Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Tra i diversi protocolli esistenti per la preparazione dei tessuti per la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo selezionato metodi che producono una conservazione strutturale ottimale e micrografie ad alta risoluzione per eseguire l'analisi morfometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche ai terminali presnaptici. Le immagini ad alto contrasto ottenute con questi metodi permettono di quantificare parametri quali la distanza delle vescicole sinaptiche dal numero di membrane presnaptiche di vescicole ancorate alla membrana presettica e alle distanze inter vescicole. Tutti questi parametri sono indicativi della funzione sinaptica.

Poiché le alterazioni nell'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche possono essere associate all'interruzione della funzione sinaptica, questi metodi sono stati utilizzati per esaminare gli effetti degli anestetici generali sullo sviluppo sinaptico. Questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per esaminare gli effetti di qualsiasi farmaco o trattamento sulla morfologia dettagliata delle sinapsi per fornire informazioni sulla loro funzione. Iniziare preparando il tetrossido di osmio per la post fissazione delle sezioni cerebrali del ratto precedentemente fissate con paraformaldeide e glutaraldeide tramite perfusione vascolare.

Le sezioni diventano rigide dopo il trattamento con tetrossido di osmio. Pertanto la manipolazione dei tessuti richiede attenzione da quel momento in poi. Inoltre, prima di aggiungere l'osmio, assicurarsi che le sezioni siano appiattite in quanto qualsiasi piega potrebbe causare frattura del tessuto.

Aprire un'ampola di vetro da cinque millilitri del 4% di tetrossido di osmio e acqua e lasciarla cadere all'interno di una bottiglia di vetro marrone. Aggiungere cinque millilitri di tampone di fosfato molare 0,2 e quindi aggiungere altri 10 millilitri di tampone di fosfato molare 0,1 per ottenere una soluzione finale dell'1%. Utilizzare una siringa da 20 millilitri dotata di un ago lungo per disegnare il tetrossido di osmio dell'1%, quindi aggiungere il tetrossido di osmio a un barattolo di vetro marrone ricoperto di foglio di alluminio.

Dopo aver fatto in modo che il campione sia stato dispiegato e appiattito, aggiungere l'1% di tetrossido di osmio e 0,1 PB molare al flaconcino campione. Incubare il campione in tetrossido di osmio per un'ora a temperatura ambiente. Estrarre il tetrossido di osmio con un micropipetto dopo che l'incubazione è finita e risciacquare le sezioni come descritto nel protocollo.

Per preparare l'acetato di uranile, posizionare un pallone di vetro volumetrico da 200 millilitri contenente 100 millilitri di etanolo al 70% su una piastra di agitazione. Aggiungere quattro grammi di acetato di uranile al pallone, avvolgere un foglio di alluminio per evitare precipitazioni con la luce e mescolare continuamente. Disidratare le sezioni in 50%etanolo.

Macchiare con il preparato l'acetato di 4%uranil per un'ora e seguire con disidratazione e risciacquo seriali come descritto nel manoscritto. Rimuovere lo stantuffo della siringa da una siringa da gavage da 60 millilitri e cappuccio con un ago di sicurezza. Posizionare la siringa con il lato aperto verso l'alto e aggiungere ogni ingrediente della miscela di resina uno per uno.

Finire aggiungendo 525 microlitri di DMP30 con una pipetta. Spostare lo stantuffo della pipetta molto lentamente poiché DMP è molto viscoso. Rimettere lo stantuffo nella siringa.

Invertire la siringa alcune volte per mescolare il contenuto. Il colore cambierà dal giallo all'ambra. Evacuare l'aria all'interno della siringa.

Quindi posizionarlo su un rocker con scuotimento continuo per almeno 30 minuti. Aggiungere un volume di resina epossidica e un volume di acetone a una fiala a scintillazione e agitare per mescolare. Applicare questa resina a una resina sulla miscela di acetone sulla sezione tissutale dopo l'ultimo risciacquo di acetone tenuto coperto per evitare l'evaporazione dell'acetone.

Rimuovere la miscela uno a uno di resina e acetone dopo due o quattro ore e sostituirla con resina completa e incubare per quattro ore. Mettere tutti i rifiuti di resina in un contenitore di raccolta sotto la cappa per polimerizzare e smaltire in seguito. Tagliare due pezzi rettangolari di pellicola di policlorotrifluoroetilene chiaro e pulirli con il 70% di etanolo.

Tagliali in modo che ci siano almeno 1,5 centimetri di plastica priva di tessuti su ogni lato della sezione, assicurandoti che abbiano la stessa larghezza ma l'altezza del foglio in cima è di circa 2/3 del foglio inferiore. Inclina lentamente il flaconcino e usa un pennello per cammelli fini e una micro-spatola flessibile per sollevare molto delicatamente il campione dal basso. Quindi spostare attentamente la sezione lungo le pareti del flaconcino e trasferirlo sul foglio PCTFE inferiore.

Rimuovere la resina in eccesso con una micro-spatola e coprire delicatamente il campione con il foglio superiore. Spingere delicatamente fuori eventuali bolle d'aria intrappolate senza applicare pressione diretta sulla sezione del tessuto e pulire la resina in eccesso. Utilizzare una penna resistente ai solventi per etichettare i fogli e posizionare in un forno a 60 gradi celsius per due o tre giorni per polimerizzare.

Smontare delicatamente i fogli PCTFE sandwich per aprirli. Utilizzare una penna resistente ai solventi per contrassegnare il lato del foglio che contiene la sezione aderendo che lo contrassegna vicino al tessuto. Utilizzare un punzone a disco per ottenere un campione circolare della sezione assicurandosi che il segno della penna fa parte del tessuto perforato.

Il segno della penna brilla quando la luce è stinta sull'esemplare. Posizionare il cappuccio di una capsula di incorporamento lato verso l'alto su un supporto per capsule. Posizionare una goccia di resina sul cappuccio e inserire il disco perforato all'interno del cappuccio con la sezione tissutale rivolta verso l'alto.

Inserire una capsula nel cappuccio con un delicato movimento del cavatappi. Utilizzare pinzette fini per arrotolare e abbassare un pezzo di carta stampato lungo due centimetri nella capsula, assicurandosi che si adatti alla curvatura delle pareti laterali della capsula. Versare la resina incorporante all'interno della capsula, riempire fino al bordo della capsula e utilizzare un bastoncino di legno appuntito per spingere il campione di tessuto verso il basso.

Posizionare la capsula nel forno a 60 gradi Celsius per due o tre giorni per la polimerizzazione. E poi continuare con il sessatura e la colorazione come descritto nel protocollo. La micrografia elettronica di conservazione soddisfacente della struttura cellulare neuronale mostra membrane cellulari stratificate senza rotture.

Il citoplasma è finalmente granulare e senza spazi vuoti. I mitocondri non sono né gonfi né rimpiccioliti con una doppia membrana esterna conservata e cristae interno intatto. La conservazione ottimale dell'ultrastruttura neuronale e dei dettagli morfologici fini è essenziale per visualizzare le vescicole sinaptiche e misurare la loro distanza dalla membrana presnaptica.

Le vescicole sinaptiche devono essere distinte e rivestite da una singola membrana ininterrotta. Al fine di facilitare l'analisi morfometrica della distribuzione sinaptica delle vescicolari, le membrane presnaptiche e postsinaptiche dovrebbero essere parallele nella loro continuità preservata. La micrografia elettronica di una conservazione difettosa della struttura tissutale mostra la distorsione e la rottura delle membrane cellulari neuronali e la presenza di spazi extracellulari marcatamente ingrossati.

I mitocondri appaiono distesi e hanno cristae gonfio. In un altro esempio di conservazione difettosa della struttura tissutale, c'erano grandi spazi vuoti bianchi all'interno del citoplasma al posto della sostanza citoplasmatica finemente granulare con spazi extracellulari ingranditi. Una membrana artificiale come per tutti probabilmente è il risultato della mobilizzazione dei lipidi durante la fissazione con glutaraldeide.

Quando si lavora tessuto cerebrale giovane utilizzare 1 tampone di fosfato molare come solvente per tutta la soluzione in modo da mantenere la tonicità il più vicino possibile a quella del cervello del ratto appena nato e ridurre al minimo il restringimento e o il gonfiore del tessuto artefatto. Le micrografie ottenute con questi metodi possono essere utilizzate per studiare la morfologia dettagliata e le relazioni strutturali dimensionali di un certo numero di componenti cellulari diversi dalle vescicole sinaptiche. Ad esempio, mitocondri, apparato golgi e cromatina nucleare.

Diversi passaggi di questo protocollo richiedono sostanze chimiche che possono essere tossiche. Lavorare sempre sotto una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione di aldeidi, osmio, uranio e composti al piombo.