Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione
20 giugno 2019
Introduciamo un metodo di registrazione ottica riproducibile e stabile per le fette cerebrali usando coloranti sensibili alla tensione. L'articolo descrive la colorazione sensibile alla tensione e la registrazione di segnali ottici utilizzando preparazioni convenzionali di fette ippocampali.
Il metodo di registrazione ottica con colorante sensibile alla tensione è pensato per essere una tecnologia ideale per visualizzare come funziona il cervello. Questo metodo ci ha permesso di registrare una dinamica neuropsichica in modo stabile e affidabile per 12 ore, ci ha dato una visione dell'attività psichica. Stiamo cercando di espandere l'applicazione per rilevare i cambiamenti di circuito causati dalle sostanze chimiche in tutte le fasi dello sviluppo, come la preziosa applicazione dell'acido alle madri.
La tecnica è già ben consolidata. Si prega di provare a riprodurre gli studi seguendo il metodo presentato qui. Per iniziare questa procedura, immergere la testa decapitata in ACSF ghiacciato in un vassoio chirurgico in acciaio inossidabile.
Estrarre il cervello entro un minuto e posizionare in un bicchiere contenente ACSF refrigerato per cinque minuti. Quindi, dividere la sezione cerebrale alla linea mediana con un bisturi e posizionare entrambi gli emisferi su un blocco di agar al 4%. Quindi, posizionare il blocco cerebrale con entrambi gli emisferi su un blocco di agar al 4%.
Pulire l'ACSF in eccesso dal blocco con una carta da filtro. Successivamente, applicare la supercolla sulla piattaforma del vibratomo. Posizionare il blocco di agar su di esso e pulire l'adesivo eccessivo con una carta da filtro.
Applicare delicatamente una piccola quantità di ghiaccio freddo ACSF dalla parte superiore del blocco di agar cerebrale per aiutare a solidificare la supercolla in eccesso e per impedire alla colla di coprire il cervello e disturbare l'affezione. Successivamente, fissare la piattaforma sul vassoio del vibratomo e versare l'ACSF modificato. Impostare il vibratomo a una velocità lenta e avere la frequenza della lama alla sua massima impostazione.
Quindi inizia a affeggiare. Posizionare le fette nell'angolo della camera a fette in sequenza in modo che l'ordine delle fette possa essere facilmente distinto. Di solito si possono ottenere da tre a cinque fette da un emisfero.
Quindi, tagliare la porzione di tronco encefalico usando un ago calibro 30. Utilizzando un piccolo pennello ribaltato, posizionare la fetta sul filtro a membrana tenuto con un anello in plexiglass. Posizionare l'anello in una camera di recupero umida e fissare il coperchio per mantenere alta la pressione interna.
Quando si posiziona la fetta sul filtro a membrana, regolare la direzione e la posizione della fetta all'interno dell'anello per assicurarsi che sia ben centrata e abbia una direzione coerente. Lasciare il campione a 28 gradi Celsius per 30 minuti e quindi a temperatura ambiente per almeno 10-30 minuti per il recupero. Per macchiare le fette, applicare delicatamente 100 microlitri della soluzione di colorazione su ogni fetta e incubare a 20 minuti per la temperatura ambiente.
Quindi, preparare da 50 a 100 millilitri di ACSF in un contenitore. Posizionare l'anello con il campione in esso per risciacquare la soluzione di colorazione. Quindi, trasferire le fette risciacquate in un'altra camera di incubazione.
Attendere più di un'ora per il ripristino prima dell'esperimento. Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il computer e il sistema di telecamere e aprire il software. Versare ACSF in un tubo da 50 millilitri e bollarlo con carbogeno.
Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'ACSF e regolare la portata a circa un millilitro al minuto. Quindi, regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera di esperimento sia sempre costante. Posizionare l'elettrodo di terra nella camera.
Successivamente, riempire l'elettrodo di vetro con una piccola quantità di ACSF e posizionarlo nel supporto dell'elettrodo. Attaccare il supporto all'asta del manipolatore. Utilizzando un amplificatore, assicurarsi che la resistenza dell'elettrodo sia di circa un megaohm.
Nella sessione di registrazione, trasferire una fetta dalla camera umida a una camera sperimentale. Premere saldamente il bordo dell'anello nell'o-ring in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera di esperimento.
Al microscopio posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e il potenziale elettrodo di registrazione di campo sulla fetta. Controlla la risposta evocata fornendo uno stimolo. Verificare che il campo visivo copra il circuito neurale destro nel sistema di registrazione ottica.
Quindi, regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera. Utilizzando la sorgente luminosa fluorescente, regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione. Quindi, avviare la registrazione e analizzare i dati in un software di acquisizione di immagini dopo l'acquisizione.
Questa figura mostra il segnale ottico rappresentativo sulla stimolazione elettrica del collaterolo di Schaffer nell'area CA1 di una fetta ippocampale del topo. Queste immagini consecutive mostrano il segnale ottico prima dell'applicazione di filtri spaziali e temporali, mentre queste immagini mostrano gli stessi dati dopo aver applicato due volte un filtro cubico cinque per cinque per cinque. A causa dell'elevata frequenza fotogrammi e dell'alta risoluzione spaziale, l'applicazione del filtro non ha cambiato il segnale, ma ha filtrato il rumore che può essere osservato anche nel corso del tempo registrato in pixel in una singola prova.
Ecco il confronto delle risposte tipiche nell'area CA1 delle fette ippocampali tra topo e ratto. La piccola risposta iperpolarizzante si osserva nel lato distale della CA1 dopo 24 millisecondi nella fetta ippocampale del topo, ma una risposta iperpolarizzante più massiccia ha superato la risposta depolarizzante nella fetta ippocampale del ratto. Una volta che le fette sono macchiate, dovrebbero durare per oltre 12 ore ed è possibile eseguire altre registrazioni elettrofisiopatiche su di esse.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo di registrazione ottica stabile mediante l'uso di coloranti sensibili al voltaggio per fette cerebrali, concentrandosi sulla segnalazione dei neuroni ippocampali. La tecnica offre una visione affidabile della dinamica neuropsichica per periodi prolungati, facilitando lo studio delle modifiche nei circuiti indotte da applicazioni chimiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Immagini ottiche
Sfondo
- Il colorante sensibile al voltaggio è fondamentale per visualizzare le attività cerebrali.
- Le preparazioni convenzionali di fette ippocampali fungono da modello biologico.
- Lo studio esplora le dinamiche neuropsichiche e le alterazioni dei circuiti.
- I metodi precedenti non erano affidabili durante tempi di registrazione prolungati.
Scopo dello studio
- Introdurre un metodo riproducibile per la registrazione ottica in fette di tessuto cerebrale.
- Fornire informazioni sugli effetti di sostanze chimiche sulla dinamica dei circuiti cerebrali.
- Permettere l'osservazione a lungo termine dell'attività neuronale e delle risposte.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma utilizzata è costituita da fette cerebrali espiantate dall'ippocampo del topo.
- Il modello chiave comprende fette ippocampali, facilitando studi sull'attività elettrica.
- Non vengono menzionati flussi di lavoro multi-omici; l'attenzione è rivolta a tecniche ottiche ed elettrofisiologiche.
- La preparazione prevede passaggi meticolosi come il raffreddamento, la colorazione e l'incubazione delle fette.
- Le sessioni di registrazione vengono effettuate in una camera sperimentale con requisiti precisi di allestimento.
Risultati principali
- Il metodo ottico consente la raccolta affidabile di dati nell'arco di un periodo di 12 ore.
- Il confronto tra le risposte di fette ippocampali di topo e di ratto mostra profili neurofisiologici distinti.
- I cambiamenti elettrofisiologici, come le risposte iperpolarizzanti, sono confermati dalle registrazioni ottiche.
- La tecnica migliora la comprensione della dinamica dei circuiti neuronali in diverse condizioni.
Conclusioni
- Questo metodo rappresenta un notevole progresso nello studio dei circuiti cerebrali e dei fenomeni neuropsichici.
- Permette ai ricercatori di osservare cambiamenti in tempo reale nella segnalazione neuronale.
- Comprendere questi meccanismi potrebbe fornire informazioni sulla plasticità e su potenziali applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging ottico a singolo fotone con coloranti sensibili al voltaggio in campo largo consente una valutazione funzionale stabile e a lungo termine dei circuiti neurali in fettine cerebrali, affrontando una sfida fondamentale nella validazione di target in neuroscienze. Il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo letture ottiche quantitative ad alta risoluzione dell'attività neuronale per periodi prolungati, elemento cruciale per valutare gli effetti dei composti sulla dinamica dei circuiti nella fase preclinica di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione in tempo reale della dinamica della segnalazione neuronale nei circuiti ippocampali.
- Valore operativo: Fornisce registrazioni stabili e riproducibili per oltre 12 ore, consentendo la valutazione longitudinale dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Facilita il rilevamento di modifiche nei circuiti indotte da applicazioni chimiche, contribuendo all'identificazione precoce degli effetti di composti neuroattivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Raggiunge una frequenza di acquisizione di 10 kHz e una risoluzione di 100x100 pixel, consentendo analisi temporali e spaziali ad alto rendimento delle risposte neurali.
- Qualità del segnale: La filtrazione successiva alla registrazione migliora il rapporto segnale-rumore, permettendo la rilevazione affidabile di modifiche subliminali nei circuiti, fondamentali per la sensibilità del saggio.
- Riproducibilità: Procedure stabili di manipolazione e colorazione delle fette riducono al minimo gli artefatti meccanici, garantendo dati coerenti tra ripetizioni e sessioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Supporta la valutazione delle alterazioni nei circuiti delle reti ippocampali, una regione implicata nei disturbi cognitivi e neuropsichiatrici.
- Continuità traslazionale: Permette registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche parallele, rafforzando la validazione degli esiti funzionali attraverso diverse modalità di misurazione.
- Progresso con valutazione del rischio: Profili di risposta distinti tra fette di topo e di ratto forniscono informazioni sulla traducibilità tra specie e aiutano a ridurre i rischi nella selezione di candidati preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo letture funzionali dei circuiti che collegano la validazione del bersaglio all'identificazione dei composti promettenti, in particolare per i composti neuroattivi che richiedono una valutazione fenotipica a livello di circuito.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle dinamiche neuropsichiche e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione diretta di segnali ottici evocati in circuiti neurali definiti.
- Screening: Fornisce output ottici quantitativi ad alta risoluzione adatti all'analisi automatizzata e al confronto delle variazioni dell'attività neurale indotte da composti chimici.
- Analisi: Permette l'applicazione di filtri spaziotemporali per estrarre il segnale dal rumore, facilitando la quantificazione oggettiva delle risposte del circuito e la valutazione della variabilità.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni sui circuiti nella fase di scoperta alla validazione preclinica consentendo registrazioni ripetute nel tempo per valutare la stabilità e la riproducibilità degli effetti dei composti.
- Riutilizzo aziendale: Una piattaforma standardizzata di preparazione di sezioni e di acquisizione delle immagini favorisce il riutilizzo in diversi progetti e serie di composti, riducendo la variabilità metodologica nei processi di screening in neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'analisi meccanicistica del funzionamento dei circuiti neuronali, riducendo l'ambiguità nella validazione degli obiettivi e sostenendo la fiducia predittiva nei test neurofarmacologici.
- Valore operativo: Mantiene le condizioni fisiologiche e previene il movimento delle sezioni, garantendo un'acquisizione di dati stabile e priva di artefatti per test affidabili dei composti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo un rilevamento precoce di effetti collaterali o indesiderati a livello di circuito, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate dello sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei composti in base ai profili funzionali dei circuiti, migliorando l'efficienza del capitale nei percorsi preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, imaging ottico e manipolazione dei tessuti per garantire la vitalità delle fette e l'efficienza della colorazione.
- È dipendente da sistemi di telecamere ad alta velocità, sorgenti luminose fluorescenti e configurazioni di perfusione in grado di mantenere condizioni fisiologiche per registrazioni prolungate.
- Necessita della standardizzazione dell'orientamento delle fette, della durata della colorazione e dei protocolli di recupero tra diversi gruppi di lavoro, al fine di ridurre al minimo la variabilità della baseline del segnale ottico e della risposta.
- L'adattamento ad altre regioni cerebrali o modelli di malattia potrebbe richiedere la validazione dell'efficienza di colorazione e dell'espressione del segnale specifica per il circuito.
- Le limitazioni pratiche includono la necessità di un'attenta ottimizzazione dell'intensità della luce di eccitazione per prevenire la fototossicità, mantenendo al contempo un'ampiezza del segnale sufficiente per la rilevazione.
