Name: Uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Impara a quantificare lesioni cerebrali, deficit locomotori e neuroinfiammazione nelle larve di zebrafish dopo emorragia intracerebrale. Questo modello preclinico consente l'osservazione in tempo reale delle risposte cellulari.

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Vorremmo ringraziare il dottor David Spiller e l'Università di Manchester sistemi microscopia Core Facility per l'uso delle attrezzature, il Prof. Richard Baines per l'uso di DanioVision e Dr. Jack Rivers-Auty per la consultazione statistica. La linea BBH è stata gentilmente condivisa da Nicole Munsie dal laboratorio del dottor Sarah Child presso l'Università di Calgary. Ringraziamo anche il Prof. Stephen Renshaw, il dottor Adam Hurlstone, il dottor Andrew Badrock e il dottor Helen Young per le linee e le attrezzature per il pesce.
Questo studio è stato supportato da NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) e British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Siamo anche particolarmente grati alla Natalie Kate Moss Trust e alla facoltà di biologia, medicina e sanità dell'Università di Manchester per il loro continuo sostegno finanziario.

I zebrafish sono stati allevati e mantenuti presso l'unità di servizi biologici dell'Università di Manchester in condizioni standard come descritto in precedenza21. L'allevamento di pesce zebra per adulti è stato approvato dall'Università di Manchester per il benessere degli animali e il Comitato di revisione etico. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le normative britanniche Home Office (PPL: P132EB6D7).
Nota: le linee transgeniche utilizzate in questo studio includono il lignaggio specifico per il macrofago MPEG1:mCherry (costruito internamente come descritto in precedenza22), MPOspecifico per i neutrofili: GFP23,GATA1 specifico eritroide: DsRed24 e Ubiq:secannexinv-mvenus, un reporter per la morte delle cellule (ri-derivato in casa25)su Wild-Type, Nacre (mitfaW2/W2) e Mutant (BBHm292) sfondi. Figura 1 Mostra la Timeline sperimentale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1 : Grafico della timeline sperimentale per caratterizzare la lesione cerebrale, i risultati riabilitazione Locomotor e NEUROINFIAMMATORI. ICH, emorragia intracerebrale; BBH, Bubblehead. La figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a> 
1. giorno 0: produzione e raccolta delle uova
<ol><li>Raccogli gli embrioni fecondato dalla deposizione naturale in scatole di allevamento prodotte da 1 maschio e 1-2 femmine di pesce zebra adulta. Nota: per il protocollo atorvastatina è possibile utilizzare qualsiasi tipo di animale selvatico/transgenico, tuttavia i tassi di emorragia differiscono leggermente tra i ceppi.</li>
	<li>Incubare 100 embrioni a 28 ° c nel mezzo embrionale standard E3 per capsula di Petri e stadio secondo le linee guida standard26.</li>
	<li>A ~ 6 ore dopo la fertilizzazione (HPF) rimuovere gli embrioni morti e non fertilizzati dal piatto utilizzando una pipetta Pasteur.</li>
</ol>2. giorno 1: trattamento con atorvastatina a 24 HPF
<ol><li>Embrioni dechorionate per il trattamento con atorvastatina utilizzando pinze di dissezione ultra sottili e affilate27. I numeri richiesti per la sperimentazione possono essere regolati di conseguenza.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di mezzo embrionale E3 a due piatti puliti di Petri. Utilizzare un piatto per 100 embrioni. Nota: se le piastre sono progettate per la coltura cellulare, il pesce zebra dechorionato in questa fase precoce si attacca spesso al fondo. Per evitare questo, risciacquare accuratamente le piastre in acqua pulita prima dell'uso.</li>
	<li>Rimuovere 60 μL di acqua embrionale dalla piastra di trattamento e aggiungere 60 μL di 0,5 mM di atorvastatina (ATV). Con una concentrazione di 0,5 mM, la diluizione di cui sopra si tradurrà in una concentrazione finale di 1 μM che si tradurrà in ~ 20% delle larve non emorragie (ICH-) e ~ 80% delle larve emorragie (ICH +). Utilizzare l'altra piastra per i controlli non trattati Nota: l'atorvastatina è solubilizzata in acqua distillata (3 mg in 10 mL) per fare una soluzione di stock di 0,5 mM. Incubare durante la notte a temperatura ambiente al buio con agitazione come solubilizzazione richiede un certo tempo. La solubilizzazione completa può richiedere fino a 1 settimana. Non usi DMSO. La soluzione è aliquotato e conservato a-20 ° c. Non congelare il scongelamento.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 100 embrioni in meno acqua possibile alle piastre di trattamento.</li>
	<li>Incubare le piastre a 28 ° c. Nota: ICH si verificherà tra 33 e 48 HPF. Atorvastatina non ha bisogno di essere rimosso come incubazione più di 24 h non provoca ulteriori problemi di sviluppo.</li>
</ol>3. giorno 2: separare le popolazioni ICH-e ICH + a 50 HPF
<ol><li>Separare il pesce ICH + dalle popolazioni ICH e trasferirli in nuovi piatti per facilitarne la facilità.<ol>
<li>Se si utilizza il modello ATV ad una concentrazione di 1 μM, 75-100% delle larve esporrà emorragia (ICH +) in questo punto temporale. Nota: la risposta delle larve differisce tra ceppi, se le larve non sono emorragie alle frequenze desiderate, utilizzare un lotto fresco di atorvastatina o una maggiore concentrazione. Se le larve non hanno esposto l'emorragia da 48 HPF poi considerarli ICH-.</li>
		<li>Se si utilizza il modello BBH, tutti i mutanti omozigoti esporranno l'emorragia di 48 HPF. Se si utilizza un incross eterozigote, i fratelli ICH-eterozigoti e wildtype possono essere utilizzati come animali di controllo per gli esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se necessario, anestetizzare le larve aggiungendo 0,02% MS222 ai media E3. Usando una pipetta Pasteur, Ordina le larve per la presenza di sangue nella testa in nuovi media E3. Vedere la Figura 2. Nota: il sangue nella testa può comparire nella parte anteriore, centrale o posteriore del cervello o in combinazione, e il volume di sanguinamento può variare tra gli animali. Nei mutanti BBH, l'ICH è spesso associato a un edema grave riconoscibile da teste più grandi, uno spazio più ampio tra gli occhi e un sanguinamento più diffuso. Tuttavia non tutte le larve ICH + BBH presentano edema.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 2 : Ich + fenotipi di emorragia cerebrale. Esempi di fenotipi di larvale ich mantenuti su uno sfondo transgenico GATA1: DsRed reporter Nacre osservato con uno stereomicroscopio campo chiaro (pannelli superiori) e fluorescenza (pannello inferiore) a ~ 48 h post-fertilizzazione. Non sono state osservate emorragie nelle larve di ICH (pannelli di sinistra). Un distinto accumulo di globuli rossi nel proencefalo e nel cervello posteriore (frecce) sono stati osservati nelle larve ICH + (pannelli a destra). Le barre di scala rappresentano 250 μm. la figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a> 
4. giorno 3: morte cellulare e analisi dei leucociti a 72 HPF
<ol><li>Schermo le larve utilizzando un microscopio a fluorescenza per garantire l'espressione di proteina fluorescente. Nota: in questo studio, le larve transgeniche Ubiq: secannexinv-mvenus sono state utilizzate per segnalare la morte delle cellule cerebrali e il doppio MPOtransgenico: GFP; MPEG1: mCherry o Ubiq: Secannexinv-mvenus; MPEG1: mCherry utilizzato per l'analisi dei leucociti.</li>
	<li>Riempire la camera di montaggio lightsheet con il supporto E3 contenente 0,02% MS222.</li>
	<li>Anestetizzare le larve utilizzando 0,02% MS222. Trasferire le larve per il montaggio (n = 1-6) su una superficie secca di Petri in una singola gocciolina. Rimuovere il più liquido possibile. Nota: 1,5% di agarosio a bassa fusione è preparato utilizzando 0,15 g di agarosio a bassa fusione disciolto in 10 mL di E3 medio senza blu di metilene in un forno a microonde e mantenuto a 45 ° c fino all'uso.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di 1,5% di agarosio a bassa fusione (mantenuto come liquido in un blocco di calore 45 ° c) alle larve e utilizzando un capillare di montaggio di 800 μm, e tirare prima le larve in testa. Se il posizionamento non è accurato le larve possono essere espulse dall'agarosio e montate di nuovo. Lasciare raffreddare il capillare prima di inserirli nella camera del foglio luminoso. Nota: in alternativa, per questa procedura è possibile utilizzare un microscopio confocale. Per questo, le larve devono essere montate lateralmente in agarosio su un piatto di fondo di vetro.</li>
	<li>Acquisisci immagini z-stack della testa tra le lenti oculari (~ 300 μm) e elabora l'immagine di proiezione a massima intensità.<ol>
<li>Analizza la regione del cervello dalle immagini raccolte per il numero totale di cellule fluorescenti e la fluorescenza a intensità totale20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creare un video time lapse di più compositi di proiezione oltre 18-24 h per monitorare la mobilità dei leucociti e l'interazione con le cellule morenti. Nota: se si esegue l'imaging Live a lungo termine, solo una larva è montata nel capillare.</li>
	<li>Quando l'imaging è completato espellere le larve dal capillare di montaggio in un sovradosaggio letale di 4% MS222 a eutanasia.</li>
</ol>5. giorno 3: selezione delle larve per il saggio di motilità a 72 HPF
<ol><li>Anestetizzare le larve nei piatti di Petri con 0,02% MS222.</li>
	<li>Selezionare casualmente n = 24 larve per il saggio di motilità e trasferire in nuovi media E3 e consentire agli animali di recuperare da anestetico. Nota: anestetico a questo punto rimuove la polarizzazione di selezione per i nuotatori lenti che sono facili da catturare.</li>
</ol>6. giorno 3-5: locomozione Assaying a 72, 96 e 120 HPF
<ol><li>Trasferire le larve selezionate a 72 HPF in E3 Media senza blu di metilene. Nota: per l'assestamento a 3 DPF, le larve hanno un ampio tempo per riprendersi dall'anestetico (&gt; 1 h).</li>
	<li>Piastra una larva in 1 mL per pozzetto di una piastra 24-Well con una pipetta. Nota: tagliare l'estremità della punta della pipetta per evitare di danneggiare le larve. Le dimensioni del piatto possono essere modificate in base alla progettazione sperimentale.</li>
	<li>Caricare le piastre nella camera della fotocamera e il movimento del saggio per 10 minuti utilizzando una routine di luce bianca per aumentare il nuoto spontaneo. Nota: il comportamento di nuoto è stato monitorato utilizzando una camera della fotocamera e il software di tracciamento (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Ripeti l'esperimento con le stesse larve a 96 e 120 HPF. Spostare le larve dall'alloggiamento individuale nella piastra di dosaggio in una capsula di Petri e incubare a 28 ° c tra i dosaggi.</li>
	<li>Al completamento del saggio, eutanasia larve in un sovradosaggio letale di 4% MS222.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo studio mostra che l'ich nelle larve di pesce zebra induce una risposta al trauma cerebrale che riassume gli aspetti chiave della condizione umana che possono essere sistematicamente analizzati e quantificati. Zebrafish offre un modello coerente e riproducibile di ICH spontaneo che aiuterà con futuri studi di intervento farmacologico focalizzati sul bersaglio di lesioni cerebrali indotta dal sangue, piuttosto che prevenire la rottura della nave17,28. Infatti, data la rapida natura dell'insorgenza della malattia simile alla situazione clinica, tale approccio offre interessanti prospettive per la traduzione di successo in futuro.
Alcune limitazioni sono associate all'uso di larve di pesce zebra, come l'uso di un sistema di sviluppo e di rango tassonomico, tuttavia i vantaggi pratici e scientifici di questo modello devono essere considerati per offrire nuove intuizioni in ich. Non è necessario alcun intervento chirurgico per avviare un'emorragia o per monitorare i processi cellulari per lunghi periodi di tempo dopo la lesione. Alta fecondità di abbinamenti pesce zebra generano dimensioni del campione facilmente accessibili e grandi, e a causa del rapido sviluppo delle larve la Timeline sperimentale è significativamente ridotta rispetto agli studi sui roditori29,30.
Attualmente questi modelli sono idonei all'uso per chiarire la risposta patologica e immunologica immediata all'ICH spontaneo nel cervello degli animali vivi intatti. Potenzialmente, questo modello può essere adattato per schermi di droga a medio-alta velocità per le terapie ICH, sia preventivo o recupero promozione. Come tale, le patologie post-ICH presentate in questo studio rappresentano una piattaforma alternativa, complementare per la ricerca pre-clinica di ICH.

Emorragia intracerebrale (ICH) è il Sub-tipo più grave di ictus associato con la rottura del vaso cerebrale spontaneo e sanguinamento nel parenchima che conduce a danni cerebrali, disabilità fisica e spesso la morte1. Nonostante l'alto tasso di mortalità e morbilità associato a ICH2, manca ancora la comprensione dell'eziologia alla base e della patologia post-emorragia. Come tale, non ci sono trattamenti specifici per prevenire ICH o migliorare i risultati dei pazienti. La maggior parte della nostra comprensione della biologia delle malattie è venuto da modelli di roditori pre-clinici di ich3, tuttavia gli studi finora in questi modelli non sono riusciti a tradurre qualsiasi terapeutico di successo per la clinica4,5. Questo fallimento può essere dovuto in parte, ad alcune limitazioni di questi modelli preclinici, tra cui l'incapacità di ricapitolare facilmente la natura spontanea della malattia umana e il requisito di chirurgia invasiva per generare i modelli nei mammiferi6. Inoltre, i roditori pongono problemi pratici per quanto riguarda l'osservazione della rapida insorgenza delle risposte cellulari all'ICH nel tessuto intatto. Data la mancanza di traduzione da modelli di roditori, lo sviluppo di modelli alternativi di ICH spontanea è imperativo se vogliamo superare questi problemi pratici e contribuire a identificare nuovi bersagli di droga.
I meccanismi molecolari dello sviluppo vascolare sono ben conservati tra i vertebrati tra cui il pesce zebra (Danio rerio)7. Come tale, l'adozione di questo organismo modello sta diventando una strategia meccanicistica sempre più utile per lo studio della malattia cerebrovascolare8. Sono stati generati diversi modelli di pesce zebra che ricapitolano i fenotipi associati alle condizioni relative al tratto9,10,11,12. L'uso di larve di pesce zebra per indagare sulla patogenesi delle malattie offre vantaggi pratici e scientifici rispetto ai modelli di mammiferi8. Questo include elevati tassi di riproduzione, rapido sviluppo e trasparenza larvale che consente l'imaging intravital senza i vincoli invasivi associati ai roditori. L'accoppiamento di questi vantaggi con l'ampia gamma di linee reporter transgeniche disponibili all'interno della comunità di ricerca del pesce zebra equivale a un potente approccio in vivo per lo studio della biologia delle malattie, non ancora utilizzato per lo studio della patologia patologica conseguenze di ICH.
La risposta di lesione al sangue nel cervello è bifasica13; l'insulto primario provoca la morte neuronale e la necrosi cellulare, che poi avvia un'ondata secondaria di danno che è indotta dall'attivazione immunitaria innata. La seconda fase della lesione cerebrale, in particolare la componente neuroinfiammatoria, è considerata un bersaglio realistico per il futuro trattamento farmacologico13. Le emorragie spontanee e specifiche cerebrali sono state descritte nelle larve di pesce zebra precedentemente14,15,16,17,18,19. Due di questi modelli sono l'uso di atorvastatina (ATV) a 24 h post-fecondazione (HPF) per inibire la via HMGCR e biosintesi del colesterolo14, e un mutante di incompetente (BBH) che esprimono una mutazione ipomorfico nel gene arhgef7 , βpix, e successivamente inibisce il rimodellamento dell'actina per giunzioni endovascolare strette18. Questi modelli presentano una rottura del vaso sanguigno cerebrale-specifica spontanea all'inizio della circolazione (~ 33 HPF). Recentemente, abbiamo caratterizzato questi modelli ulteriormente per rivelare che gli aspetti chiave della risposta al danno cerebrale è conservato tra gli esseri umani e larve di pesce zebra20. Questo studio illustra la metodologia necessaria per ottenere e visualizzare le emorragie cerebrali spontanee nelle larve di pesce zebra e come quantificare la lesione cerebrale, e i fenotipi riabilitazione Locomotor e NEUROINFIAMMATORI che si riferiscono alla condizione umana. Questi dati e tecniche sostengono l'uso di questa specie di modello come un prezioso sistema complementare per la ricerca pre-clinica di ICH.

<table><tbody><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>28 &deg; Incubatrice C</td><td>LMS</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>Atorvastatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0001-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Scatole di allevamento</td><td>Sistemi acquatici Thoren</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Camera di osservazione Daniovision</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E3 medium 1x</td><td></td><td></td><td>4% Instant Ocean, 500 &; L blu di metilene in 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Software EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td>versione 11</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Grant-Bio</td><td>PHMT-PSC18</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Lightsheet</td><td>Zeiss</td><td>Z.1</td><td></td></tr><tr><td>Capillare di montaggio per microscopio Lightsheet</td><td>Zeiss</td><td>402100-9320-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a basso punto di fusione di agarosio</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319112-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Microscopio da dissezione</td> <td>Leica</td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Microscopio Microscopio</td><td>fluorescente</td><td>Leica</td><td>M165FC</td></tr><tr><td>MS222</td><td></td><td></td><td>4g di tricaina in polvere, 500 mL di dH2O, 10 mL di 1 M Tris (pH 9). Regolare il pH a ~7</td></tr><tr><td>Pipetta P1000 Puntali</td> per pipette <td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Pipette Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Starlab</td><td>E1414-0300</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri&nbsp;</td><td>Corning</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra Biosciences</td><td>PIPETBOY</td><td></td></tr><tr><td>Stripette 25ml</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per dissezione ultra fine</td><td>Agar scientific</td><td>AGT502</td><td></td></tr><tr><td>Software Zen</td><td>Zeiss</td><td>versione 2.3</td><td></td></tr></tbody></table>

uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Nonostante sia il sottotipo più grave di ictus con elevata mortalità globale, non esiste un trattamento specifico per i pazienti con emorragia intracerebrale (ICH). Modellazione ICH pre-clinicamente ha dimostrato difficile, e modelli di roditori attuali scarsamente ricapitolare la natura spontanea del ICH umano. Pertanto, vi è un requisito urgente per le metodologie precliniche alternative per lo studio dei meccanismi di malattia in ICH e per la potenziale scoperta di farmaci.
L'uso di pesce zebra rappresenta un approccio sempre più diffuso per la ricerca traslazionale, principalmente a causa di una serie di vantaggi che possiedono sui modelli di malattia dei mammiferi, compresi i tassi di riproduzione prolifico e la trasparenza larvale che consente di vivere Imaging. Altri gruppi hanno stabilito che le larve di pesce zebra possono esibire un ICH spontaneo a seguito di rottura genetica o chimica dello sviluppo cerebrovascolare. L'obiettivo di questa metodologia è quello di utilizzare tali modelli per studiare le conseguenze patologiche dell'emorragia cerebrale, nel contesto della ricerca pre-clinica di ICH. Utilizzando analisi Live di imaging e motilità, danno cerebrale, neuroinfiammazione e funzione locomotore dopo ICH possono essere valutati e quantificati.
Questo studio mostra che le principali conseguenze patologiche dell'emorragia cerebrale negli esseri umani sono conservate nelle larve di zebra che evidenziano l'organismo modello come un prezioso sistema in vivo per le indagini pre-cliniche di ICH. L'obiettivo di questa metodologia è quello di consentire alla comunità di ictus preclinico di impiegare il modello larvale del pesce zebra come sistema alternativo complementare ai roditori.

Valutazione della morte delle cellule cerebrali utilizzando Ubiqtransgenico: secannexinv-mvenus risultati in chiari cluster definitivi di cellule morenti nelle larve ich + in entrambi i modelli ATV e BBH che sono assenti in tutte le larve ich-(Figura 3). I cluster si recedere prima di 96 HPF. Attraverso l'analisi delle immagini, il sanguinamento è associato ad un significativo aumento di due volte dell'intensità totale del segnale di fluorescenza nel cervello, indicando la morte cellulare marcata.
Una risposta neuroinfiammatoria è identificata nelle larve ICH + dal numero significativamente aumentato di cellule macrofage positive MPEG1 nel cervello. Il numero di cellule di neutrofili totali MPO positive anche aumentato tuttavia questo non ha raggiunto la significatività statistica (Figura 4). La morfologia dei macrofagi positivi MPEG1 può anche essere visto per cambiare nelle larve ich + come le cellule adottano una forma attiva, arrotondata, ameboide. Queste cellule arrotondate attivate possono anche essere monitorate nel tempo per mostrare una risposta fagocitica aumentata dell' Ubiq:secannexinv-mvenus che esprime le cellule morenti nelle larve ich + (Figura 5). i macrofagi positivi di MPEG1 che espongono processi ramificati sono stati classificati come inattivi.
L'emorragia cerebrale è associata ad una significativa diminuzione della motilità a 72 e 96 HPF rispetto ai controlli ich-fratello nei modelli BBH e ATV (Figura 6). Motilità a 120 HPF recupera a livelli di base vicino. Ci sono spesso differenze nella motilità basale tra le frizioni di uova e ceppi e quindi il confronto dovrebbe essere fatto a ICH-controlla ogni volta.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Figura 3 : L'emorragia intracerebrale (Ich) nelle larve di pesce zebra provoca una lesione cerebrale quantificabile. A) immagini rappresentative del fenotipo di lesione cerebrale nelle larve ich + (pannelli a destra), rispetto ai fratelli ich (pannelli di sinistra), a 72 HPF. Le immagini di campo chiaro (pannelli inferiori, barra di scala = 250 μm) dimostrano la presenza di sanguinamenti cerebrali (frecce) nelle larve ICH +. La microscopia fluorescente è stata eseguita per visualizzare la morte cellulare nella linea di reporter Ubiq:secannexinv-mvenus (pannelli superiori, barra di scala = 100 μm). I grappoli di cellule morenti sono stati osservati nelle regioni peri-ematiche. Le immagini sono state ritagliate in regioni solo cerebrali e analizzate per l'intensità totale della fluorescenza verde in particelle rotonde superiori a 30 pixel di diametro (linea bianca) utilizzando la macro nel file supplementare 1. B) quantificazione del segnale di fluorescenza nel cervello delle larve non trattate, ICH e ich + ottenute attraverso il modello ATV (n = 12 per gruppo; 3 repliche indipendenti) a 72 HPF. Differenze significative sono state osservate quando si confrontano ICH + con non trattati (* * p = 0,004) e con i fratelli ICH-(* p = 0,03). C) quantificazione del segnale di fluorescenza come lettura per l'annessione di un legame nel cervello delle larve ich-e ich + ottenute attraverso il modello incompetente (BBH) (n = 12 per gruppo; 2 repliche indipendenti) a 72 HPF. I grafici mostrano SD dalla media. Una differenza significativa nella fluorescenza di mVenus è stata osservata tra i fratelli ICH + e ICH-abbinati all'età (* * p = 0,002). La figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Figura 4 : Emorragia intracerebrale (Ich) avvia una risposta immunitaria cellulare innata nel cervello larvale pesce zebra. Numero di leucociti quantificati all'interno delle regioni cerebrali precedentemente descritte per MPO: GFP; MPEG1: doppie larve transgeniche (n = 8 per gruppo; 2 replicati indipendenti) a 72 HPF rivela un aumento significativo dei macrofagi (* p = 0,01), ma non neutrofili (p = 0,5), in risposta a ICH. La figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Figura 5 : Le cellule di macrofage attivate mostrano una risposta fagocitica alla lesione cerebrale. A) le alambicchi time-lapse rappresentative20 che mostrano un macrofago di pattugliamento ramificato che migra verso un'annessa cellula positiva (i-vi). Le stills sono ottenute da una serie di immagini scattate di tutto il cervello utilizzando un obiettivo 20x. La barra della scala rappresenta 50 μm. Il macrofeta ha acquisito una morfologia amoeboide (v) prima di fagocitoare la cellula annessa-positiva (vi, VII). Dopo la fagocitosi il macrofago riprende una morfologia ramificata e migra via e la cellula annessa-positiva non può più essere vista (VIII). Macrofage ramificato (#), annessa cellula positiva (freccia), macrofage amoeboide (*) sono indicati. B) immagini rappresentative di cellule positive MPEG1nel cervello larvale ich-e ich + che presentano morfologie di amoeboidi e ramificate. Le barre di scala rappresentano 50 μm. (C) una percentuale aumentata di amoeboide (fagocitica) e una diminuzione della proporzione di macrofagi ramificati (inattivi) sono state osservate nei cervelli ich + rispetto ai fratelli ich. La figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Figura 6 : La lesione cerebrale indotta da ich provoca un deficit locomotore quantificabile nelle larve di pesce zebra. A) esempi rappresentativi delle piste da nuoto nelle larve ich-e ich + bbh a 72, 96 e 120 HPF. (B) ich + larve ha mostrato una diminuzione significativa del tempo cumulativo trascorso mobile durante il periodo di registrazione di 10 min sia a 72 e 96 HPF. La significatività è stata persa al 120 HPF Time Point potenzialmente alludendo al recupero da lesione cerebrale (n = 24 larve per gruppo; 3 repliche indipendenti; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). C) quantificazione del tempo cumulativo impiegato per lo spostamento nelle larve di ich-e ich + trattate con ATV e trattati con quad a 120 HPF. Le larve ICH + hanno mostrato una significativa diminuzione del tempo cumulativo speso mobile durante il periodo di registrazione di 10 minuti. Sono stati utilizzati tre replicati tecnici (n = 24 larve per gruppo) per calcolare l'SD dalla media (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). La figura è stata riprodotta da Crilly et al.20 con l'autorizzazione di una licenza Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a> 
File supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui vi presentiamo un protocollo per quantificare la lesione cerebrale, deficit riabilitazione Locomotor e neuroinfiammazione dopo sanguinamento nel cervello nelle larve di pesce zebra, nel contesto dell'emorragia intracerebrale umana (Ich).

Uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Questo metodo fornisce un approccio preclinica gratuito per studiare la risposta cellulare immediata al sangue nel cervello a seguito di un ictus emorragico, una condizione molto grave per la quale non abbiamo farmaci specifici disponibili per i pazienti. A differenza dei modelli di roditori, la trasparenza delle larve di zebrafish ci consente di osservare le risposte cellulari all'interno del cervello di animali vivi intatti in tempo reale utilizzando la microscopia fluorescente. Per iniziare, utilizzare un colino da tè per raccogliere tutti gli embrioni fecondati dalla deposizione delle uova naturali nelle scatole di riproduzione prodotte da un maschio e da una a due femmine di zebrafish adulti.Trasferire 100 embrioni in ogni piastra di Petri contenente il mezzo embrione standard E3. Incubare a 28 gradi Celsius e fase secondo le linee guida standard. A sei ore dopo la fecondazione, rimuovere embrioni morti e non fecondati dal piatto usando una pipetta Pasteur e rimettere i piatti nell'incubatrice.A 24 ore dopo la fecondazione, sotto un microscopio stereo a campo brillante, utilizzare forcep di dissezione ultra sottile affilati per decorionare gli embrioni per il trattamento con atorvastatina. Quindi aggiungere 30 millilitri di embrione E3 medio a due piastre di Petri pulite, una per il trattamento e l'altra per il controllo. Rimuovere 60 microlitri di acqua embrionale dal piatto di trattamento e aggiungere 60 microlitri di 0,5 millimolare Atorvastatina per ottenere l'80% delle larve emorragie.Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 100 embrioni nella massima acqua possibile ad ogni piatto. Incubare i due piatti a 28 gradi Celsius. In qualsiasi momento dopo 50 ore dopo la fecondazione, al microscopio utilizzare una pipetta Pasteur per separare accuratamente il pesce emorragico dalle popolazioni non emorragiche e trasferire le larve a nuovi piatti contenenti mezzi E3 freschi.Per rendere più facile separare le larve positive all'emorragia, è possibile utilizzare pesci senza pigmento o pesci che esprimono proteine fluorescenti nei globuli rossi. Il terzo giorno, sotto uno schermo al microscopio fluorescente le larve per garantire l'espressione di proteine fluorescenti. Quindi riempire la camera di montaggio della lastra luminosa con supporti E3 contenenti lo 0,2%MS-222 per l'anestesia.Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire una singola goccia contenente da una a sei larve su una superficie asciutta della piastra di Petri per il montaggio. Utilizzare una pipetta per rimuovere il più liquido possibile. Aggiungere una goccia di agarosio a bassa fusione dell'1,5% dal blocco termico di 45 gradi Celsius alle larve e utilizzare un capillare di montaggio di 800 micrometri per disegnare prima le larve sulla testa.Se il posizionamento non è accurato, espellere le larve dall'agarosio e montare di nuovo. Lasciare raffreddare il capillare e quindi inserirlo nella camera del foglio luminoso. Sul software di imaging ZEN, premere continuo per orientare le larve e premere acquisire per acquisire immagini z-stack della testa tra le lenti oculari.Nella scheda di elaborazione generare un'immagine di proiezione di intensità massima da ogni z-stack. Per selezionare casualmente per il test di motilità, trasferire 24 larve dopo l'anestesia in mezzi E3 freschi e consentire agli animali di riprendersi dall'anestesia. Dopo che le larve si sono completamente riprese dall'anestesia, utilizzando una pipetta con il trasferimento del taglio finale larve recuperate nel mezzo E3 senza blu metilene.Placcare una larva in un millilitro per pozzo di un piatto di 24 pozzetto. Caricare la piastra nella camera della fotocamera. Nel software di tracciamento EthoVision XT, regola le impostazioni dell'esperimento per impostare una routine di startle a luce bianca per aumentare il nuoto spontaneo e il movimento del test per 10 minuti.Ripetere il saggio di locomozione a 96 e 120 ore dopo la fecondazione. La valutazione della morte delle cellule cerebrali utilizzando un'ubiquitina transgenica secreta annexin V M venous reporter line si traduce in chiari ammassi definiti di cellule morenti in larve emorragiche che sono assenti in tutte le larve non emorragiche indicate da fluorescenza verde Le immagini a campo luminoso dimostrano la presenza di sanguinamenti cerebrali. Le cellule morenti sono state osservate sia nei modelli di Atorvastatina che in quello della testa di bolla per le larve emorragiche.La morfologia dei macrofagi positivi MPEG1 cambia nelle larve positive dell'emorragia intracerebrale mentre le cellule adottano in forma ameboide arrotondata attiva. Queste cellule arrotondate attivate sono state monitorate nel tempo per mostrare una maggiore risposta fagocitica dell'ubiquitina secreta Annexin V M venous che esprime cellule morenti in larve positive di emorragia intracerebrale. L'emorragia cerebrale è associata a una significativa diminuzione della motilità a 72 e 96 ore dopo la fecondazione rispetto ai controlli dei fratelli negativi dell'emorragia intracerebrale.La motilità a 120 ore dopo la fecondazione si riprende vicino ai livelli di base. L'aspetto più importante di questa procedura è assicurarsi di esaminare a fondo le larve per la presenza o l'assenza di emorragie cerebrali prima di procedere ai test di fenotipizzazione. Questo modello può anche essere utilizzato per lo screening farmacologico per determinare se la gravità del fenotipo può essere migliorata dopo una sanguine, un approccio che potrebbe portarci a identificare nuovi candidati alla droga in futuro.Questa tecnica ci permette di esplorare le risposte cellulari immediatamente dopo un'emorragia cerebrale durante un momento che è stato così notoriamente difficile da studiare prima d'ora. Sebbene nessuno dei reagenti o degli strumenti descritti in questo protocollo sia specificamente pericoloso, le cure e le precauzioni standard devono essere prese ogni volta che si utilizzano sostanze chimiche, taglienti o laser.

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Questo video mostra un metodo per studiare la lesione cerebrale larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala (STEM), una tecnica che combina elementi di microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per produrre immagini ad alta risoluzione. Descrive le fasi coinvolte nella preparazione dei campioni e nell'acquisizione di immagini STEM ad alta risoluzione per identificare le lesioni cerebrali.

Indagine su una lesione cerebrale larvale di pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala

In questo video, gli embrioni fecondati di zebrafish vengono decorionati sotto uno stereomicroscopio e poi esposti a un inibitore della sintesi del colesterolo, portando allo sviluppo di rotture dei vasi sanguigni ed emorragie cerebrali nelle larve. Le larve emorragiche, identificabili da macchie rosse distinte, vengono successivamente separate al microscopio per ulteriori analisi.

Modellazione dell'emorragia indotta da farmaci nella larva di pesce zebra

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Questo articolo descrive un metodo per creare una lesione meccanica del vaso negli embrioni di zebrafish. Questo modello di lesione fornisce una piattaforma per lo studio dell'emostasi, dell'infiammazione correlata alla lesione e della guarigione delle ferite in un organismo ideale per la microscopia in tempo reale.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l'iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell'amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l'accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l'intervento farmacologico.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un'ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l'eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Il presente protocollo descrive l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.

Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina

Impara a quantificare lesioni cerebrali, deficit locomotori e neuroinfiammazione nelle larve di zebrafish dopo emorragia intracerebrale. Questo modello preclinico consente l'osservazione in tempo reale delle risposte cellulari.

Uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica

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