Name: Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per lanalisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Impara la preparazione del tessuto cerebrale di ratto neonato per l'analisi morfolometrica ultrastrutturale delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. Questo metodo consente di studiare la funzione sinaptica con alta risoluzione.

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Questo manoscritto è stato supportato da NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) e dai fondi del dipartimento di anestesiologia presso l'Università della Virginia. Gli autori desiderano ringraziare Alev Erisir (dipartimento di biologia, Università della Virginia, Charlottesville, VA) per un'eccellente formazione e assistenza tecnica con TEM, e per la sua preziosa critica manoscritta. Gli autori ringraziano inoltre la struttura avanzata di microscopia elettronica presso l'Università della Virginia per l'assistenza tecnica con sezionamento e post-colorazione dei campioni.

<ol><li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li>
<li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li>
<li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li>
<li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain%3A+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain%3A+a+quantitative+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li>
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<li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+of+synapses%3A+selective+staining+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li>
<li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li>
<li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li>
<li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li>
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<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Fixation+for+electron+microscopy%22">Fixation for electron microscopy</a>. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).</li>
<li>Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrman%2C+EJ+%22The+science+of+biological+specimen+preparation+for+microscopy+and+microanalysis%22">The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis</a>. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).</li>
<li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li>
<li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hystochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li>
<li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li>
<li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li>
<li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074(1968).</li>
<li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranyl+acetate%2C+a+stain+and+a+fixative%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li>
<li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li>
<li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li>
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<li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+staining+with+uranyl+acetate%3A+possible+role+of+free+amino+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li>
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<li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li>
<li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+and+Microscopica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li>
<li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li>
<li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+lead+by+modification+of+Sato%E2%80%99s+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A stable lead by modification of Sato’s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li>
<li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li>
<li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li>
<li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Biology%22%5BJournal%5D)">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137(2009).</li>
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<li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li>
<li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections%3A+the+role+of+ethanol%2C+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La manipolazione delle sezioni tissutali durante la preparazione del campione per TEM richiede un notevole grado di finezza, concentrazione e pazienza. Quando si utilizza una micropipetta per aggiungere e rimuovere soluzioni, i campioni possono essere aspirati nella punta della pipetta dalla tensione superficiale, pertanto è necessario prestare molta attenzione per evitare danni ai tessuti da parte della pipetta. Inoltre, alcuni passaggi della sequenza di disidratazione possono essere rapidi come 1 min, quindi l'operator...

Descriviamo i metodi per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici di alta qualità per l'analisi morfolometrica approfondita della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica ai terminali nervosi1,2. I micrografi ad alto contrasto che possono essere ottenuti elaborando campioni seguendo questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia dettagliata di un certo numero di componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali3,4.
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è un potente strumento per studiare quantitativamente la morfologia degli organelli e di altre strutture cellulari. A partire da questo decennio, non ci sono altri metodi di indagine che possono fornire lo stesso grado di risoluzione delle membrane lipidiche e organelli senza immuno-tagging, ad eccezione della criofissazione da congelamento ad alta pressione. Tuttavia, le tecniche di sostituzione del congelamento non sono ampiamente utilizzate, e normalmente richiedono attrezzature costose e lunghi tempi di preparazione.
Al fine di sfruttare l'elevata potenza risolutivo di TEM, la preparazione ottimale dei campioni è di fondamentale importanza. Gli obiettivi principali della preparazione dei campioni sono di preservare la struttura tissutale con minime alterazioni dallo stato vivente, migliorare il contrasto dei campioni e stabilizzare il tessuto contro l'estrazione dei componenti cellulari durante la lavorazione e l'esposizione all'elettrone Raggio. Numerosi protocolli per la preparazione dei tessuti TEM sono stati introdotti e perfezionati da diversi laboratori nel corso degli anni. Molti di loro si sono concentrati sui metodi per una visualizzazione ottimale delle vescicole sinaptiche5,6,7,8,9,10,11. Tra una serie di metodi standard d'oro consolidati attualmente in uso, abbiamo scelto procedure per la fissazione chimica, la post-fissazione, la colorazione in blocco, la disidratazione sequenziale, l'incorporamento di resina e la colorazione post che mirano a preservare la struttura dei tessuti ottimale e ottenere un eccellente contrasto dell'immagine. Di nota, la conservazione di ultrastruttura fine può essere particolarmente impegnativo quando si lavora con il tessuto cerebrale del ratto neonato. Infatti, il sistema nervoso centrale di animali molto giovani è caratterizzato da un maggiore contenuto di acqua rispetto al cervello adulto, più prominente allargamento degli spazi extracellulari, e connessioni più allentati tra le cellule12. Questo rende il tessuto cerebrale del ratto neonato profondamente sensibile ai cambiamenti nell'osmolarità, e squisitamente incline al restringimento degli artefatti e/o gonfiore quando elaborato attraverso soluzioni sequenziali di diversa tonicità12. Pertanto, i nostri metodi impiegati soluzioni per la lavorazione dei campioni che sono di osmolarità il più vicino possibile a quella del cervello neonato ratto. Il nostro obiettivo era ottenere immagini di microscopia elettronica ad alta risoluzione di alta qualità per la valutazione quantitativa della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica nei terminali nervosi. In particolare, abbiamo cercato di misurare il numero di vescicole all'interno del terminale nervoso, la distanza delle vescicole sinaptiche dalla membrana plasmatica pre-sinaptica, il numero di vescicole ancorate alla membrana pre-sinaptica, la dimensione delle vescicole sinaptiche e la Distanze intervescicole1.
Una fissazione chimica soddisfacente è un prerequisito per ottenere micrografi elettronici di alta qualità in grado di fornire il dettaglio morfologico necessario per studiare la morfologia e l'organizzazione spaziale della vescicola sinaptica. Sebbene esistano diverse modalità di fissazione, la fissazione del tessuto cerebrale mediante perfusione vascolare è decisamente superiore ad altri metodi. Poiché la fissazione tramite perfusione vascolare inizia immediatamente dopo l'arresto della circolazione sistemica, accorcia l'intervallo tra la deossigenazione del tessuto cerebrale e il cross-linking delle proteine con fissativi, con conseguente alterazioni minime nelle cellule struttura. Inoltre, realizza una penetrazione veloce e uniforme, a causa del rapido flusso del fissativo dal letto vascolare ai compartimenti extracellulari e cellulari12,13,14. La fissazione primaria con glutaraldeide, seguita da fissazione secondaria (post-fissazione) con tetroxide di osmio, produce un'eccellente preservazione della struttura fine15,16,17. Una miscela di glutaraldeide e paraformaldeide ha il vantaggio aggiuntivo di una penetrazione più rapida nel tessuto12.
Poiché i tessuti biologici non sono sufficientemente rigidi per essere tagliati in sezioni sottili senza il supporto di una matrice di resina, devono essere incorporati in un mezzo prima del sezionamento sottile. Le resine epossidiche immiscibili in acqua sono comunemente utilizzate come mezzo di incorporamento in TEM. Quando si utilizza questo tipo di matrice, l'acqua libera del campione deve essere sostituita con un solvente organico prima dell'infiltrazione di resina. L'acqua viene rimossa passando il provino attraverso una serie di soluzioni di concentrazioni ascendenti di etanolo e/o acetone12. In questo protocollo, i campioni sono primi piatti incorporati tra fogli di Aclar flessibili, quindi incorporati in una capsula. Il risultato finale è il tessuto situato sulla punta di un blocco di resina cilindrica, che ha la geometria ideale per essere meno influenzato dalle vibrazioni derivanti durante il sezionamento del microtomo.
La colorazione con metalli pesanti per migliorare il contrasto del tessuto endogeno è un altro aspetto importante della preparazione dei campioni. Il contrasto dell'immagine in TEM è dovuto alla dispersione di elettroni da parte degli atomi nel tessuto. Tuttavia, i materiali biologici consistono in gran parte di molecole a basso peso atomico (cioè carbonio, idrogeno, ossigeno e azoto). Pertanto, la generazione di un contrasto di dispersione sufficiente richiede l'incorporazione di atomi di peso atomico elevato nei componenti cellulari del tessuto. Ciò si ottiene attraverso la colorazione del campione con metalli pesanti12,18,19. Tetroxide di osmio, uranio e piombo, che si legano fortemente ai lipidi, sono i metalli pesanti più comuni utilizzati come macchie di elettroni.
L'osmio (numero atomico 76) è uno dei metalli più densi esistenti. È sia un fissativo che una macchia, anche se il suo ruolo primario in TEM è come un fissativo affidabile12. Tra i vari protocolli di fissazione in uso, il metodo di doppia fissazione con glutaraldeide seguita da osmio è il più efficace nel ridurre l'estrazione dei costituenti delle cellule durante la preparazione del provino. Questi due fissativi sono utilizzati per stabilizzare il numero massimo di diversi tipi di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traducono in una preservazione superiore dell'ultrastruttura tissutale12,14,15, 16 anni di , 17. la
L'uranio (numero atomico 92) è il metallo più pesante utilizzato come macchia elettronica, più tipicamente sotto forma di acetato di uranile. Analogamente all'osmio, agisce come una macchia e fissativo, anche se il suo ruolo primario in tem è come una macchia20,21. Le strutture contenenti acido nucleico e membranose sono fortemente e preferenzialmente macchiate con sali di uranile in tessuti fissi aldeidi22,23. Il trattamento dei tessuti con acetato di uranile dopo l'osmicazione e prima della disidratazione provoca la stabilizzazione di strutture membranose e contenenti acido nucleico, nonché un maggiore contrasto, e consente l'identificazione di alcuni dettagli strutturali che non essere facilmente rilevati in esemplari macchiati con osmio da solo12,24,25. Si pensa che l'acetato di uranile possa stabilizzare la struttura fine combinando con l'osmio ridotto che è stato depositato sulle membrane lipidiche durante l'osmicazione24. Il contrasto massimo si ottiene quando l'acetato di uranile viene applicato prima dell'incorporamento e come post-macchia nelle sezioni sottili12.
Piombo (numero atomico 82) è la macchia più comune utilizzata per TEM ed è principalmente impiegata per la post-colorazione di sezioni sottili. I sali di piombo hanno un'elevata opacità degli elettroni e mostrano affinità per una vasta gamma di strutture cellulari, tra cui membrane, proteine nucleari e citoplasmatiche, acidi nucleici e glicogeno26,27. Quando il metodo della doppia colorazione è impiegato (cioè, la colorazione con l'acetato di uranile è seguita dal trattamento con piombo), quest'ultimo agisce come sviluppatore di colorazione di acetato di uranile. Per esempio, il piombo post-colorazione della cromatina fissa con glutaraldeide aumenta l'assorbimento di uranile acetato di un fattore di tre28,29, 30,31,32. Il piombo migliora anche la colorazione impartita da altri metalli come l'osmio. Si ritiene che i sali di piombo macchiavano le membrane dei tessuti fissi di osmio attaccando al gruppo polare di fosfatidi in presenza di un ridotto Osmio33. Un potenziale svantaggio della colorazione sia con l'acetato di uranile che con il piombo, soprattutto per le durate prolungate, è che molti elementi strutturali diversi sono macchiati ugualmente e non specificamente, e quindi non possono essere facilmente distinti l'uno dall'altro12 .
La recente introduzione di fonti di luce alternative, come nella microscopia di localizzazione fotografica a Super risoluzione ottica, ha migliorato significativamente la risoluzione della microscopia della luce34. Tuttavia, poiché la microscopia leggera si basa su metodi istochimici e immunocicaminici per visualizzare proteine o enzimi etichettati individualmente, la potenza di TEM per visualizzare tutti gli elementi strutturali in una sola volta rimane insuperata per uno studio approfondito del morfologia e le relazioni dimensionali delle strutture tissutali. In particolare, nessun'altra tecnica può fornire il dettaglio morfologico necessario per eseguire l'analisi morfologica della distribuzione delle vescicole sinaptiche a attacchi nervosi pre-sinaptici. Tuttavia, è importante notare che i micrografi elettronici catturano la struttura del tessuto dopo che l'organismo muore, e quindi non possono fornire informazioni sulle dinamiche del traffico di vescicole pre-sinaptiche ed esocitosi. Pertanto, altri strumenti, come ad esempio il colorante FM-Live Imaging e l'elettrofisiologia patch-clamp, dovrebbero essere presi in considerazione quando l'obiettivo principale è quello di studiare gli aspetti dinamici e/o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche e dell'esocitosi.

<table><tbody><tr><td>4% tetrossido di osmio</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19170</td><td>acquoso</td></tr><tr><td>50% glutaraldeide</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>16310</td><td>grado EM, acquoso</td></tr><tr><td>Aclar 33 C film di inclusione</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>50425-25</td><td>7,8 mil di spessore, dimensioni 8 "x10"</td></tr> <tr><td>BEEM porta capsula</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>69916</td><td> Formato "00"</td></tr><tr><td>Capsule di inclusione BEEM Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 70021</td><td>"misura 00, piatto (fondo tagliato)"</td></tr><tr><td>Trimmer per blocchi Butler</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 69945-01</td><td></td></tr><tr><td>Pennello per capelli di cammello</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 65576-01</td><td></td></tr><tr><td>Perforatore a disco</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>77850-09</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 kit</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>dell'acetato di piombo</td><td>Scienze 17600</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>del citrato di piombo</td><td>Scienze 17800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica del nitrato di piombo</td><td>Scienze 17900</td><td></td><td>Microtomo</td></tr><tr><td>ultracut Leica UC7</td> Micrometro <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro scala</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>62091-23</td><td></td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>paraformaldeide</td><td>19208</td> Forno da laboratorio Thelco <td>di precisione granulare di grado EM</td></tr><tr><td></td><td>Thelco Thelco</td><td>51221159</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StatMark pen</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 72109-01</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>11760-05</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>22400</td><td>polvere</td></tr></tbody></table>

preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Il nostro laboratorio e molti altri hanno sfruttato l'alto potere risolutivo della microscopia elettronica di trasmissione per studiare la morfologia e l'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche. Al fine di ottenere micrografi elettronici di alta qualità che possono produrre il grado di dettaglio morfologico necessario per l'analisi quantitativa della distribuzione della vescicola pre-sinaptica, la preparazione ottimale dei campioni è critica. La fissazione chimica è il primo passo nel processo di preparazione del provino, e della massima importanza per preservare l'ultrastruttura fine. La fissazione vascolare con una soluzione di glutaraldeide-formaldeide, seguita dal trattamento di esemplari sezionati con vibratoma con tetroxide di osmio, stabilizza il numero massimo di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traduce in una conservazione superiore di ultrastruttura. Il tessuto viene quindi elaborato con controcolorazione, disidratazione sequenziale e resina-incorporamento. La colorazione in blocco con l'acetato di uranile (cioè la colorazione del tessuto vibratoma-sezionato prima dell'incorporamento della resina) migliora il contrasto endogeno e stabilizza i componenti cellulari contro l'estrazione durante la lavorazione del campione. Il contrasto può essere ulteriormente aumentato applicando l'acetato di uranile come post-macchia su sezioni ultrasottile. La doppia colorazione delle sezioni ultrasottile con citrato di piombo dopo il trattamento con acetato di uranile migliora anche la risoluzione dell'immagine, intensificando l'opacità dell'elettrone delle strutture contenenti acido nucleico attraverso il legame selettivo del piombo all'acetato di uranile. La microscopia elettronica di trasmissione è un potente strumento per la caratterizzazione dei dettagli morfologici delle vescicole sinaptiche e la quantificazione delle loro dimensioni e organizzazione spaziale nel bouton terminale. Tuttavia, poiché utilizza il tessuto fisso, la microscopia elettronica di trasmissione può fornire solo informazioni indirette sui processi viventi o in evoluzione. Pertanto, altre tecniche dovrebbero essere prese in considerazione quando l'obiettivo principale è quello di studiare aspetti dinamici o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche ed esocitosi.

Sono stati stabiliti criteri generali che sono per lo più accettati come indicativi di una conservazione soddisfacente o difettosa del campione per TEM. Questi criteri sono esemplificati in quattro micrografi elettronici selezionati (due esempi di preparazione ottimale, due esempi di preparazione difettosa) che sono stati ottenuti trattando il tessuto cerebrale del ratto giovane seguendo i metodi descritti in questo protocollo.
In generale, un Micrografo elettronico di buona qualità appare com...

Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Tra i diversi protocolli esistenti per la preparazione dei tessuti per la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo selezionato metodi che producono una conservazione strutturale ottimale e micrografie ad alta risoluzione per eseguire l'analisi morfometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche ai terminali presnaptici. Le immagini ad alto contrasto ottenute con questi metodi permettono di quantificare parametri quali la distanza delle vescicole sinaptiche dal numero di membrane presnaptiche di vescicole ancorate alla membrana presettica e alle distanze inter vescicole. Tutti questi parametri sono indicativi della funzione sinaptica.Poiché le alterazioni nell'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche possono essere associate all'interruzione della funzione sinaptica, questi metodi sono stati utilizzati per esaminare gli effetti degli anestetici generali sullo sviluppo sinaptico. Questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per esaminare gli effetti di qualsiasi farmaco o trattamento sulla morfologia dettagliata delle sinapsi per fornire informazioni sulla loro funzione. Iniziare preparando il tetrossido di osmio per la post fissazione delle sezioni cereb

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Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

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Fonte: Olesen, M. V., et al. La tecnica del frazionamento ottico per stimare il numero di cellule in un modello di ratto di terapia elettroconvulsivante. J. Vis. Exp. (2017).  Il video mostra la tecnica per quantificare i neuroni appena generati nel tessuto cerebrale. Fette di tessuto ippocampale contenenti neuroni marcati con Bromodeossiuridina (BrdU) sono state colorate utilizzando l'immunoistochimica e successivamente quantificate attraverso lo spessore del tessuto utilizzando la tecnica del...

Quantificazione dei neuroni appena generati nel tessuto cerebrale di ratto utilizzando la tecnica del frazionamento ottico

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

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Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

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La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

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Impara la preparazione del tessuto cerebrale di ratto neonato per l'analisi morfolometrica ultrastrutturale delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. Questo metodo consente di studiare la funzione sinaptica con alta risoluzione.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per lanalisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi (Video) | JoVE Journal

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

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