Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro

Il nostro protocollo può essere ampiamente utilizzato per l'alta produttività e lo screening rapido delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana. Basso costo ed evitare effetti di interferenza dal metabolismo dell'ospite. Questa procedura ha il potenziale per essere utilizzata nella diagnosi.

In primo luogo, sciogliere BIF EPS e amido singolarmente in acqua calda su un agitatore magnetico per fare sia la concentrazione di otto grammi per litro. Nel mezzo di coltura di base preparato, VI, aggiungere 100 millilitri della soluzione BIF EPS per realizzare la soluzione coltura VI BIF. Aggiungere 100 millilitri della soluzione di amido per fare coltura VI amido soluzione.

Autoclave i due supporti con fonte di carbonio, e il mezzo senza fonte di carbonio come controllo, a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere fieno e cisteina. Trasferire un sottocampo di cinque millilitri di ogni tubi di media e coltura.

E conservare in un'incubatrice anaerobica. Archiviare i supporti rimanenti a quattro gradi Celsius. Per preparare il campione fecale umano, trasferire un grammo di campione fecale fresco in 10 millilitri di PBS anaerobico molare 0,1 a pH sette in un bicchiere.

Quindi utilizzare un'asta di vetro per mescolarla per ottenere un liquame. In una camera anaerobica, aggiungere 500 microlitri del liquame fecale filtrato nei tre mezzi di fermentazione preparati, singolarmente. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore e 48 ore, raccogliere due millilitri di campioni fermentati nella camera anaerobica. E poi centrifugare fuori dalla camera a 6000 volte G, per tre minuti. Trasferire con cura i supernaganti in nuovi tubi di centrifuga che verranno utilizzati per l'analisi della degradazione del polisaccaride e le misurazioni degli acidi grassi a catena corta.

Conservare i pellet di centrifugazione a 80 gradi Celsius. Caricare 0,2 microlitri dei supernaganti fermentati su ogni piastra di alluminio 60 TLC in gel di silice pre-rivestito e ruotare per diffondersi. Quindi utilizzare un asciugacapelli con aria calda per asciugare.

Immergere un'estremità delle piastre campiostite in 20 millilitri di acido formico:n-butanolo:soluzione d'acqua per diversi minuti, fino a quando l'elettroforesi si estende quasi fino all'altra estremità. Quindi eserti i piatti con le forcette e asciugare con un asciugacapelli. Quindi immergere i piatti nel reagente orcinolo per due minuti per tingere.

E asciugare di nuovo. Trasferire le piastre in un forno da forno a 120 gradi Celsius per riscaldare per tre minuti. Quindi scattare foto della piastra per valutare la degradazione dell'EPS misurando le bande TLC.

Per studiare gli effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA, aggiungere un millilitro dei supernatanti fermentati ai tubi di centrifuga a due millilitri e aggiungere 0,2 millilitri del 25% di peso/volume di acido metafosforico a ciascun campione. Vortice per mescolare accuratamente le soluzioni. Centrifugare le miscele a 13.000 volte G per 20 minuti.

Nel frattempo, preparare soluzioni di acidi acetico, propionico, butirrico, isobutirrico, valerico e isovalerico da 120 millimolare in tubi. Aggiungere quindi un millilitro di ogni acido preparato ad un tubo contenente 1,2 millilitri di 25 peso/volume di acido metafosforico. E caricarli nella bottiglia campione dello strumento gascromatografico come cocktail standard.

Togliere i tubi dalla centrifuga e trasferire i supernatanti in tubi freschi. Utilizzare una siringa dotata di filtro da 0,22 micron per filtrare i supernaganti in nuovi tubi per l'analisi gascromatografica. In questo studio, la produzione di mucoide EPS è stata osservata nelle colture di bifidobacterium longum su piastre PYG, dopo l'incubazione anaerobica per 72 ore.

La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita dalla precipitazione e dall'essiccazione dell'etanolo, ha portato alla raccolta di EPS simile alla cellulosa. L'analisi tlc ha rivelato che il tasso di degradazione dell'amido da parte del microbiota fecale umano era più veloce di quello del BIF EPS. Principal Coordinate Analysis mostra la cultura VI BIF e i gruppi di amido della coltura VI, raggruppati separatamente l'uno dall'altro, indicando che l'EPS e la disponibilità di amido modellano in modo differenziato le comunità batteriche fecali umane.

L'analisi discriminante lineare sulle dimensioni degli effetti mostra che i generi collinsella, coprococcus, parabacteroides e rhodopseudomonas erano significativamente più abbondanti nei campioni di coltura VI BIF che nei campioni di amido della coltura VI. Inoltre, le misurazioni gc mostrano SCFA che sono stati misurati da colture di fermentazione incluse acidi acetico, propionico, isobutirrico, butirrico, isovalerico e valerico. Dopo la fermentazione per 24 ore e 48 ore, cinque delle sei concentrazioni di SCFA erano simili e non statisticamente diverse tra i gruppi di coltura VI BIF, coltura VI amido e coltura VI.

Tuttavia, le concentrazioni di acido proprionico erano significativamente più elevate nel gruppo coltura VI BIF che nel gruppo dell'amido della coltura VI, dopo 48 ore di fermentazione. Eseguire questo esperimento in condizioni anaerobiche e quindi trasferire i campioni fissi in un incubatore anaerobico il prima possibile. Alcuni dei reagenti TLC sono pericolosi.

Dovresti stare attento a usarli.