Name: Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Impara la tecnica di iniezione nelle uova di Gryllus bimaculatus per studi di biologia dello sviluppo e manipolazione genomica. Questo metodo flessibile supporta esperimenti di RNA interference e ricerca sullo sviluppo embrionale.

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La ricerca riportata in questo progetto è stata sostenuta da un Premio per lo Sviluppo Istituzionale (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con numero di sovvenzione P20GM10342 a HH3, e dal numero di premio NSF IOS-1257217 a Della CGE.

1. Configurazione e preparazione dei materiali da parte dell'hardware
 NOT:</</c0> Consultare la Tabella 1 e la Tabella dei Materiali per la preparazione di soluzioni, reagenti e dettagli sulle attrezzature.
<ol><li>Impostare un microscopio dissezioso per vedere le uova e guidare l'ago di iniezione. (Lafigura 1A mostra un microscopio sezionato dotato di fluorescenza).) La capacità di fluorescenza è vantaggiosa ma non necessaria.</li>
	<li>Posizionare un micromanipolatore a 3 assi per manovrare l'ago di iniezione in posizione (Figura1A).</li>
	<li>Impostare un microiniettore con tubi e un supporto ad ago per iniettare piccole quantità di materiale (Figura 1A). Facoltativamente, utilizzare un pedale che non è mostrato nella figura.</li>
	<li>Progettare e creare un timbro per creare pozzi per le uova (Figura 1C) stampando l'inverso del modello desiderato, sia con una stampante 3D o un incisore laser. NOT:</</c4> Il timbro campione stampato in 3D mostrato è 4,5 cm x 5 cm con 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm per la creazione di singoli pozzi. Dettagli su come fare una varietà di stampi personalizzabili sono stati pubblicati altrove16.</li>
	<li>Preparare 10x Buffer di iniezione, HEPES buffered saline (HBS), e una soluzione stock di Tetramethylrhodamine Dextran tintura e conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare soluzioni sperimentali da inienaturare, come dsRNA, CRISPR/Cas912, elementi trasponibili, mRNA con tappo in vitro7,8, agenti farmacologici17, .GAR o TALENS9.</li>
	<li>Posizionare il nastro a doppia levetta su diversi strati di nastro da laboratorio standard su un vetrino al microscopio di vetro per creare una piattaforma di 1 mm circa sopra lo scivolo di vetro, che verrà utilizzato per tenere gli aghi per la valutazione.</li>
	<li>Preparare un contenitore da cricket di circa 40 cm x 60 cm di dimensioni con un coperchio che possiede un'apertura coperta di rete per la circolazione dell'aria.</li>
	<li>Aggiungere cibo, acqua e materiali riparatori.</li>
	<li>Aggiungere diverse decine di grilli adulti sani e maschi. Identificare il cricket adulto dalla presenza di ali. NOT:</</c12> Una gamma di età post-immaginarie può aumentare la resa delle uova. La densità dei grilli dovrebbe essere relativamente alta per essere in grado di raccogliere abbastanza uova per un esperimento, ma non così affollata che si verifica il cannibalismo. Ad esempio, circa due dozzine di grilli sani, con un rapporto tra uomini e donne, in un contenitore delle dimensioni sopra indicate dovrebbero essere sufficienti per raccogliere circa 200 uova in un periodo da uno a due h. I grilli possono essere mantenuti a temperatura ambiente, ma lo sviluppo e il comportamento saranno ottimali se i grilli sono mantenuti in un incubatore caldo (23,5-26 gradi centigradi), umido (40 - 60% di umidità relativa).</li>
</ol>2. Fare aghi per l'iniezione
<ol><li>Utilizzare Capillari di vetro Borosilicate con filamento (vedere la Tabella dei Materiali per i dettagli delle dimensioni). Preparare gli aghi di trazione nello stesso giorno, o fino a pochi giorni prima che le iniezioni siano completate.</li>
	<li>Posizionare un vetro capillare nell'emittente, centrare il vetro sul filamento e stringere le manopole per fissare il vetro in posizione.</li>
	<li>Impostare la temperatura dell'epullre vicino alla temperatura della rampa di vetro (da -5 a 10 gradi centigradi).</li>
	<li>Utilizzare un protocollo a passo singolo e ad alto calore per tirare un lungo cono con una piccola apertura, ma evitare di sciogliere le estremità chiuse. NOT:</</c1> Ad esempio, quando si utilizza l'emittente micropipette descritto nella Tabella dei Materiali dotata di filamento a scatola, utilizzare i seguenti parametri per il vetro con una temperatura di rampa di 478: Calore 478; Tirare 45; Vel 75; Del 120. Le condizioni ottimali per la produzione di un ago con la forma illustrata nella Figura 2B devono essere determinate empiricamente da ogni utente.</li>
	<li>Punte di aghi di smusso in preparazione per le iniezioni.</li>
	<li>Sorseggiare il piano di smerigliatrice rotante dello svelatore (Figura 2A) con acqua gocciolante. Utilizzare acqua distillata inosmosi inversa (RO) o diethylpyrocarbonate (DEPC).</li>
	<li>Posizionare l'ago tirato nello smusso e ruotare in un angolo di 20 gradi.</li>
	<li>Abbassare l'ago fino a toccare solo il piano di macinazione e smussare per 2 o 3 min.</li>
	<li>Valutare la smussatura posizionando l'ago smussato su nastro a doppia levetta che è stato aderito a un vetrino del microscopio di vetro.</li>
	<li>Posizionare la diapositiva che tiene l'ago sullo stage di un microscopio composto dotato di una fotocamera e di un software di acquisizione delle immagini.</li>
	<li>Acquisire un'immagine della punta dell'ago utilizzando un obiettivo 20x.</li>
	<li>Utilizzare il software di imaging per misurare il diametro del lume interno dell'ago appena prossimato all'apertura smussata (Figura 2C). La dimensione ottimale è di 10 m e 2 m.</li>
	<li>Scartare gli aghi che hanno un'apertura inferiore a 8 m e superiore a 12 m.</li>
	<li>Conservare gli aghi in un contenitore con un coperchio per evitare di essere polverosi. Utilizzare una striscia di cera o materiale simile per elevare gli aghi dal fondo del contenitore per evitare di rompere le punte (Figura 2D).</li>
</ol>3. Raccolta e preparazione delle uova
<ol><li>Massimizzare il numero di uova deposte privando i grilli di qualsiasi materiale umido di deposizione (fiale d'acqua, piatti a base di uova) durante la notte o per almeno 8-10 h prima di tentare di raccogliere le uova. NOT:</</c0> Poiché le femmine hanno la capacità di conservare internamente lo sperma, può essere necessaria una procedura a tempo diverso se la fecondazione accuratamente a tempo è sperimentalmente essenziale18.</li>
	<li>Fare 40 mL di 1% agarose in acqua e versare in una piastra di Petri 10 cm.</li>
	<li>Posizionare un timbro a vescino sulla superficie dell'agarose prima che si solidifiche.</li>
	<li>Rimuovere il timbro, una volta che l'agarose è solidificato, per rivelare i pozzi (Figura 1C).</li>
	<li>Riempire la piastra di agarose con HBS contenente 1% Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Mettere il coperchio sul piatto, avvolgere in parafilm e conservare a 4 gradi centigradi. NOT:</</c3> I piatti possono essere conservati per un paio di giorni a 4 gradi centigradi, ma devono essere riscaldati fino a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la condensa.</li>
	<li>Fai un piatto da collezione di uova per i grilli per deporre le uova riempiendo un piatto di petri da 35 mm con sabbia bianca del parco giochi (Figura 1B). NOT:</</c5> La sabbia specificata nella Tabella dei Materiali ha le dimensioni appropriate del grano. Se i granelli di sabbia sono troppo grandi, la sabbia danneggerà le uova.</li>
	<li>Coprire il piatto di uova con un quadrato di carta assorbente tagliato per circa 18 cm x 18 cm, e posizionare sulla parte superiore del piatto con sabbia. Attraverso questo tovagliolo di carta coprire il piatto riempito con acqua del rubinetto.</li>
	<li>Inclinare la piastra di Petri e spremere delicatamente la parte superiore per rimuovere l'acqua in eccesso.</li>
	<li>Infilare gli angoli del quadrato del tovagliolo di carta sotto il piatto e posizionare il piatto di uova nel coperchio invertito, che contribuirà a mantenere il coperchio dell'asciugamano di carta in posizione.</li>
	<li>Mettere il piatto d'uovo nel cestino del grillo e lasciare che le femmine adulte oviposit uova per uno o due h. NOT:</</c7> Il tempo relativamente breve qui assicura che tutte le uova saranno simili nella fase di sviluppo al momento dell'iniezione. Se l'iniezione prima della cellularizzazione è importante, le iniezioni dovrebbero avvenire entro 14 h di deposizione di uova19.</li>
	<li>Nel frattempo, lasciare che il piatto di agarose (dal punto 3.6) si scaldi a temperatura ambiente in preparazione per l'iniezione di uova.</li>
	<li>Rimuovere il piatto di raccolta delle uova, ora contenente uova appena deposte, dal cestino del grillo, e rimuovere il coperchio dell'asciugamano di carta. Posizionare un colino con una dimensione del poro di 0,5-1 mm su un becher di almeno 500 mL di capacità (Figura 1B).</li>
	<li>Sciacquare il contenuto del piatto di deposizione delle uova (sabbia e uova) nel colino sotto l'acqua del rubinetto che scorre delicatamente lasciando i grani di sabbia cadere attraverso la rete del colino in acqua nel becchere sottostante, lasciando le uova di grillo nel cesto del colino.</li>
	<li>Riempire un contenitore con acqua RO e metterlo in un vassoio. Invertire il colino sopra il contenitore e toccarlo contro il piatto per spostare le uova in acqua. Le uova affonderanno sul fondo del contenitore.</li>
	<li>Tagliare la punta di una punta di pipetta P1000 con le forbici per fare un'apertura di circa 3 mm di diametro. Mettere questa mancia su un pipettor P1000 e utilizzarlo per trasferire le uova dal contenitore al piatto di muffa uovo di agarose, trasferendo meno acqua possibile.</li>
	<li>Utilizzare pinzette di plastica per allineare le uova in pozzi di agarose riempiti con HBS più 1% Penicillin/ Streptomycin. Ogni uovo affonderà sul fondo di un pozzo individuale. Coprire con il coperchio della piastra di Petri fino a quando non è pronto per l'iniezione.</li>
</ol>4. Preparare il Microiniettore
<ol><li>Attaccare il microiniettore a una fonte di aria o gas compressa (questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando aria compressa o N2). NOT:</</c1> Se si utilizza un serbatoio d'aria portatile, riempire fino ad almeno 75 psi. Il serbatoio perderà la pressione dell'aria durante le iniezioni e potrebbe essere necessario riempire; iniezioni diventano difficili al di sotto di 40psi.</li>
	<li>Accendere il microiniettore. Impostare il tempo di iniezione su 0,17 s e la pressione a 10–15 psi. NOT:</</c2> La pressione esatta necessaria dipenderà dall'apertura dell'ago e deve essere determinata empiricamente per ogni ciclo di iniezione e/o nuovo ago utilizzato.</li>
	<li>Assicurarsi che la manopola BALANCE del microiniettore sia rivolta a 0 (in genere completamente in senso antiorario) e che il microiniettore sia pressurizzato e in modalità di iniezione.</li>
</ol>5. Iniezioni
<ol><li>Filtrare circa 500 l of 10x Buffer di iniezione utilizzando una siringa da 1 mL e un filtro a siringa da 0,45 m.</li>
	<li>Reagenti di iniezione di miscelazione (i dettagli che seguono sono per l'iniezione di dsRNA preparati come descritto nel12). NOT:</</c1> Può essere consigliabile progettare ed eseguire diversi controlli, soprattutto quando si sta imparando questa tecnica per la prima volta. Le uova iniettate senza iniettare, iniettare il tampone da solo e il tampone da ttigli, un reagente di controllo (come eGFP dsRNA) sono tutti buoni test di quanto possano essere dirompenti i vari elementi del protocollo di iniezione. Vedere Figura 3 per la sopravvivenza di un numero di controlli diversi.</li>
	<li>Iniziare con un'aliquota dsRNA da 4 mL.</li>
	<li>Aggiungete 0,5 mL del buffer di iniezione 10x filtrato all'aliquota dsRNA.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di 50 mg/mL Tetramethyl rhodamine Dextran soluzione di brodo. Se si lavora su un ambito di dissezione senza fluorescenza, utilizzare Phenol Red invece.</li>
	<li>Conservare tutti i materiali sul ghiaccio per tutta la durata del periodo di iniezione.</li>
	<li>Caricare la soluzione di iniezione in un ago di iniezione utilizzando punte di carico da 20 mL e un pipet p10.</li>
	<li>Predisporre una soluzione di iniezione di 1,5 ml e inserire la punta di carico nell'estremità larga dell'ago di iniezione.</li>
	<li>Espellere la soluzione il più in basso possibile nell'ago ed eliminare le bolle d'aria sfogliando delicatamente; fare attenzione a non rompere l'ago.</li>
	<li>Posizionare il piatto di uova al microscopio dissetivo e selezionare un basso ingrandimento di circa 10x (1x ingrandimento visto attraverso obiettivi oculari 10x).</li>
	<li>Inserire l'ago nell'alloggiamento di iniezione e stringere. NOT:</</c0> Fare attenzione che l'ago sia correttamente e saldamente inserito nell'alloggiamento. Per fare questo, tirare l'estremità larga dell'ago indietro fuori dall'alloggiamento di metallo, portando il tubo di silicio nell'alloggiamento con esso. Regolare il tubo di silicio in modo che l'estremità in vetro dell'ago sporge appena oltre il silicio. Se questo non è fatto, il tubo di silicio può ottenere pizzicato tra il vetro e l'alloggiamento del metallo, bloccando l'estremità dell'ago.</li>
	<li>Inserire con attenzione l'alloggiamento di iniezione con un ago attaccato nel micromanipolatore. Essere consapevoli dell'estremità tagliente dell'ago e fare attenzione che non è urtato in superfici e rotto.</li>
	<li>Mentre si osservano sia le uova che l'ago al microscopio, spostare l'ago vicino alle uova nell'angolo in alto a sinistra della griglia del piatto.</li>
	<li>Abbassare l'ago fino a quando la punta entra nell'HBS più 1% Penicillin/Streptomycin soluzione tampone nel piatto.</li>
	<li>Centrare l'ago nel campo visivo e spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia di qualche mm più vicino al bordo del piatto rispetto alle uova.</li>
	<li>Non ostruire la vista della griglia di uova con l'ago.</li>
	<li>Impostare il microscopio sul filtro appropriato per la Rhodamine in modo che sia possibile osservare la fluorescenza nell'ago e concentrarsi sulla punta dell'ago.</li>
	<li>Sul microiniettore, ruotare lentamente la manopola BALANCE in senso orario fino a quando la soluzione di iniezione inizia a fuoriuscire dall'ago nella soluzione di sospensione. Il numero di equilibrio sullo schermo del microiniettore inizierà ad aumentare, anche se il valore numerico non è importante. Successivamente, girare la manopola in senso antiorario leggermente solo fino a quando il tintura smette di fuoriuscire dall'ago. NOT:</</c0> È fondamentale impostare questo equilibrio ogni volta che viene utilizzato un nuovo ago. Senza il bilanciamento impostato in modo appropriato, il microiniettore continuerà a iniettare per qualche tempo dopo l'iniezione viene attivata. È anche possibile che una singola pressione del pulsante di iniezione con un ago sbilanciato comporterà l'espulsione dell'intero contenuto dell'ago caricato.</li>
	<li>Con l'ago centrato nel campo visivo, spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia rivolto all'uovo da iniettare per primo. Si raccomanda che le iniezioni inizino in un angolo della griglia di uova disposte, ad esempio, l'angolo in alto a sinistra.</li>
	<li>Regolare l'ingrandimento a circa 50x; a questo ingrandimento, un singolo uovo riempirà la maggior parte del campo visivo.</li>
	<li>Utilizzare sia il micromanipolatore che la mano sul piatto dell'uovo per spostare l'ago in posizione per l'iniezione.</li>
	<li>Far avanzare l'ago utilizzando il micromanipolatore e inserire la punta dell'ago nel primo uovo da iniettare.</li>
	<li>Inserire l'ago a una lunghezza del 20-30% dell'uovo dall'estremità posteriore (smussata) dell'uovo (Figura 1E), perpendicolare al lungo asse dell'uovo.</li>
	<li>Soluzione di iniezione con il pedale del piede di iniezione o il pulsante di iniezione sul microiniettore. Un piccolo bolo di materiale fluorescente all'interno dell'uovo indicherà un'iniezione di successo (Figura 1D). NOT:</</c1> Non è raro che qualche tuorlo venga espulso dall'uovo durante l'iniezione (Figura 1F), e questo non indica necessariamente che l'uovo iniettato sarà inutilizzabile.</li>
	<li>Ritirare l'ago dall'uovo. Se l'uovo viene involontariamente sollevato dal suo pozzo dopo la retrazione dell'ago, utilizzare piccole pinze per spingere l'uovo indietro nel suo pozzo mentre si ritrae l'ago.</li>
	<li>Se l'ago si intasa durante l'iniezione, rimuovere l'ago dall'uovo e, mantenendo l'ago immerso nella soluzione HBS più 1% Penicillin/ Streptomynin che copre le uova, cancellare l'ago intasato utilizzando la funzione Clear o spingendo l'inietta abbottonare.</li>
	<li>Continuando a usare lo stesso ago, ripetere la procedura di iniezione per il maggior numero possibile di uova. In un primo momento, questo può essere solo circa 20 o 30 uova, ma aumenterà a oltre 100 con la pratica.</li>
	<li>Se l'ago diventa intasato e non può essere eliminato, scartare l'ago, riempire un nuovo ago e ricominciare (ad esempio, tornare al punto 5.7).</li>
	<li>Conservare il piatto di uova iniettate in un'incubatrice calda (23,5–26 gradi centigradi) leggermente umida (per ridurre al minimo l'evaporazione) fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi.</li>
	<li>Almeno ogni 24 h, rimuovere le uova che non sono più vitali (Figura 3A, B) e sostituire la soluzione di sospensione con HBS fresco più 1% Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Due o tre giorni dopo l'iniezione, trasferire le uova con una leggera pipettatura o con pinze plastiche su asciugamani di carta inumiditi con HBS più l'1% di Penicillina/Streptomycin in una piastra di petri ricoperta di coperchio per continuare lo sviluppo nell'incubatrice calda e umida.</li>
	<li>Monitorare le uova e rimuovere le uova che non sono più vitali ogni giorno (Figura 3A, B).</li>
</ol>

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<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le due sfide principali con questa tecnica sono le questioni correlate di dimensioni ottimali dell'ago e sopravvivenza. Anche se gli aghi più piccoli migliorano la sopravvivenza, gli aghi con lumen più stretti hanno un maggior grado di forze capillari al lavoro, il che rende più probabile che il tuorlo si muova nell'ago causandone l'intasare. Nel migliore dei casi, i blocchi possono essere eliminati semplicemente iniettando un altro uovo o cancellando l'ago come descritto sopra. Si può anche tentare di aumentare la press...

La capacità di modificare il genoma o influenzare l'espressione genica negli organismi è la base per la progettazione di molti tipi di esperimenti che testano la causalità funzionale. È inoltre fondamentale per il lavoro comparativo ed evolutivamente rilevante che le tecniche di modifica genomica e non genomica siano disponibili negli organismi al di fuori dei tradizionali sistemi genetici del modello animale (ad esempio, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, e Caenorhabditis elegans). Che si tratti del desiderio di comprendere la diversità dell'organismo1 o dell'adesione al principio di Krogh, che per ogni questione biologica c'è un organismo più adatto alla sua soluzione2,3,la capacità di modificare i genomi o influenzare l'espressione genica è essenziale per i moderni progetti sperimentali.
Il cricket Gryllus bimaculatus è un sistema modello emergente. Utilizzato per il secolo scorso in esperimenti neurologici4, gli ultimi due decenni hanno visto un crescente interesse sperimentale per il cricket, particolarmente focalizzato sull'evoluzione e lo sviluppo di questo organismo5. Il grillo è un insetto emimetabolo che si dirama a livello basaleto a insetti olometaboli ben studiati, come D. melanogaster e Tribonocastaneum6. A causa della sua posizione utile sull'albero evolutivo, gli scienziati sono interessati a porre domande sperimentali moderne e sofisticate in questo insetto, che ha portato a un crescente interesse nell'adattamento degli strumenti molecolari per l'uso in G. bimaculatus.
Le iniezioni di reagenti molecolari negli ovuli da cricket possono essere utilizzate per esperimenti di modificazione genomica e manipolazioni non genomiche dell'espressione genica negli embrioni. Ad esempio, sono stati creati transgenici G. bimaculatus che trasportano gli inserimenti eGFP utilizzando il piggyBac7,8. I ricercatori hanno creato con successo G. bimaculatus con nucleasi di dito di zinco (FN) e nuclee effettore (TAL) simili a istruzioni di trascrizione (TALEN) per introdurre rotture a doppio filamento in specifiche regioni genomiche9. Anche se le nomi di rete e i TALEN consentono il targeting specifico del sito in animali oltre i quattro grandi sistemi modello, questi reagenti sono stati rapidamente superati dal sistema CRISPR/Cas9, che è più semplice da usare, più efficiente e altamente flessibile10. CRISPR è stato utilizzato in G. bimaculatus per produrre knock-out11 così come knock-in linee12,13 Oltre alla modificazione genomica, dsRNA può essere iniettato nelle uova per abbattere l'espressione mRNA in sviluppo embrioni, consentendo ai ricercatori di comprendere il ruolo delle trascrizioni specifiche durante lo sviluppo14,15. Alcuni dettagli limitati su come iniettare uova di cricket sono stati pubblicati in precedenza12.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'iniezione di uova di G. bimaculatus precoce. Questo protocollo è efficace e facilmente adattabile a varie impostazioni di laboratorio, materiali di iniezione ed eventualmente ad altri insetti. Sebbene siano stati pubblicati ulteriori dettagli per la progettazione e l'implementazione di esperimenti di modifica e knockdown, pubblicati altrove12,13, questi approcci alla fine si baseranno sul protocollo di iniezione descritto qui.

<table><tbody><tr><td>Microscopio da dissezione a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Stereomicroscopio con fluorescenza</td></tr><tr><td>Sorgente di luce esterna per fluorescenza</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Narishige</td><td>IM-300-Gli</td> <td>accessori possono includere il supporto per aghi di iniezione, il tubo di ingresso (con un connettore per tubo flessibile), il cavo di alimentazione CA, l'interruttore a pedale, la guarnizione in gomma siliconica-cubo</td></tr> <tr><td></td><td>filtrante mCherryLeica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>Cubo filtro per mCherry o colorante rosso simile funzionerà</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>utilizzato con supporto magnetico (Narishige, tipo GJ-8)</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Holder (supporto per ago)</td><td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per collegare la fonte d'aria al microiniettore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timbro a pozzetto per uova</td><td>stampato in 3D</td><td>personalizzato</td><td>stampato in 3D su un Lulzbot Taz 5 utilizzando acido polilattico termoplastico</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice o camera a temperatura controllata</td><td>varie</td><td></td><td>Temperature di 23,5-26 gradi C sono necessari.</td></tr><tr><td>Cibo per grilli</td>, <td>vari</td><td></td><td>alimenti per gatti o fiocchi di pesce sono alimenti appropriati.</td></tr><tr><td>L'acqua del grillo</td><td>può</td><td></td><td>essere tenuta in fiale e presentata ai grilli attraverso batuffoli di cotone</td></tr><tr><td>Rifugio per grilli</td><td>arioso</td><td></td><td>I materiali del rifugio possono includere tovaglioli di carta stropicciati o cartoni delle uova</td></tr><tr><td>Tubi capillari di vetro</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>N. articolo 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; Capillari in vetro borosilicato, lunghezza 100 mm, diametro interno 0,58 mm, diametro esterno 1,0 mm, con filamento</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Flaming/Brown</td><td>Modello P-97</td><td>Distribuito da Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Smussatrice / Micro macinatore</td><td>Narishige</td><td>Modello EG-45/EG-400</td><td>EG-400 include una testa del microscopio</td></tr><tr><td>piastre di Petri</td><td>CellTreat</td><td>Codice prodotto</td><td>229693 90 mm di diametro</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Sabbia bianca da gioco</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB000972</td><td>Agarosio GPG/LE colino per uova ultrapure</td></tr><tr><td>: Filtri conici in acciaio inossidabile a rete twill extra fine Forniture per</td><td>la cucina USA</td><td>Modello SS-C123</td><td>La dimensione dei pori deve essere compresa tra 0,5 e 1,0 mm</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td>Pinzette in plastica per streptococco a penna</td></tr><tr><td></td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Nero Statico Dissipativo, 118 mm</td></tr><tr><td>Filtri per siringa, diametro 25 mm, 0.45 & micro; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>Utilizzare con siringa da 1 mL siringa</td></tr> da <tr><td>1 ml, con punta a slittamento Tubercolina</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Utilizzare con filtro siringante per filtrare il tampone di iniezione, le siringhe con punta Luer-Lok funzionerebbero anche</td></tr><tr><td>Serbatoio d'aria (opzionale)</td> <td>Prodotti Midwest</td><td>Air Works & reg;</td><td>Serbatoio d'aria portatile</td></tr><tr><td>Colorante rodamina</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>destrano, tetrametilrodamina 10.000MW,</td></tr> <tr><td>20 mL punte di carico</td><td>Eppendorf</td><td>Codice 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu; L Microloader</td></tr><tr><td>Microscopio composto</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20x obiettivo</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; software</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>Versione 4.6.2 utilizzato qui</td></tr></tbody></table>

iniezione di uova di gryllus bimaculatus

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

L'alterazione della funzione genica in un organismo in via di sviluppo è fondamentale per diversi tipi di esperimenti. Sebbene siano stati sviluppati strumenti genetici estremamente potenti nei sistemi modello tradizionali, è difficile manipolare i geni o l'RNA messaggero (mRNA) nella maggior parte degli altri organismi. Allo stesso tempo, gli approcci evolutivi e comparativi si basano su un'esplorazione della funzione genica in molte specie diverse, che richiede lo sviluppo e l'adattamento di tecniche per manipolare l'espressione al di fuori attualmente geneticamente trattabile specie. Questo protocollo descrive un metodo per iniettare reagenti nelle uova di cricket per esaminare gli effetti di una data manipolazione sullo sviluppo embrionale o larvale. Vengono descritte le istruzioni per la raccolta e l'iniezione di uova con aghi smussati. Questa tecnica relativamente semplice è flessibile e potenzialmente adattabile ad altri insetti. Si può raccogliere e iniettare decine di uova in un singolo esperimento, e i tassi di sopravvivenza per iniezioni tampone-solo migliorare con la pratica e può essere alto come 80%. Questa tecnica sosterrà diversi tipi di approcci sperimentali, tra cui l'iniezione di agenti farmacologici, l'mRNA in vitro con limite per esprimere geni di interesse, l'RNA a doppio filamento (dsRNA) per ottenere l'interferenza dell'RNA, l'uso di cluster regolarmente ripetizioni palindromiche brevi interspaziose (CRISPR) in concerto con reagenti di proteina 9 (Cas9) associati a CRISPR per la modifica genomica e elementi trasponibili per generare linee transgeniche transitorie o stabili.

I grilli depongono prontamente le uova nel materiale umido e forniscono materiale adeguato, come sabbia umida o sporcizia, li induce a deporre un gran numero di uova. Ciò è particolarmente efficace se i grilli vengono prima privati di materiale per la deposizione delle uova per 8-10 h. Le uova deposte nella sabbia pulita possono essere facilmente separate, raccolte (Figura 1B) e collocate in pozzi di uova progettati su misura per l'iniezione (<strong class="x...

Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica.

Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Questa tecnica funge da metodo fondamentale per esperimenti progettati per saggiare lo sviluppo embrionale o larvale del cricket. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è flessibile e supporterà diversi tipi di approcci sperimentali, come quelli che utilizzano interferenze di RNA o manipolazione genomica. A dimostrare la procedura sarà Hadley Wilson Horch, l'investigatore principale del laboratorio.Per iniziare questa procedura bagnare il piano di smerigliatrice rotante della smussatura con acqua gocciolante. Posizionare l'ago tirato nella smussatura e trasformarlo in un angolo di 20 gradi. Abbassare l'ago fino a toccarlo e smussarlo per due o tre minuti.Valutare la smussatura posizionando l'ago smussato su nastro a doppio bastoncino che è stato aderito a uno scivolo al microscopio in vetro. Posizionare la diapositiva sul palco di un microscopio composto dotato di una fotocamera e di un software di acquisizione di immagini. Acquisire un'immagine dell'ago utilizzando un obiettivo 20x.Utilizzare il software di imaging per misurare il diametro interno del lume dell'ago appena prossimo all'apertura smussata. Scartare gli aghi con un'apertura inferiore a otto micrometri o superiore a 12 micrometri. In primo luogo, fare 40 millilitri di 1%agarosio in acqua e versarlo in una piastra di Petri di 10 centimetri.Posizionare un uovo ben stampato sulla superficie dell'agarosio prima che si solidifichi. Una volta solidificato l'agarosio, rimuovere il timbro per rivelare i pozzi. Quindi, riempire la piastra del pozzo di agarosio con HBS contenente 1%di streptomicina penicillina.Posizionare il coperchio sul piatto, avvolgerlo in Parafilm e conservarlo a quattro gradi Celsius. Dopo questo, riempi una piastra di Petri di 35 millimetri con sabbia bianca del parco giochi per preparare un piatto di raccolta delle uova per i grilli in cui deporre le uova. Coprire il piatto d'uovo con un tovagliolo di carta tagliato a circa 18 per 18 centimetri.Riempire con acqua del rubinetto attraverso l'asciugamano di carta. Quindi, inclinare la piastra di Petri e spremere delicatamente la parte superiore per rimuovere l'acqua in eccesso. Infilare gli angoli del quadrato dell'asciugamano di carta sotto il piatto e posizionare il piatto d'uovo in un coperchio rovesciato che aiuterà a mantenere l'asciugamano di carta in posizione.Metti il piatto d'uovo nel cestino del cricket e consenti alle femmine adulte di ovoposit le uova per una o due ore. Nel frattempo, lasciare riscaldare il piatto di agarosio a temperatura ambiente in preparazione per tenere le uova iniettate. Quando sei pronto, rimuovi il piatto di raccolta delle uova, ora contenente uova appena deposte, dal cestino del cricket.Rimuovere il tovagliolo di carta e posizionare un colino con una dimensione dei pori compresa tra 0,5 e un millimetro su un becher. Risciacquare il contenuto del piatto di deposizione delle uova nel colino sotto acqua del rubinetto che scorre delicatamente. I granelli di sabbia cadranno attraverso la rete del colino nel becher sottostante mentre le uova di grillo rimangono nel cesto del colino.Riempire un contenitore con acqua osmosi inversa e posizionare in un vassoio. Invertire il colino sul contenitore e toccarlo contro il piatto per spostare le uova nell'acqua. Le uova affonderanno sul fondo del contenitore.Quindi, utilizzare le forbici per tagliare la punta da una punta della pipetta P1000 per effettuare un'apertura di circa tre millimetri di diametro. Posizionare questo suggerimento su una pipetter P1000 e utilizzarlo per trasferire le uova dal contenitore al piatto di stampi per uova di agarosio. Usando una pinzetta di plastica, allineare le uova nei pozzi di agarosio.Ogni uovo affonderà sul fondo di un pozzo individuale. Coprire la piastra di Petri con un coperchio fino a quando non è pronto per l'iniezione. Per iniziare, posizionare il piatto di uova al microscopio di sezionamento e selezionare un basso ingrandimento di circa 10x.Elaborare 1,5 microlitri di soluzione di iniezione utilizzando 20 punte di carico microlitri e una pipetta P10 e inserire la punta di carico nell'estremità larga dell'ago di iniezione. Espellere la soluzione di iniezione nell'ago di iniezione. Inserire l'ago nell'alloggiamento di iniezione e stringere, assicurandosi che l'ago sia inserito correttamente e saldamente nell'alloggiamento.Quindi inserire con cura l'alloggiamento di iniezione nel micromanipolatore, facendo attenzione a non rompersi o essere feriti dall'ago. Mentre guardi sia le uova che l'ago attraverso il microscopio, sposta l'ago vicino alla X nell'angolo in alto a sinistra della griglia del piatto. Abbassare l'ago fino a quando la punta entra nella soluzione tamponata hbs più streptomicina penicillina nel piatto.Centrare l'ago nel campo visivo e spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia di pochi millimetri più vicino al bordo del piatto rispetto alle uova. Successivamente, impostare il microscopio sul filtro appropriato per la rodiammina per osservare la fluorescenza nell'ago e concentrarsi sulla sua punta. Sul microiniettore ruotare lentamente la manopola di bilanciamento in senso orario fino a quando la soluzione di iniezione inizia a fuoriuscire dall'ago nella soluzione di sospensione.Quindi ruotare leggermente la manopola in senso antiorario fino a quando il colorante smette di fuoriuscire dall'ago. Con l'ago ancora centrato nel campo visivo, spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia rivolto all'uovo da iniettare per primo. Regola l'ingrandimento a circa 50x in modo che un singolo uovo riempia la maggior parte del campo visivo.Utilizzare sia il micromanipolatore che la mano sul piatto d'uovo per spostare l'ago in posizione per l'iniezione. Utilizzare il micromanipolatore per far avanzare l'ago e inserire la punta nel primo uovo da iniettare, assicurandosi di inserire l'ago dal 20 al 30% della lunghezza dell'uovo dall'estremità posteriore dell'uovo perpendicolare al lungo asse dell'uovo. Iniettare la soluzione con il pedale di iniezione o il pulsante di iniezione sul microiniettore.Un piccolo bolo di materiale fluorescente all'interno dell'uovo indicherà un'iniezione riuscita. Dopo questo, ritrarre l'ago dall'uovo. Se l'uovo viene sollevato involontariamente dal suo pozzo dopo la retrazione dell'ago, utilizzare piccole pina per spingere l'uovo di nuovo nel pozzo mentre si ritrae l'ago.In questo studio, le uova di cricket vengono iniettate usando una tecnica che funge da metodo fondamentale in molti esperimenti, tra cui, a titolo titolo usare la ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica. Il tasso di sopravvivenza è un parametro importante per valutare il successo di questo esperimento. La maggior parte delle uova morte può essere facilmente identificata a vista mentre il tuorlo e il tessuto embrionale all'interno dell'uovo iniziano a ciuffarsi in modo non uniforme, e alla fine la maggior parte del tuorlo migrerà su un lato dell'uovo.Se valutato dopo quattro o sei giorni, più dell'85% delle uova non iniettate sopravvisse, mentre le uova iniettate con reagenti sperimentali avevano generalmente un tasso di sopravvivenza più basso. Per comprendere i veri effetti della manipolazione sperimentale tentata è necessario controllare tutti gli aspetti dell'iniezione stessa, compresa la puntura dell'ago, l'introduzione di colorante e tampone, o la presenza di RNA a veicolo o a doppio filamento. Il modo in cui si valutano i risultati fenotipico dell'iniezione dipende da ciò che è stato iniettato.Ad esempio, i cambiamenti fenotipiche come risultato di specifici knockdown di mRNA possono essere evidenti a livello di anatomia grossolana. Se invece un cDNA che codifica per un gene istone 2B taggato EGFP sotto il controllo di un promotore di actina G.bimaculatus viene inserito nel genoma del cricket utilizzando la trasposasi piggyback, diventa possibile visualizzare ogni nucleo nell'uovo usando la fluorescenza per eccitare la proteina 2B taggata EGFP. Regolare il bilanciamento in modo che gli aghi non si intasano è un passaggio critico in questa procedura.Potrebbe essere necessario apportare diverse regolazioni dopo successive iniezioni poiché il tuorlo a volte intasa la punta dell'ago. Il cricket è un insetto emimetabolo che si ramica basalmente a insetti olometaboli ben studiati come drosophila. Studiare lo sviluppo del cricket ci aiuterà a capire di più sull'evoluzione e lo sviluppo in tutto il regno animale.Questa tecnica richiede un po 'di pratica. Si consiglia di praticare le iniezioni di controllo fino a quando il tasso di sopravvivenza quattro o cinque giorni dopo l'iniezione è di almeno l'80%

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Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

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