Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Questo RT-PCR in tempo reale è adatto a diagnosticare rapidamente la rabbia in campioni ante mortem e post mortem. I primer Pan-Lyssavirus sono stati ottimizzati per identificare tutti i membri del genere Lyssavirus. Questo è un saggio rapido, sensibile e a tubo chiuso che rileva virus provenienti da tutto il genere Lyssavirus, comprese specie altamente divergenti dagli esemplari clinici.

L'OIE ha recentemente accettato test molecolari per segnalare l'infezione da rabbia. Ciò è particolarmente importante per i campioni decomposti che non possono sempre essere diagnosticati con metodi di coltura del virus o di rilevamento degli antigeni. A causa della sensibilità di questo saggio, una buona pratica di laboratorio, compresa la separazione delle diverse fasi, è fondamentale per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

A dimostrare la procedura sarà Daisy Jennings, una diagnostica del mio laboratorio. Inizia quantificando l'RNA con uno spettrofotometro a micro volume. Assicurarsi che la macchina sia impostata sull'RNA e utilizzare da uno a due microlitri di acqua di grado molecolare per normalizzare la macchina e stabilire una linea di base.

Misurare la concentrazione di RNA e regolarla su un microgrammo per microlitro. Pianificare il layout della piastra PCR con un foglio di calcolo tenendo conto sia degli esempi di test che di controllo. Preparare una workstation PCR disinfettando le superfici e, se si utilizza un armadio UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'avvio.

Rimuovere reagenti e primer dal congelatore per scongelare ma mantenere il mix enzimatico sul ghiaccio in ogni momento. Mescolare brevemente i reagenti e la centrifuga per raccogliere il liquido. Prepara i mix master PCR per Lyssavirus e Beta-Actin secondo le indicazioni del manoscritto.

Lasciare che il maestro si mescoli sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Mescolare e centrifugare le miscele master preparate e distribuire 19 microlitri nei pozzi pertinenti della piastra o del nastro tubo compatibili con la macchina PCR. In una stanza separata o in un armadio UV, aggiungere con cura un microliter dell'RNA preparato.

Se si utilizza un armadio UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'avvio. Dopo gli esempi di test, aggiungere il controllo positivo e il controllo no template. Quando si aggiunge l'RNA alle miscele master, assicurarsi che sia aggiunto al pozzo corretto.

Utilizzare un piano piastra per aiutare questo passaggio. Sigillare la piastra controllando che i coperchi siano piatti attraverso la piastra e girarla verso il basso per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore dei pozzi. Assicurarsi che ogni pozzo abbia lo stesso volume di liquido e che non siano visibili bolle.

Quindi trasferire i campioni sulla macchina PCR. Aprire il programma scegliendo SYBR Green con dissociazione. Selezionare i pozzi da analizzare scegliendo sconosciuto come tipo di campione e SYBR come colorante fluorescente.

Etichettare i pozzi sul layout della piastra con le informazioni del campione, incluso se il saggio è per Lyssavirus L o Beta-Actin. Fare clic sulla configurazione del profilo termico e modificare le condizioni di ciclo termico come specificato nel manoscritto. Fare clic sul pulsante Start, quindi scegliere un percorso per salvare il file e selezionare la casella per spegnere la lampada alla fine dell'esecuzione.

Quando viene visualizzata l'opzione per avviare prima che venga visualizzato il riscaldamento della lampada, fare clic su Esegui ora, ma assicurarsi che la lampada abbia meno di 15 minuti per riscaldarsi. Al termine dell'esecuzione della PCR, procedere con l'analisi dei dati. In primo luogo, analizzare i grafici di amplificazione del lissavirus.

I campioni positivi visualizzano rampe esponenziali mentre i campioni negativi hanno grafici di amplificazione piatti senza valori CT. Quindi, analizzare i risultati della curva di dissociazione del lissavirus dei campioni di prova insieme ai campioni di controllo. Un campione positivo al lissavirus avrà una temperatura di fusione compresa tra 77 e 80 gradi Celsius e si sovrapporrà al controllo positivo.

Quindi, analizza i grafici di amplificazione beta-actina e le curve di dissociazione confrontandoli con i controlli per interpretare il risultato complessivo. Visualizzare il report di testo e utilizzare i dettagli per registrare i valori CT e TM ottenuti per l'RNA di controllo in una scheda di controllo per verificare che l'esecuzione sia stata eseguita correttamente e che i risultati del campione di test possano essere segnalati. Questo protocollo è usato per dimostrare la sensibilità del Pan-Lyssavirus RT-PCR su una serie di diluizione dell'RNA di un virus standard di controllo.

La curva di amplificazione indica che è possibile rilevare solo 10 picogrammi di Lyssavirus e le curve di dissociazione verificano la temperatura di fusione del prodotto. La temperatura di fusione viene utilizzata per confermare che l'amplicon è specifico del Lyssavirus. I risultati qui dimostrano un intervallo di temperatura di fusione in tutto il genere Lyssavirus da 77,34 a 79,67 gradi Celsius.

I valori di temperatura di fusione inferiori a 76,8 o superiori a 80,2 sono considerati non specifici. La sensibilità di questo saggio RT-PCR è determinata anche rilevando l'RNA da tre campioni cerebrali positivi al Lyssavirus. Solo 0,1 picogrammi per microlitro di RNA bersaglio possono essere rilevati per due dei tre campioni.

In particolare, i rappresentanti di tutte le specie riconosciute di lissavirus vengono rilevati utilizzando questo saggio. Se si analizzano estratti di RNA da campioni clinici come saliva o CSF, i risultati di Beta-Actin possono essere negativi a causa della mancanza di acidi nucleici ospiti. L'aggiunta di un controllo esogeno può risolvere il problema.

Il sequenziamento di campioni positivi al Lyssavirus è raccomandato per fornire ulteriori informazioni riguardanti l'origine geografica e ospite di un'infezione da rabbia. La manipolazione di campioni positivi o sospetti di Lyssavirus deve essere secondo le linee guida locali per la salute e la sicurezza. L'RNA estratto non è infettivo, quindi può essere maneggiato all'interno di laboratori a basso contenimento.