Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro
23 agosto 2019
Descritto qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro.
Il nostro protocollo può essere ampiamente utilizzato per l'alta produttività e lo screening rapido delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana. Basso costo ed evitare effetti di interferenza dal metabolismo dell'ospite. Questa procedura ha il potenziale per essere utilizzata nella diagnosi.
In primo luogo, sciogliere BIF EPS e amido singolarmente in acqua calda su un agitatore magnetico per fare sia la concentrazione di otto grammi per litro. Nel mezzo di coltura di base preparato, VI, aggiungere 100 millilitri della soluzione BIF EPS per realizzare la soluzione coltura VI BIF. Aggiungere 100 millilitri della soluzione di amido per fare coltura VI amido soluzione.
Autoclave i due supporti con fonte di carbonio, e il mezzo senza fonte di carbonio come controllo, a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere fieno e cisteina. Trasferire un sottocampo di cinque millilitri di ogni tubi di media e coltura.
E conservare in un'incubatrice anaerobica. Archiviare i supporti rimanenti a quattro gradi Celsius. Per preparare il campione fecale umano, trasferire un grammo di campione fecale fresco in 10 millilitri di PBS anaerobico molare 0,1 a pH sette in un bicchiere.
Quindi utilizzare un'asta di vetro per mescolarla per ottenere un liquame. In una camera anaerobica, aggiungere 500 microlitri del liquame fecale filtrato nei tre mezzi di fermentazione preparati, singolarmente. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius.
Dopo 24 ore e 48 ore, raccogliere due millilitri di campioni fermentati nella camera anaerobica. E poi centrifugare fuori dalla camera a 6000 volte G, per tre minuti. Trasferire con cura i supernaganti in nuovi tubi di centrifuga che verranno utilizzati per l'analisi della degradazione del polisaccaride e le misurazioni degli acidi grassi a catena corta.
Conservare i pellet di centrifugazione a 80 gradi Celsius. Caricare 0,2 microlitri dei supernaganti fermentati su ogni piastra di alluminio 60 TLC in gel di silice pre-rivestito e ruotare per diffondersi. Quindi utilizzare un asciugacapelli con aria calda per asciugare.
Immergere un'estremità delle piastre campiostite in 20 millilitri di acido formico:n-butanolo:soluzione d'acqua per diversi minuti, fino a quando l'elettroforesi si estende quasi fino all'altra estremità. Quindi eserti i piatti con le forcette e asciugare con un asciugacapelli. Quindi immergere i piatti nel reagente orcinolo per due minuti per tingere.
E asciugare di nuovo. Trasferire le piastre in un forno da forno a 120 gradi Celsius per riscaldare per tre minuti. Quindi scattare foto della piastra per valutare la degradazione dell'EPS misurando le bande TLC.
Per studiare gli effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA, aggiungere un millilitro dei supernatanti fermentati ai tubi di centrifuga a due millilitri e aggiungere 0,2 millilitri del 25% di peso/volume di acido metafosforico a ciascun campione. Vortice per mescolare accuratamente le soluzioni. Centrifugare le miscele a 13.000 volte G per 20 minuti.
Nel frattempo, preparare soluzioni di acidi acetico, propionico, butirrico, isobutirrico, valerico e isovalerico da 120 millimolare in tubi. Aggiungere quindi un millilitro di ogni acido preparato ad un tubo contenente 1,2 millilitri di 25 peso/volume di acido metafosforico. E caricarli nella bottiglia campione dello strumento gascromatografico come cocktail standard.
Togliere i tubi dalla centrifuga e trasferire i supernatanti in tubi freschi. Utilizzare una siringa dotata di filtro da 0,22 micron per filtrare i supernaganti in nuovi tubi per l'analisi gascromatografica. In questo studio, la produzione di mucoide EPS è stata osservata nelle colture di bifidobacterium longum su piastre PYG, dopo l'incubazione anaerobica per 72 ore.
La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita dalla precipitazione e dall'essiccazione dell'etanolo, ha portato alla raccolta di EPS simile alla cellulosa. L'analisi tlc ha rivelato che il tasso di degradazione dell'amido da parte del microbiota fecale umano era più veloce di quello del BIF EPS. Principal Coordinate Analysis mostra la cultura VI BIF e i gruppi di amido della coltura VI, raggruppati separatamente l'uno dall'altro, indicando che l'EPS e la disponibilità di amido modellano in modo differenziato le comunità batteriche fecali umane.
L'analisi discriminante lineare sulle dimensioni degli effetti mostra che i generi collinsella, coprococcus, parabacteroides e rhodopseudomonas erano significativamente più abbondanti nei campioni di coltura VI BIF che nei campioni di amido della coltura VI. Inoltre, le misurazioni gc mostrano SCFA che sono stati misurati da colture di fermentazione incluse acidi acetico, propionico, isobutirrico, butirrico, isovalerico e valerico. Dopo la fermentazione per 24 ore e 48 ore, cinque delle sei concentrazioni di SCFA erano simili e non statisticamente diverse tra i gruppi di coltura VI BIF, coltura VI amido e coltura VI.
Tuttavia, le concentrazioni di acido proprionico erano significativamente più elevate nel gruppo coltura VI BIF che nel gruppo dell'amido della coltura VI, dopo 48 ore di fermentazione. Eseguire questo esperimento in condizioni anaerobiche e quindi trasferire i campioni fissi in un incubatore anaerobico il prima possibile. Alcuni dei reagenti TLC sono pericolosi.
Dovresti stare attento a usarli.
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Panoramica
Questo protocollo analizza le interazioni tra endobiociti e la microbiota intestinale umana mediante sistemi di fermentazione discontinua in vitro. È progettato per lo screening rapido e ad alto rendimento, minimizzando le interferenze del metabolismo dell'ospite.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Salute intestinale
- Metabolomica
Sfondo
- Gli endobiotici svolgono un ruolo cruciale nella salute umana.
- La microbiota intestinale influenza in modo significativo i processi metabolici.
- Comprendere queste interazioni può aiutare nella diagnostica.
- I metodi attuali possono essere limitati dall'interferenza del metabolismo dell'ospite.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per lo studio delle interazioni endobiota-microbiota.
- Permettere lo screening ad alto rendimento di queste interazioni.
- Fornire un'alternativa a basso costo per la ricerca.
Metodi Utilizzati
- Sciogliere i EPS di BIF e l'amido in acqua calda.
- Preparare i mezzi di coltura per la fermentazione.
- Utilizzare sistemi di fermentazione discontinua per studi sulle interazioni.
- Monitorare gli effetti degli endobiòtici sulla microflora intestinale.
Risultati principali
- Preparazione con successo di soluzioni di EPS da BIF e amido.
- Stabilizzazione di un protocollo di fermentazione affidabile.
- Dimostrazione del potenziale del protocollo per applicazioni diagnostiche.
- Acquisizione di informazioni sulle interazioni tra endobiota e microbiota.
Conclusioni
- Il protocollo offre uno strumento prezioso per la ricerca sulla microbiota.
- Può facilitare la comprensione delle interazioni metaboliche.
- Applicazioni future potrebbero migliorare le capacità diagnostiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Sommario
Questo protocollo consente uno screening in vitro ad alto rendimento e a basso costo delle interazioni tra endobiota e microbiota intestinale, riducendo la dipendenza dai modelli animali e minimizzando le interferenze del metabolismo dell'ospite. Supporta la validazione precoce degli obiettivi fornendo dati quantitativi sulle variazioni della comunità microbica e sulla produzione di metaboliti, elementi fondamentali per ridurre i rischi associati a terapie modulatrici del microbioma. L'approccio è direttamente applicabile ai flussi di lavoro della scoperta preclinica, in cui la comprensione meccanicistica degli effetti dei composti sul microbiota guida la selezione dei candidati e le decisioni di portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette di indagare come endobioci come prebiotici o farmaci modulano le comunità batteriche intestinali umane, supportando la verifica di ipotesi mirate.
- Valore operativo: Utilizza metodi accessibili come il sequenziamento dell'RNA 16S e la quantificazione degli acidi grassi a catena corta (SCFA) per generare dati riproducibili e ricchi di informazioni meccanicistiche.
- Valore predittivo: Distingue le risposte microbiche a carboidrati strutturalmente diversi (ad esempio, EPS rispetto all'amido), facilitando la valutazione delle relazioni struttura-attività.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce condizioni standardizzate di fermentazione anaerobica per una valutazione coerente della degradazione di composti mediata dalla microbiota.
- Valore operativo: Compatibile con formati ad alto rendimento grazie alla semplice preparazione dei campioni e a letture scalabili come la cromatografia su strato sottile (TLC) e la gascromatografia (GC).
- Prontezza del saggio: Genera output quantificabili (profili di acidi grassi a catena corta, modifiche della comunità microbica) che possono essere utilizzati per confrontare gli effetti dei composti tra diverse campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Utilizza un inocolo fecale umano, aumentando la rilevanza per la fisiologia umana rispetto ai modelli animali.
- De-risking meccanicistico: Identifica specifici microrganismi responsivi (ad esempio, Collinsella, Coprococcus) agli endobiociti, supportando un meccanismo d'azione associato a biomarcatori.
- Continuità preclinica: Permette un profilo dipendente da dose e tempo (24 h/48 h) per definire finestre di sicurezza ed efficacia nei modelli successivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del target all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per composti attivi sul microbioma, in cui la comprensione del metabolismo mediato dalla microbiota è essenziale per prevedere il comportamento in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta lo screening basato su ipotesi degli endobiotici collegando l'esposizione al composto a modifiche misurabili nella composizione e funzione microbica.
- Screening: Permette una valutazione rapida delle interazioni con la microflora utilizzando la cromatografia su strato sottile (TLC) per la degradazione dei polisaccaridi e la gascromatografia (GC) per la quantificazione degli acidi grassi a catena corta (SCFA) come letture indipendenti.
- Analisi: Genera dati multivariati (sequenziamento 16S, concentrazioni di SCFA) che consentono il confronto statistico degli effetti dei trattamenti e l'identificazione di cambiamenti significativi.
- Ricerca traslazionale: Utilizza microflora di origine umana, migliorando l'affidabilità predittiva per la traduzione clinica rispetto ai modelli murini.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile a diversi endobiotici (farmaci, prebiotici, polisaccaridi), rendendolo una piattaforma riutilizzabile in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra microbiota ed endobiota attraverso l'osservazione diretta dei modelli di degradazione e dei microrganismi coinvolti.
- Valore operativo: Il basso costo, il flusso di lavoro anaerobico e il campionamento standardizzato migliorano la riproducibilità e la confrontabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Consente decisioni precoci di tipo go/no-go identificando il metabolismo mediato dal microbiota che potrebbe alterare l'efficacia o la tossicità del farmaco.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei composti in base al rischio, considerando il loro impatto sul microbiota benefico e sui profili di SCFA.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microbiologia anaerobica e tecnica asettica per mantenere l'integrità del campione.
- Necessita dell'accesso a piastre per cromatografia su strato sottile (TLC), cromatografia gassosa e infrastrutture per il sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S per un'analisi completa.
- La standardizzazione tra laboratori richiede un trattamento costante dei campioni fecali e condizioni di incubazione anaerobica uniformi.
- L'adattamento ad altri endobiotici richiede test di solubilità e stabilità in condizioni di fermentazione.
- I limiti pratici includono la variabilità della microbiota del donatore e la necessità di manipolare con attenzione reagenti per TLC pericolosi (ad esempio, orcinolo, acido formico).
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
