Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Le colture organoidi del topo assomigliano più all'organizzazione cellulare in vivo che alle colture cellulari tradizionali. Nella ricerca sul cancro, gli organoidi modellano il tumore originale meglio delle linee cellulari 2D e possono essere utilizzati per testare potenziali terapie oncologiche in vitro per sviluppare nuovi trattamenti farmacologici. Per l'estrazione in blocco del sistema urogenitale del topo maschio afferrare il cuscinetto grasso su entrambi i lati della vescica e tirare verso l'alto per esporre il testicolo.

Sezionare con cura ogni testicolo lontano dal resto della regione urogenitale. Sollevare delicatamente la vescica in modo che la regione urogenitale sia elevata insieme, esponendo l'uretra sottostante. Tenendo la vescica, orientare le forbici contro la parte inferiore della prostata dorsale per incidere l'uretra.

L'intera regione urogenitale verrà rilasciata dalla cavità addominale. Dopo aver rimosso il sistema urogenitale, i linfonodi pelvici posizionati immediatamente dietro il sistema urogenitale e su entrambi i lati della colonna vertebrale saranno esposti. Per rimuovere i linfonodi orientare le forze dritte sotto il tessuto linfatico e tirare su.

Successivamente, afferrare il retto con le forcep dritte e tagliare, tirando su sul retto per dipanare l'intero colon e l'intestino tenue per cercare lesioni metastatiche nei linfonodi mesenterici. Quando l'intero ilio è stato rimosso continuare a tirare sul duodeno per esporre lo stomaco. Tagliare l'esofago per rimuovere completamente lo stomaco.

Se si osservano lesioni metastatiche nei linfonodi, sezionare attentamente questi nodi lontano dall'intestino per la conservazione in PBS. Quando lo stomaco è stato rimosso, la milza può essere raccolta dal lato dorsale dell'addome per la conservazione in paraformaldeide al 4%. Rimuovere il fegato per la conservazione in PBS.

Rimuovere i reni da entrambi i lati della colonna vertebrale insieme a eventuali linfonodi renali contenenti lesioni metastatiche. Per esporre la cavità toracica tagliare con cura il diaframma lungo la gabbia toracica. La pressione negativa rilasciata all'interno della cavità toracica esporrà il cuore e i polmoni.

Tirare su sullo sterno per aprire ulteriormente la cavità toracica. Scansionare la faccia ventrale della cavità toracica lungo la gabbia toracica alla ricerca di lesioni metastatiche nei linfonodi toracici per la dissezione, se presente. Mentre si tiene ancora lo sterno, tagliare la gabbia toracica ventrale per accedere al cuore e ai polmoni e tirare su sul cuore per tagliare sotto i polmoni.

Per rimuovere completamente il cuore e i polmoni in blocco tagliare tutti i vasi sanguigni anteriori nella trachea. Trasferire con cura il cuore senza danneggiare il tessuto polmonare o le lesioni metastatiche polmonari in un contenitore di PBS. Per la dissezione del tumore alla prostata posizionare la regione urogenitale al microscopio a dissezione.

Usa un paio di forcette dritte e un paio di forcette curve per capovolgere la regione urogenitale sulla sua superficie dorsale. Individuare la regione prossimale della prostata che può essere identificata dal colore rosa-rosso dell'uretra. Afferrare saldamente l'uretra per consentire la manipolazione del tessuto urogenitale con le forcelle curve.

Individuare la base delle vescicole seminali per consentire la loro attenta rimozione. Quindi utilizzare il lato curvo delle forcep per rimuovere il deferente vas e il più possibile tessuto adiposo e connettivo. Pur mantenendo saldamente l'uretra e la regione prossimale della prostata, utilizzare un paio di forbici appuntite fini per rimuovere la vescica dall'uretra.

Tenendo saldamente la regione prostatica prossimale e l'uretra con le flessione dritte afferrare la regione anteriore della prostata con il lato curvo delle forcep per allontanare saldamente il tessuto dalla vescica e dal resto della prostata. Posizionare il tessuto prostatico anteriore in PBS e localizzare la regione ventrale della prostata. Rimuovere la regione ventrale della prostata nello stesso modo.

Se la regione laterale può essere distinta dalla regione dorsale, rimuovere la regione prostatica laterale su entrambi i lati. Quindi rimuovere la regione dorsale della prostata e posizionare la regione prossimale della prostata in paraformaldeide al 4%. Dopo aver macinato, posizionare i pezzi tumorali in un tubo di digestione da 15 millilitri per una digestione di un'ora e mezza o due ore a 37 gradi Celsius.

Alla fine della digestione, sedimentare il tessuto digerito per centrifugazione e scartare il supernatante. Far scorrere il tubo per allentare il pellet cellulare. Rimescolare le cellule in un millilitro di tripsina prerimolata integrata con 10 micromolare Y-27632 ROCK inibitore per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione triturare il liquame tissutale cinque volte con una punta di pipetta P1000 standard. Riportare il tubo al bagno d'acqua per un'ulteriore incubazione e triturazione di cinque minuti. Per la placcatura a cupola a matrice lavare le cellule digerite in nove millilitri di mezzo freddo, quindi raccogliere le cellule per centrifugazione.

Rimospend le cellule in un millilitro di mezzo fresco per il conteggio. E dopo aver contato, raccogli le cellule per centrifugazione ancora una volta. Diluire le cellule tumorali nel volume appropriato della matrice.

Far cadere con cura 200 microlitri di soluzione di cellule matriciale in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi riscaldata di 55 gradi Celsius. Lasciare solidificare le cupole a temperatura ambiente per due minuti prima di posizionare la piastra capovolta in un incubatore di 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quando le cupole sono completamente solidificate aggiungere due millilitri di mezzo organoide prostatico integrati con androgeno R1881 e inibitore ROCK ad ogni pozzo.

Riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare. Le immagini della dissezione fluorescente rivelano proteine fluorescenti verdi, o espressione GFP, da tumori solidi della prostata, indicando che le cellule tumorali esprimono Cre. Il fegato e i polmoni dello stesso animale mostrano tumori metastatici che esprimono GFP dimostrando che questi tumori hanno avuto origine dal tumore primario della prostata.

Il linfonodo pelvico di questo topo esprime GFP e non Pomodoro, indicando che questo tumore metastatico ha superato il linfonodo e non rimane tessuto normale. Al primo giorno di coltura piccoli organoidi generati da un solido tumore alla prostata iniziano a formarsi con cellule che esprimono sia pomodoro che GFP presenti nella coltura organoide tumorale. Al settimo giorno e oltre, quando gli organoidi del tumore alla prostata si sono completamente formati, tuttavia, gli organoidi esprimono GFP, ma non Pomodoro, suggerendo che gli organoidi hanno avuto origine da cellule tumorali che esprimono Cre e non da normali cellule epiteliali.

Il primo giorno di coltura di piccoli organoidi generati da tumore alla prostata riempito di liquidi sia le cellule che esprimono pomodoro che le cellule che esprimono la GFP sono presenti all'interno della coltura organoide. Gli organoidi dei tumori della prostata riempiti di liquidi esprimono gfp o pomodoro al settimo giorno e oltre, indicando tuttavia che gli organoidi si sono formati da cellule che non esprimono Cre. Per rimanere orientati durante la raccolta del tessuto prostatico, essere consapevoli delle posizioni della vescica e dell'uretra in ogni momento.

Dopo la loro generazione gli organoidi possono essere utilizzati in applicazioni di imaging, analisi di biologia molecolare e schermi di farmaci.