Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Il protocollo è utile per ottenere una visione quantitativa della regolazione temporale dei prodotti genetici virali, nel contesto delle cellule ospiti, specialmente in relazione ai virus dell'herpes. Questa tecnica può aiutare ad affrontare le domande di ricerca relative sia agli RNA e alle proteine ospiti che virali. Inoltre, questa tecnica è compatibile con saggi biochimici simultanei.

Per aderire alle cellule a otto vetrini da camera, applicare 200 microlitri di una sospensione cellulare intrinseca su ogni camera di uno scivolo sterile a otto camere e consentire la crescita del seme per 12-24 ore, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aspirare le cellule supernatanti e non attaccate e fissare immediatamente le cellule con formaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS sul ghiaccio, per 30 minuti. Alla fine della fissazione, lavare le celle con lavaggi di tre, cinque minuti in 200 microlitri di 4 gradi Celsius PBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le celle fisse con 200 microlitri di tritone-X pre-refrigerato allo 0,5% in PBS per pozzo, per 10 minuti sul ghiaccio. Al termine della permeabilità, rimuovere con cura le camere senza rompere lo scivolo e risciacquare le cellule con PBS pre-refrigerato. Bloccare le cellule risciacquate con 4%BSA pre-refrigerato in PBS per 30 minuti a quattro gradi Celsius, seguite da incubazione con anticorpo primario policlonale appropriato di interesse nello 0,1%BSA in PBS per un'ora, a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS fresco e incubare le cellule con un anticorpo secondario appropriato coniugato con un fluoroforico compatibile con l'anticorpo di rilevamento FISH per un'ora, a quattro gradi Celsius. Dopo tre lavaggi PBS come dimostrato, fissare nuovamente i campioni in formaldeide al 4% in PBS per 10-15 minuti prima di una seconda permeablizzazione come dimostrato. Quindi coprire lo scivolo con un foglio di alluminio per preservare il segnale fluorescente e prevenire il fotobleaching.

E lavare le cellule con citrato di sodio salino 2x, prima di applicare 45 microlitri di soluzione di ibridazione. Dopo un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umidificata, aggiungere acqua distillata agli oligonucleotidi antisense di interesse per portare il volume di denaturazione a 10 microlitri. Denaturare gli oligonucleotidi a 95 gradi Celsius per cinque minuti, prima di aggiungere 35 microlitri di soluzione di ibridazione fresca per diapositiva.

Quindi incubare i campioni da 10-24 ore nella camera umidificata a 37 gradi Celsius, protetti con un foglio. Il giorno dopo, lavare le celle con due, 10 minuti. Il citrato di sodio salino 2X lava a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio in citrato di sodio salino 1X per 10 minuti, a 25 gradi Celsius.

Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le celle con formaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS, per 10-15 minuti sul ghiaccio, seguita da tre lavaggi con PBS fresco. Successivamente, permeabilizzare i campioni come dimostrato, seguito dall'incubazione con FTC anti-diossigenina e pre-refrigerato 0,1%BSA in PBS, per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBX fresco e fissare i campioni con paraformaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS, per 10-15 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo tre lavaggi in PBS, etichettare i nuclei con 0,4 microgrammi per millilitro di DAPI e pre-refrigerato 0,5%Triton-X in PBS per 15 minuti sul ghiaccio, seguito da tre lavaggi finali in PBS. Montare diapositive con perline fluorescenti, come sperimentalmente rilevanti e in apposito mezzo di montaggio. Dopo aver rimosso il mezzo di montaggio in eccesso con salviette sterili, sigillare un coverslip a ogni diapositiva con più mani di smalto chiaro e utilizzare un microscopio fluorescente per confermare l'esecuzione riuscita dell'esperimento.

Le immagini possono quindi essere scattate su un microscopio confocale per raccogliere le immagini dei campioni entro un'ora o una settimana dal montaggio, con un ingrandimento 630 volte superiore. Questi risultati rappresentativi di FISH e immunofluorescenza sono semiquantitativi e offrono informazioni sulla localizzazione degli oligonucleotidi, piuttosto che sui confronti tra le intensità delle diverse macchie fluorescenti, perché questi esperimenti non includevano una perla fluorescente nella preparazione dello scivolo. In questi esperimenti, le aree citoplasmatiche e nucleari e i loro rapporti erano diversi per le cellule infette da KSHV latenti e litotiche.

Come illustrato in questa figura, l'area è controllata nel rapporto nucleocitoplasmatico. Quando la replicazione del DNA KSHV è inibita nella fase litica, la proteina litica precoce della trascrizione oligonucleotide KSHV si sposta verso una localizzazione prevalentemente citoplasmatica. L'RNA poliadenilato KSHV, tuttavia, si localizza in specifici siti nucleari nonostante l'inibizione della replicazione virale del DNA.

Quando si rimuovono le camere dalle diapositive, fare attenzione che ci siano pochissimi residui di adesivo sullo strumento e utilizzare l'etanolo per permeablizzare le cellule e indebolire l'adesivo. Test biochimici come QPCR, western blot e sequenziamento ad alta produttività, possono essere eseguiti in tandem per aumentare i dati quantitativi raccolti dalle micrografie.