare soluzione di cloruro di potassio alla camera contenente krebs. Dopo la contrazione al periodo dell'altopiano, lavare l'alto potassio e sostituire il tampone con un tampone di krebs fresco aerato.Ripetere il lavaggio tre volte in cinque minuti. Ripetere la stimolazione e il lavaggio del cloruro di potassio tre volte e registrare la massima risposta contrattile al cloruro di potassio sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione del cloruro di potassio. Dopo l'ultima contrazione e lavaggio, riempire la camera con tampone di krebs caldo e aerato e lasciare che l'arteria si riprenda per circa 30 minuti prima di eseguire l'attività successiva.Ad ogni camera, aggiungere quantità cumulative di fenilefrina per indurre gli aumenti dipendenti dalla concentrazione e la tensione isometrica dei preparati quiescenti. Dopo aver aggiunto l'ultima dose di agonista, lavare accuratamente il farmaco e riempire la camera con un tampone di krebs fresco. Tracciare le risposte dipendenti dalla concentrazione come percentuali crescenti delle contrazioni massime indotte dal cloruro di potassio.Per valutare il contributo dell'ossido nitrico, incubare i preparati con l'inibitore dell'ossido nitrico sintasi L-NAME per 30 minuti prima dell'aggiunta di fenilefrina. Per eseguire una seconda curva di risposta alla concentrazione in sequenza, lavare la camera completamente e ripetutamente per rimuovere tutti gli agonisti precedenti fino a quando non si osservano ulteriori cambiamenti di tono. La normalizzazione della relazione lunghezza-tensione è stata eseguita per le arterie mesenteriche isolate dai modelli di topi alimentati con chow standard o una dieta ricca di grassi.Una relazione passiva lunghezza-tensione è stata stabilita dallo stiramento incrementale dei segmenti dell'arteria fino a ottenere una circonferenza interna corrispondente a 100 millimetri di pressione transmurale di mercurio, o IC100. Dopo ogni tratto, è stato applicato 115 cloruro di potassio millimolare per stimolare le contrazioni. Le curve di tensione della lunghezza attiva sono state tracciate dai dati di forza attiva sull'asse Y e dai valori IC calcolati dai dati del micrometro sull'asse X.Un valore IC che si trova all'interno dell'altopiano di picco è IC1. Il fattore di normalizzazione, K, è stato calcolato come rapporto tra IC1 e IC100, che potrebbe quindi essere applicato a campioni dello stesso tipo di recipiente nell'esperimento successivo. Di seguito sono riportate le registrazioni in uscita delle risposte vasocostrittore alla fenilefrina nelle arterie mesenteriche con o senza PVAT circostante.Concentrazioni cumulative di fenilefrina sono state applicate per stimolare le contrazioni delle arterie mesenteriche raccolte da un topo adiposet di 16 settimane fa. Le risposte contrattili sono state registrate e calcolate in percentuale della contrazione massima indotta da cloruro di potassio millimolare. L'area sotto le curve di contrazione è stata tracciata per il confronto.Si noti che il PVAT dell'adiposet di un topo ha suscitato un effetto anti-contrattile sulla risposta alla fenilefrina. Quando si ottengono contrazioni indotte da KCL, le risposte devono essere stabili e stabili. Se la risposta è ancora in aumento dopo tre amministrazioni incrementali di KCL, potrebbe essere necessaria la stimolazione KCL.Per ottenere condizioni ottimali delle tensioni, la fase di normalizzazione è molto importante, in quanto determina la forza per aprire i vasi sanguigni. Se non viene fatto correttamente, influenzerà l'intero esperimento. Questo protocollo può essere applicato ad altre impostazioni oltre alla contrazione o al rilassamento indotti dalla fenilefrina.Ad esempio, in presenza o assenza di tessuto adiposo perivascolare, nervi autonomici o endotelio. Con questo protocollo, i ricercatori possono esaminare piccoli vasi sanguigni da modelli animali masi in diverse condizioni fisiopatiche, come obesità, diabete e malattie cardiovascolari.

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Un metodo myography automatizzato per misure di forza in arterie mesenteriche isolato è descritto. Si avvale di un Mulvany-Halpern miografo filo doppio Auto 510A per determinare le risposte a fenilefrina e calcio extracellulare. Il metodo permette la determinazione costante di risposte isometrica per agonisti in piccoli vasi di diametro di 60-300 micron, in modo indipendente.

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Myography pressione è utilizzato per valutare vasoactivity di piccole arterie che si sviluppano costrizione sostenuta quando sotto pressione. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare in segmenti isolati di piccole arterie mesenterici di ratto, vasoactivity e l'effetto della pressione intraluminale del diametro vascolare.

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

L'intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l'assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

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Combinato di microscopia Intravital e l'ecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina

Videomicroscopia sistemi sono utilizzati per esaminare le proprietà funzionali delle arteriole del tessuto adiposo isolato in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare microvascolari fenotipi in domini differenti del tessuto adiposo in esseri umani obesi.

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Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare (Video) | JoVE Journal

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

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