Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Il nostro protocollo descrive metodi per un'espressione efficiente e la purificazione del dominio FAH contenente proteine ma anche proteine in generale. La proteina FHD-1 svolge un ruolo regolatore nel ciclo TCA e nel metabolismo energetico dei mitocondri. Siamo stati in grado di associare la downregulation FHD-1 alla senescenza cellulare e le informazioni sull'attività enzimatica e sulla struttura proteica sono generalmente necessarie per comprendere i meccanismi molecolari alla base dei fenotipi osservati.

Il vantaggio principale dell'espressione delle proteine attraverso i sistemi vettoriali inducibili IPTG è che tutti i metodi sono relativamente economici e facili da stabilire in qualsiasi laboratorio. Utilizzando proteine di tipo polii istidina in combinazione con resine di nichel NTA agarosio, l'immensa selettività della cromatografia di affinità può essere utilizzata a basso costo. Per la maggior parte degli scopi, le proteine ottenute a questa qualità possono già essere sufficienti.

FPLC d'altra parte, è un metodo consolidato e generale con diversi vantaggi rispetto ad altri metodi. In primo luogo, inserire da cinque a 10 nanogrammi di plasmide in 100 microlitri di batteri BL21-DE3 pLysS E.coli competenti sul ghiaccio. Toccare leggermente il tubo per mescolare il contenuto.

Tenere i batteri sul ghiaccio per 30 minuti, toccando delicatamente il tubo ogni pochi minuti. Riscaldare uno shaker termo a 42 gradi celsius. Posizionare il tubo contenente i batteri nell'apparecchio e riscaldare per 90 secondi.

Quindi, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Dopo cinque o 10 minuti sul ghiaccio, aggiungere 600 microlitri di mezzo NZCYM e posizionare il tubo in un'incubatrice di batteri. Agitare il tubo a media velocità orientato lungo la direzione di scuotimento a 37 gradi celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, piastra 200 microlitri della coltura batterica su una piastra di agar LB di 10 centimetri contenente gli antibiotici di selezione di scelta. Coltura i batteri sulla piastra di agar LB nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius durante la notte. Dopo aver avuto successo nella formazione della colonia, scegli una singola colonia e disperdela in cinque millilitri di NZCYM con gli antibiotici selezionati.

Coltura nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius durante la notte. Dopo una crescita batterica di successo, amplificare i batteri in 250 millilitri, 500 millilitri o un litro di lotti di mezzo a seconda della domanda di quantità proteica. Quindi, coltura i batteri, nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius per due o tre ore.

Dopo l'incubazione, disegnare un campione per l'analisi fotometrica. Se la densità ottica a 600 nanometri ha raggiunto 0,4, applicare 200 micromolari fino a un millimolare di isopropil-beta-D-tiogalactopyranosid. Dopo altre tre o cinque ore nell'incubatrice di batteri a 37 gradi celsius l'espressione proteica è esaurita.

Raccogliere il pellet batterico tramite centrifugazione a 5.000 volte G per cinque minuti. Quindi, scartare il supernatante e congelare il pellet a meno 20 gradi Celsius per una breve conservazione. Per ogni 250 millilitri di sospensione batterica originale, applicare cinque millilitri del tampone selezionato al pellet batterico.

Aggiungere 10 microlitri di beta-mercaptoetanolo per cinque millilitri di tampone applicato. Utilizzare una pipetta Pasteur da 10 millilitri per forzare meccanicamente il pellet in sospensione graffiando e tubazionando. Trasferire tutta la sospensione in un tubo da 50 millilitri.

Quindi sonicare la sospensione. Quindi, centrifuga per 30 minuti ad alta velocità a quattro gradi celsius. Filtrare il supernatante consecutivamente con unità filtranti sul ghiaccio.

Preparare una colonna di plastica o vetro vuota collegarla a un fermo stabile e lavarla con tampone di corsa in nichel NTA. Per ogni 10 millilitri di sospensione proteica applicare 500 microlitri di liquami di nichel NTA agarosio sulla colonna. Riempire completamente la colonna con tampone di funzionamento in nichel NTA assicurandosi di non interrompere la resina di agarosio e consentire al tampone di passare per gravità.

Quindi, applicare la sospensione proteica sulla colonna e consentire al campione di passare per gravità. Dopo che il campione è passato, riempire la colonna con il buffer di funzionamento di nichel NTA. Posizionare una cuvetta trasparente UV sotto la colonna e raccogliere un millilitro di tampone di eluizione di nichel NTA.

Controllare la densità ottica del campione a 280 nanometri rispetto a un campione vuoto. In modo ottimale, il campione visualizza una densità ottica maggiore di 2,5. Poiché le proteine FAHD e il tampone di eluizione di nichel NTA precipiteranno al momento del congelamento e dello scongelamento, dializzare la proteina contro un diverso tampone durante la notte sul ghiaccio utilizzando un microlitro di DTT per 100 millilitri di tampone di dialisi.

Impostare un sistema FPLC e lavare la colonna con cinque volumi di colonna del 20% di etanolo seguiti da cinque volumi di colonna d'acqua. Dopo aver equilibrato la colonna, applicare il campione dializzato alla colonna e raccogliere il flusso attraverso. Impostare un'eluizione sfumato.

Al termine della sfumatura, eseguire con un buffer di sale elevato fino a quando non vengono rilevati altri picchi nell'intervallo di un volume di colonna. Avviare un lettore di microschedi ed equilibrare per 30 minuti a 25 gradi celsius. Preparare un millilitro di una soluzione da 20 millimolare di un substrato da testare nel tampone di dosaggio enzimatico.

Secondo lo schema di pipettazione nel protocollo di testo, preparare il vuoto enzimatico e campionare i pozzi pipettando 90 microlitri di tampone enzimatico nei pozzi con cinque microlitri di soluzione enzimatica. Quindi preparare il substrato vuoto e campionare i pozzi pipettando 95 microlitri di tampone di dosaggio enzimatico nei pozzi. Poco prima di misurare, applicare cinque microlitri di tampone enzimatico sui sei pozzi vuoti.

Applicare cinque microlitri della soluzione di substrato da 20 millimolare sui pozzi del campione. Utilizzare un pipetto multicanale con impostazione a 50 microliter per mescolare delicatamente i pozzi. Quindi, inserire la piastra nel lettore di microschete e misurare ogni bene a 255 nanometri.

Infine, eseguire l'analisi in un foglio di calcolo. Qui sono raffigurati due esempi di piastre di agar LB dopo una trasformazione ottimale e non ottimale. Troppe colonie batteriche indicano che due molti batteri sono stati placcati o che gli antibiotici potrebbero essere scaduti.

Troppo poche colonie batteriche possono indicare che o non è stato usato abbastanza plasmide per la trasformazione o che sono stati usati troppi antibiotici per selezionare i batteri. Il pellet batterico contenente la proteina espressa in quantità di milligrammo viene raccolto e l'espressione viene verificata tramite pagina SDS. Alcuni problemi possono verificarsi durante questo processo altrimenti semplice, comprese le proteine che formano corpi di inclusione o la proteina non espressa.

Se un His-tag viene utilizzato per etichettare la proteina, la cromatografia di affinità con l'agarosio NTA al nichel è un metodo di cattura facile ed economico che elimina la maggior parte delle contaminazioni. Se non viene utilizzata alcuna etichetta, una combinazione di precipitazione del solfato di ammonio e una cromatografia a scambio idrofobico consecutivo può anche separare la proteina dalla maggior parte delle altre proteine. La proteina è ulteriormente separata dalle contaminazioni degli avanzi per cromatografia a scambio ionico seguita da cromatografia ad esclusione di dimensioni per ottenere una proteina sufficientemente pura.

Nessuno dei metodi descritti è difficile in particolare. Ma tutti i metodi richiedono formazione. I primi tentativi possono fallire, ma gli esperimenti avranno successo dopo alcuni adattamenti aggiuntivi.

Tutti i metodi qui presentati sono metodi generali di purificazione delle proteine. Sebbene specializzato per le proteine FAHD, il protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina che si desidera purificare. Il FAHD-1 umano ricombinante è stato ottenuto con i metodi descritti e le strutture a raggi X ad alta risoluzione hanno contribuito massicciamente alla nostra comprensione del FAHD-1 per funzionalità che agiscono sia come decarbossilasi che idrolasi.

I batteri utilizzati in questo lavoro sono ceppi di sicurezza e non pericolosi. Le guide generali di sicurezza si applicano a tutte le sostanze chimiche e le colonne FPLC devono essere maneggiate con cura.