Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Questo protocollo descrive un metodo per riprogrammare il sangue e le cellule mononucleari in cellule staminali neurali che possono essere utilizzate per trattare malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson. Offre una fonte di cellule autologhe per trattare le malattie neurodegenerative. Inoltre, il periodo di tempo necessario per la conversione in cellule staminali neurali indotte e la differenziazione ai tipi di cellule desiderate è più breve rispetto alle cellule staminali pluripotenti indotte.

Le cellule staminali neurali indotte possiedono una buona capacità proliferativa e possono essere scalate prima dell'applicazione. Poiché gli iNSC possono essere specificati in diverse cellule neurali specifiche della regione, come neuroni del midollo spinale o motoneuroni, questo metodo può essere esteso per il trattamento di altre malattie neurologiche. L'intera procedura richiede molto tempo, con tutti i passaggi correlati e critici, quindi la dimostrazione visiva dà un'idea dell'aspetto delle celle e fornisce alcuni suggerimenti per garantire una generazione di successo delle celle desiderate.

Per iniziare, trasferire sangue venoso periferico precedentemente isolato in un tubo conico da 50 millilitri e diluirlo con lo stesso volume di PBS sterile di Dulbecco. In un altro tubo conico da 50 millilitri, preparare 15 millilitri di mezzo gradiente di densità sterilizzato. Inclinare il tubo con un angolo di 45 gradi e posare lentamente e con cura 30 millilitri di sangue periferico diluito sul mezzo gradiente di densità.

Centrifugare il tubo a 800 volte g per 15 minuti a temperatura ambiente con il freno di centrifuga impostato in posizione off. Aspirare lo strato di plasma superiore giallo e scartarlo. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire lo strato bianco e torbido di pellicola sottile contenente cellule mononucleari in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

Aggiungere 30 millilitri di D-PBS al tubo con MNC e centrifugare a 600 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere 45 millilitri di D-PBS e rimescolare le cellule. Dopo aver centrifugato il tubo a 400 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il supernatante.

Rimescolare le celle con cinque millilitri di D-PBS, contare le celle vive con il metodo di esclusione blu del trypan, mettere da parte gli MNC necessari per l'espansione e congelare le celle rimanenti per un uso futuro. Il giorno meno 14, seminare MNC ad una densità da due a tre milioni di cellule per millilitro per pozzo di piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri di 37 gradi Celsius, mezzo MNC pre-riscaldato. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per due giorni.

Il giorno meno 11, utilizzare una pipetta sterilizzata per raccogliere le cellule con il mezzo e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo MNC pre-riscaldato. Dopo aver contato le cellule vitali con tripano blu, seminare gli MNC ad una densità di un milione di cellule per millilitro in mezzo MNC pre-riscaldato in una piastra a sei pozzetto.

Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni e ripetere la raccolta, la centrifugazione e la placcatura delle cellule nel mezzo MNC nei giorni meno otto e meno quattro. Il virus Sendai in questa procedura è pericoloso e tutte le procedure che coinvolgono il virus Sendai devono essere eseguite in un armadietto di sicurezza. E tutte le punte e i tubi esposti al virus Sendai devono essere trattati con etanolo o candeggina prima dello smaltimento.

Il giorno zero, raccogliere le cellule in mezzo MNC e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule a 200 volte g per cinque minuti, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule con un millilitro di mezzo MNC pre-riscaldato. Contare le cellule vitali con tripano blu, e poi ripreposerle con mezzo MNC pre-riscaldato a una concentrazione di 200.000 cellule per pozzo in piastre di 24 po '.

Scongelare i tubi rimossi dallo stoccaggio di meno 80 gradi Celsius contenente il virus Sendai in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per cinque-10 secondi, quindi lasciarli scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelati, metterli immediatamente sul ghiaccio. Aggiungere il virus Sendai scongelato ai pozzi della piastra da 24 po 'con MNC a una molteplicità di infezione di 10.

Per facilitare l'attacco delle cellule, centrifugare le piastre a 1.000 volte g per 30 minuti e successivamente posizionare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Il primo giorno, trasferire le cellule con il tubo di centrifuga medio a un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Per staccare ulteriormente le cellule rimanenti, sciacquare i pozzetti con un millilitro di mezzo MNC per pozzo e aggiungere le cellule con mezzo al tubo.

Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare a 200 volte g per cinque minuti, aspirare il supernatante, rimescolare le cellule con 500 microlitri di mezzo MNC fresco preri riscaldato e aggiungere a un pozzo di una piastra da 24 porri. Il secondo giorno, utilizzare un millilitro per pozzo di 50 microgrammi precedentemente diluiti per microlitero poli-D-lisina in D-PBS per rivestire piastre a sei pozzetti per almeno due ore a temperatura ambiente. Aspirare la poli-D-llysina dalle piastre a sei pozza e asciugare sulla panca pulita verticale per circa 10 minuti.

Quindi aggiungere un millilitro per pozzo di cinque microgrammi precedentemente diluiti per millilitro laminina alle piastre a sei pozzetti e incubare per quattro o sei ore a 37 gradi Celsius per rivestire. Lavare le piastre con D-PBS prima dell'uso. Il terzo giorno, placca tutti gli MNC trasdotti dal virus Sendai nel mezzo di cellule staminali neurali indotte sulle piastre a sei pozzi rivestite in poli-D-llysina / laminina.

Nei giorni cinque e sette, aggiungere delicatamente un millilitro di 37 gradi Celsius, mezzo iNSC pre-riscaldato ad ogni pozzo delle piastre a sei pozzetti. Dal giorno nove al giorno 28, sostituire il mezzo con un mezzo iNSC fresco prerifa riscaldamento ogni giorno. Monitora l'emergere delle colonie iNSC e in circa due o tre settimane raccogli colonie con morfologia appropriata usando pipette di vetro bruciate e trasferisci ogni colonia in un pozzo separato di una piastra di sei pozzi per l'espansione.

Per stabilire modelli unilaterali di topi 6-irodopamina,, radere la testa di un topo anestetizzato, adulto, maschio, scid-beige e applicare un unguento per gli occhi di eringomicina. Posizionare il mouse sull'apparato stereotassico e fissare il mouse con barre incisive. Inserire correttamente i padiglioni auricolari per posizionare in modo sicuro e appropriato la testa del mouse.

Sterilizzare la testa con iodio povidone e alcol isopropile, quindi utilizzare una lama bisturi per fare un'incisione sagittale di circa 1,5 centimetri sulla pelle della testa, esponendo il cranio. Regolare la barra incisivo e le barre dell'orecchio per ridurre il dislivello tra bregma e lambda a meno di 0,1 millimetri. Spostare lentamente e abbassare la punta dell'ago di microsiringa verso il bregma e trattare il bregma come punto zero.

Spostare la punta in una posizione con coordinate di 0,5 millimetri anteriori e 2,1 millimetri laterale rispetto al bregma. Ritrarre la punta, contrassegnare il punto con una pennarello e, con un trapano elettronico, sbavare un piccolo foro nel cranio. Estrarre due microlitri di cinque microgrammi per millilitro soluzione di 6-irossidopamina nella microsiringa.

Riportare l'ago al punto contrassegnato e inserire l'ago a 3,2 millimetri dorsali/ventrali. Iniettare la soluzione di 6-irossidopamina dalla siringa ad una velocità di un microlitro al minuto, lasciare l'ago di iniezione in posizione per altri cinque minuti e quindi ritrarlo lentamente. Dopo aver chiuso l'incisione con suture, applicare di nuovo unguento per gli occhi di eringomicina sugli occhi.

Rimuovere il mouse dall'apparato stereotassico, metterlo nella gabbia di recupero e consentire l'accesso a cibo e acqua fino a quando non riprende conoscenza. Dopo che i PBMNC sono stati infettati da SeV, la loro morfologia stava cambiando e le cellule hanno subito una morte drastica fino al quinto giorno. Le colonie dell'INSC emersero il giorno 12.

Dopo aver raccolto e trasferito cloni iNSC per l'espansione per un certo numero di passaggi, hanno mostrato una buona morfologia e potevano autorinotizzarsi stabilmente in mezzo iNSC, sia in forma di monostrato che come sfere. Dopo 24 giorni di differenziazione, gli INSC sono stati identificati come neuroni dopaminergici poiché la maggior parte di essi esprime idrossilasi tirosina, scatola della fronte A2 e marcatori beta-tubulina di classe III specifici per neurone. Dopo aver istituzione di modelli unilaterali di topo del morbo di Parkinson a 6 irossidopamina, è stata condotta una valutazione comportamentale per stimare i sintomi del morbo di Parkinson.

I topi che avevano ricevuto il trapianto di cellule hanno mostrato un significativo miglioramento della funzione motoria. L'estensione della colorazione indotta da 6 irossidopamina è stata verificata mediante colorazione immunofluorescente post mortem per TH allo striato, al fascio di anebraina mediale e alla substantia nigra pars compacta. I segnali TH-positivi sono stati notevolmente recuperati nello striato dove le cellule sono state impiantate e anche leggermente recuperate alla SN. Tre mesi dopo il trapianto, tra le cellule sopravvissute, circa il 13,84% erano neuroni dopaminergici th-positivi.

Circa il 91,72% delle cellule th-positive espresse recettore nucleare orfano, circa l'86,76% espresso FOXA2, e circa il 98,77% sono state co-etichettate con potassio raddrizzatore interno accoppiato alla proteina G. Quando si posano 30 mils di sangue periferico diluito sul mezzo gradiente di densità, si prega di farlo lentamente e con attenzione, per non disturbare l'interfaccia del gradiente. Si deve fare attenzione a evitare ripetuti scongelarsi e congelare il virus Sendai per garantire un'elevata attività virale.

Quando si riprogrammano le cellule mononucleari del sangue periferico alle cellule staminali neurali indotte, si prega di osservare attentamente la morfologia delle cellule ogni giorno. Inoltre, la 6-idrossidopamina è sensibile alla luce e alla temperatura. Fare attenzione a proteggere la soluzione dalla luce e tenerla sul ghiaccio prima dell'uso.

Seguendo questa procedura, si può continuare a studiare i meccanismi della malattia utilizzando neuroni dopaminergici familiari derivati dal paziente pd in coltura. Si può anche continuare a indagare su come le cellule trapiantate influenzano i circuiti neuronali danneggiati.