Separazione dell'epidermide e del derma di ratto con termolisina per rilevare mRNA e proteine infiammatorie sito-specifiche

Il nostro protocollo è una tecnica di separazione epidermico-dermica facile da usare e poco costosa per determinare la produzione sito-specifica di mediatori infiammatori e neurotrofine durante l'infiammazione della pelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la separazione enzimatica dell'epidermide dal derma viene eseguita a quattro gradi Celsius, mantenendo l'integrità di mRNA e proteine. Questo metodo fornisce informazioni sui tipi di mediatori che sensibilizzano i terminali afferenti primari durante l'infiammazione acuta e cronica per lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

La guarigione delle ferite, le malattie della pelle, le ferite croniche e le ustioni potrebbero beneficiare di questa ricerca. E questo metodo potrebbe essere applicato ad altre superfici epiteliali, come il tratto gastrointestinale e la cornea. Il tempo di separazione ottimale può differire leggermente tra i laboratori.

Si consiglia un esperimento preliminare che confronta diversi punti temporali combinato con una valutazione morfologica 2D per determinare la qualità della separazione. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un ratto Sprague Dawley anestetizzato di otto-nove settimane, iniettare per via sottocutanea la zampa posteriore glabra destra con 100 microlitri di carragenina Lambda 1X diluita in PBS. Utilizzare pinze per misurare lo spessore metatarsale della zampa posteriore immediatamente prima e a 6 e 12 ore dopo l'iniezione per determinare il volume di edema in risposta allo stimolo.

All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare un bisturi affilato per raccogliere un pezzo di uno per due millimetri di pelle glabra posteriore dalla zampa iniettata e utilizzare una pinze di microdissezione per trasferire la pelle in un millilitro di DMEM freddo in un tubo di microcentrifuga su ghiaccio per 15-60 minuti. Mentre il tessuto è in incubazione, aggiungere un millilitro di termolisina attivata appena preparata a 10 pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, utilizzare la pinza di microdissezione per trasferire un campione cutaneo in ogni pozzetto di termolisina attivata, strato corneo rivolto verso l'alto senza immergere i campioni nella soluzione.

È fondamentale che la pelle non sia immersa nella termolisina e che lo strato corneo sia rivolto verso l'alto per ottenere una separazione efficace. Dopo due o tre ore, utilizzare la pince di microdissezione per immergere un campione di pelle in sette-otto millilitri di dmEM di quattro gradi Celsius in una capsula di Petri per consentire più spazio per l'epidermide di separarsi dal derma. Utilizzare una pince per spazzolare delicatamente l'epidermide attorno al perimetro della pelle fino a quando non si osserva l'epidermide traslucida vicina ai bordi del campione.

Quando l'epidermide si separa notevolmente dal derma, afferrare attentamente ogni strato di pelle con un singolo paio di pinza e tirare lentamente l'epidermide dal derma, quindi valutare la traslucenza dell'epidermide isolata al microscopio ottico per assicurarsi che sia otticamente coerente. Se gli strati sono stati adeguatamente separati, posizionare i tessuti epidermici e dermici in singoli contenitori di cinque EDTA millimolari in DMEM a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la disattivazione della termolisina, fissare una parte dell'epidermide in un fissativo appropriato per un'ora a temperatura ambiente con agitazione.

Al termine dell'incubazione, posizionare il tessuto fisso in saccarosio al 10% in PBS per un'ora a temperatura ambiente con agitazione, prima di congelare il campione in una matrice di incorporamento del tessuto adatta per il sezionamento. Utilizzare un criostato per ottenere sezioni trasversali spesse 14 micrometri e scongelare le sezioni su vetrini per microscopio rivestiti di gelatina. Dopo l'asciugatura su uno scaldafilo, colorare i campioni con una soluzione di lavoro di blu toluidina per 90 secondi.

Successivamente, lavare delicatamente il blu toluidina dai vetrini con PBS e opporre i coverslip con un mezzo di montaggio acquoso, quindi osservare l'epidermide con la microscopia Brightfield con un ingrandimento da 50 a 250X. L'iniezione di carragenina nella zampa posteriore del ratto provoca i classici sintomi di infiammazione, come arrossamento ed edema sia a 6 che a 12 ore dopo l'iniezione. La microscopia a campo luminoso può essere utilizzata per valutare l'efficacia della separazione termolisina dell'epidermide e del derma della pelle della zampa posteriore glabra del ratto.

Infatti, la colorazione blu toluidina delle sezioni trasversali epidermiche mostra che l'epidermide è separata dal derma nella membrana basale, ma che le creste epidermiche di Rete e le rientranze dalla papilla dermica rimangono intatte. Inoltre, si osservano tutti gli strati cellulari cheratinociti. Il western blotting dell'epidermide separata dalla termolisinica produce risultati coerenti, indicando livelli di proteine stabili durante la tecnica a quattro gradi Celsius.

Pochissime proteine NGF vengono rilevate nell'epidermide naïve del ratto, ma i livelli di proteina NGF sono significativamente sovraregolati dopo sei ore di infiammazione indotta da carragenina. 12 ore dopo l'iniezione, i livelli di NGF sono ridotti rispetto a quelli osservati a sei ore, ma rimangono elevati rispetto ai controlli. Come previsto dall'analisi Western blot, l'immunoreattività NGF non viene rilevata su campioni di tessuto epidermico di controllo naïve, ma a sei ore dopo l'infiammazione indotta dalla carragenina, l'immunoreattività NGF è osservata nella maggior parte dei cheratinociti dello strato granuloso e dello strato lucidum.

Alcune cellule nello strato spinoso sono anche immunoreattive NGF. Quando si utilizza la termolisina per isolare l'epidermide intatta, è importante ricordare che il tempo di separazione ottimale deve essere determinato empiricamente dall'utente finale. Varie tecniche proteomiche e molecolari possono essere utilizzate per convalidare l'espressione di proteine specifiche e/o trascritti genici primari per confermare che questa procedura non altera l'espressione basale.

Questa tecnica di separazione epidermico-dermica consentirà ai ricercatori di rispondere a ulteriori domande riguardanti l'espressione sito-specifica di neurotrofine e mediatori infiammatori in diversi modelli infiammatori cutanei. L'acido picrico e la paraformaldeide sono pericolosi. Lavora con entrambe le sostanze chimiche in una cappa aspirante, usa indumenti e guanti protettivi personali e lavati il viso e le mani dopo la manipolazione.