Un portacampioni all-in-one per la cristallografia a raggi X macromolecolare con una dispersione minima dello sfondo
6 luglio 2019
Viene presentato un nuovo supporto campione per la cristallografia macromolecolare a raggi X insieme a un protocollo di manipolazione adatto. Il sistema consente la crescita dei cristalli, l'ammollo cristallino e la raccolta dei dati di diffrazione in situ sia a temperatura ambiente che criogenica senza la necessità di alcuna manipolazione o montaggio del cristallo.
Questo portacampioni può essere utilizzato per la coltivazione di cristalli e la raccolta di dati di diffrazione a raggi X. Questo portacampioni è stato realizzato per l'uso su piastre a 24 pozzi che sono ampiamente utilizzate nella comunità MX. L'aspetto molto importante è che non è necessaria alcuna manipolazione.
Un portacampioni con questi aspetti qui descritti non esisteva prima. Vedere qualcosa è sempre molto meglio che leggerlo. Guardando il video, un potenziale utente può cogliere immediatamente le caratteristiche e le complessità del nuovo portacampioni.
Per iniziare, creare una superficie pulita e priva di polvere utilizzando un panno umido e privo di pelucchi. Prendere un portacampioni dalla sua scatola e posizionarlo delicatamente, foglio giallo rivolto verso l'alto, sulla superficie pulita per evitare danni o punture indesiderate del foglio COC sul retro. Impostare le gocce di cristallizzazione sulla lamina gialla come sarebbe fatto su vetrini di copertura comunemente usati.
Posizionare delicatamente le gocce per evitare rotture o piercing del foglio utilizzando una pipetta. Sui supporti campione di tipo 2 e tipo 3, due gocce sono il massimo raccomandato. Su un portacampioni di tipo 1, è possibile posizionare fino a tre gocce.
Capovolgere il portacampioni e posizionarlo su una cavità pre-unta di una piastra in stile Linbro da 24 po '. Utilizzare gli ausili per il posizionamento del portacampioni per guidarlo nella sua posizione ottimale. Assicurarsi la corretta posizione del portacampioni al fine di evitare evaporazione indesiderata.
Posizionando la piastra di cristallizzazione al microscopio a luce di trasmissione, senza o senza polarizzatori, monitorare la crescita del cristallo senza alcun disturbo dell'esperimento. Eseguire la crioprotezione al microscopio a luce di trasmissione. Perforare delicatamente il foglio COC esterno usando una canula fine.
Assicurarsi che la lamina gialla interna rimanga intatta. La puntura dovrebbe essere proprio accanto alla goccia che deve essere manipolata. Inserire uno stoppino di carta fine nel foro in biforcazione.
Spingere con cura lo stoppino in avanti fino a tocchi il foglio giallo di poliimmide. Tenere lo stoppino a contatto con il foglio perforato. Lo stoppino succhierà via tutta la soluzione in eccesso.
Il tempo necessario per la completa rimozione del liquido dipende dalla viscosità delle soluzioni e dalla composizione del liquore madre. Dopo che tutto il liquido viene aspirato, ritrarre delicatamente lo stoppino di carta. Ricorda la posizione della goccia, poiché potrebbe non essere visibile dopo la rimozione del liquore madre.
Prendi una pipetta standard per applicare un piccolo volume di soluzione crio-protettore, utilizzando una punta estrusa attraverso lo stesso foro. Per risigillare il foglio COC auto-guarinte, posizionare delicatamente un dito protetto sul foro per circa un secondo e farlo scorrere attraverso la puntura. La leggera pressione in combinazione con l'elevata temperatura promuoverà la risigillatura di forature che non sono troppo grandi.
Sciogliere il ligando nel liquore madre nella concentrazione desiderata in un tubo di reazione. Ruotare la soluzione per 10 minuti a 12.000 volte g per rimuovere le particelle insolubili. Se necessario, utilizzare una centrifuga a temperatura controllata.
Posizionare delicatamente un massimo di tre microlitri di soluzione contenente ligando nello spazio tra il foglio COC e il film di poliimmide utilizzando una punta di pipetta lunga ed estrusa;ritrarre la punta. Per risigillare il foglio COC auto-guarinte, posizionare delicatamente un dito protetto sul foro per circa un secondo e farlo scorrere attraverso la puntura. Incubare l'esperimento per qualche tempo per consentire la diffusione attraverso la membrana.
Il tempo di ammollo dipende fortemente dalla viscosità della soluzione diffusiva e dai suoi componenti. Ripetere più volte i passaggi di ammollo del ligando per immergere successivamente diversi ligandi. Per ridurre al minimo lo scattering del solvente, rimuovere la soluzione in eccesso prima della raccolta dei dati.
Garantire un ambiente beamline stabile e controllato dall'umidità con condizioni prestabilite. Per eseguire la raccolta dei dati di diffrazione in situ a temperatura ambiente, sollevare delicatamente la lamina COC trasparente nel punto designato utilizzando le forcep e staccarla. Ora sollevare delicatamente il portacampioni dalla cavità e inserirlo immediatamente in una base di supporto del campione magnetico pre-preparata.
Non è necessaria alcuna colla per questo passaggio. Applicare una pressione delicata per garantire il corretto posizionamento del supporto del campione all'interno della base. Per i portacampioni con un anello esterno rimovibile, applicare una leggera pressione tenendosi sull'anello esterno e interromperlo nei punti di interruzione designati.
L'esempio è ora pronto per la centratura e la raccolta dei dati di diffrazione. Montare il portacampioni su un goniometro beamline e garantire il corretto posizionamento del supporto. A seconda della geometria del goniometro, il portacampioni può essere ruotato fino a 160 gradi senza causare ombre durante l'esperimento di diffrazione.
Utilizzare uno stoppino di carta e toccare delicatamente il foglio giallo di poliimmide dal retro per rimuovere il liquore madre in eccesso. L'esempio è ora pronto per la centratura e la raccolta dei dati di diffrazione. Prepararsi per la raccolta dei dati di diffrazione in situ a temperatura criogenica come fatto per la temperatura ambiente, quindi immergere il campione in azoto liquido e trasferirlo in una fiala compatibile con spine.
La geometria del portacampioni di tipo 2 e 3 consente il loro trasferimento in flaconcini campione SPINE standard, che possono essere utilizzati per il montaggio di campioni assistiti da robot. Il portacampioni di tipo 1 e tipo 2 è stato progettato per adattarsi a un pozzo di una piastra in stile Linbro da 24 po '. Ogni singolo portacampioni contiene ausili per il posizionamento su entrambi i lati del bordo esterno al fine di garantire un posizionamento ottimale sul bordo del pozzo.
Una piastra in stile Linbro da 24 po 'è stata utilizzata con il portacampioni di tipo 1 per equilibrare una goccia a 293 Kelvin contro 500 microlitri di liquore madre. Cristalli da 40 a 50 micron sono stati osservati dopo cinque ore utilizzando un microscopio a luce di trasmissione con o senza polarizzatore. Un portacampioni con cristalli di lisozima bianco-uovo di gallina è stato posto in un flusso d'aria controllato dall'umidità sulla linea di fascio HZB-MX 14.3.
Qui viene mostrata una tipica immagine di diffrazione. Non è possibile rilevare uno scattering di sfondo elevato sull'immagine di diffrazione. È fondamentale evitare contaminazioni del foglio di poliimmide.
Inoltre, è importante che il supporto del campione sia posizionato con precisione e che la manipolazione dei cristalli sia eseguita con attenzione. Il portacampioni consente la movimentazione di cristalli molto delicati, uno dei passaggi più importanti della cristallografia micromolecolare. Il suo uso riduce notevolmente la possibilità di distruggere il campione.
Panoramica
Viene introdotto un nuovo portacampioni per la cristallografia a raggi X macromolecolare, che consente la crescita dei cristalli e la raccolta dei dati di diffrazione in situ a varie temperature senza manipolazione del cristallo.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Cristallografia a raggi X macromolecolare
- Tecniche di crescita dei cristalli
- Raccolta dei dati di diffrazione
Sfondo
- I metodi tradizionali richiedono la manipolazione dei cristalli, che può introdurre errori.
- I portacampioni esistenti non consentono una facile manipolazione durante gli esperimenti.
- Le piastre a 24 pozzetti sono comunemente utilizzate nella comunità MX per la cristallizzazione.
- Il monitoraggio della crescita dei cristalli senza disturbi è cruciale per risultati accurati.
Obiettivo dello studio
- Presentare un portacampioni che semplifi il processo di crescita dei cristalli e la raccolta dei dati.
- Eliminare la necessità di manipolazione del cristallo durante gli esperimenti.
- Fornire un protocollo per l'uso efficace del portacampioni.
Metodi utilizzati
- Preparazione di una superficie pulita per il portacampioni.
- Posizionamento delle gocce di cristallizzazione sul portacampioni.
- Monitoraggio della crescita dei cristalli utilizzando un microscopio a luce trasmessa.
- Raccolta dei dati di diffrazione in situ a temperature ambiente e criogeno.
Risultati principali
- Crescita cristallina di successo osservata con minima manipolazione.
- La raccolta dei dati ha prodotto immagini di diffrazione chiare senza dispersione di fondo.
- Portacampioni progettati per la compatibilità con piastre standard a 24 pozzetti.
- Protocolli efficaci di crioprotezione e bagnatura del ligando stabiliti.
Conclusioni
- Il nuovo portacampioni migliora significativamente la facilità degli esperimenti di cristallografia a raggi X.
- Consente un monitoraggio e una manipolazione efficienti dei processi di cristallizzazione.
- Questa innovazione può migliorare la qualità dei dati di diffrazione raccolti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Macromolecular X-ray crystallography remains a cornerstone for high-resolution structural biology in drug discovery, yet fragile crystal handling introduces significant risk of sample loss and data degradation. This all-in-one sample holder minimizes mechanical intervention during crystal growth, ligand soaking, cryoprotection, and data collection, thereby increasing the likelihood of obtaining usable diffraction data from delicate macromolecular crystals. By reducing handling-induced damage, the tool supports more reliable target structure determination, a critical early step in structure-guided drug design and lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of fragile macromolecular targets without inducing lattice damage during manipulation.
- Operational Value: Reduces crystal loss during ligand soaking and cryoprotection steps, improving success rates in early-stage target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports in situ monitoring of crystal growth and ligand diffusion under controlled conditions, enabling real-time assessment of compound binding.
- Operational Value: Eliminates need for crystal transfer between plates or mounts, streamlining workflow for high-throughput crystallization screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides structural data from native-state crystals preserved through minimal handling, enhancing confidence in target-ligand interaction models.
- Operational Value: Compatible with standard 24-well Linbro plates and SPINE vials, facilitating integration into automated crystal mounting and beamline pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The sample holder supports a seamless workflow from crystallization drop setup to in situ X-ray diffraction data collection at ambient or cryogenic temperatures, reducing transfer steps between discovery and structural validation stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing via structural observation of ligand-bound states without disrupting crystal integrity during screening.
- Screening: Provides a standardized, reusable platform for drop setup and monitoring, improving reproducibility across crystallization trials.
- Analytics: Yields low-background diffraction images suitable for quantitative electron density mapping and ligand pose validation.
- Translational Research: Maintains crystal viability from ambient screening to cryogenic data collection, supporting continuous structural analysis.
- Enterprise Reuse: Designed for repeated use across multiple targets and campaigns, reducing consumable waste and setup time in shared crystallography facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in structural data by minimizing handling-induced artifacts and preserving native crystal packing.
- Operational Value: Standardizes crystal manipulation steps, reducing variability and training burden across multidisciplinary teams.
- Strategic Value: Lowers failure rate in structure determination projects, improving return on investment in target validation efforts.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to incorrect target assumptions.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with micropipette techniques and fluorescence- or transmission-light microscopy for drop setup and monitoring.
- Dependent on access to beamlines equipped for in situ diffraction and humidity-controlled environments.
- Necessitates standardized training to ensure consistent foil piercing, wick use, and resealing procedures across users.
- Must account for variations in mother liquor viscosity when optimizing cryoprotectant and ligand soaking durations.
- Limited to compatible plate formats (e.g., 24-well Linbro-style) and may require adaptation for other crystallization screening platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Setting up Crystallization Drops and Observing Crystal Growth
1:56
Crystal Manipulation
4:23
In Situ Diffraction Data Collection at Ambient Temperature and at Cryogenic Temperature
6:20
Results: Novel Sample Holder in Macromolecular X-Ray Crystallography for Crystal Growth, Crystal Manipulation, and X-Ray Diffraction Data Collection
7:23
Conclusion
