Name: Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Impara a preparare timociti apoptotici e macrofagi peritoneali per studiare l'efferocitosi. Questo metodo consente di valutare l'ingestione cellulare e gli effetti di inibitori specifici sulla fagocitosi.

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La ricerca nel laboratorio di Shao è supportata da Research premio innovativo dal Collegio di medicina e il premio Junior facoltà pilota del dipartimento di medicina interna, Università di Cincinnati e Grant DK K01_095067 da NIDDK/NIH.

I topi sperimentali sono stati allevati e mantenuti nella nostra colonia di topi. Tutti i lavori sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Cincinnati.
1. preparazione di CFSE etichettati timociti apoptotici
<ol><li>Euthanize due topi C57/B6 naïve di CO2 inalazione per 10 min e sezionare per aprire la cavità toracica, rimuovere (estrarre) il timo con pinze curve fine-Tip nella coltura tissutale Petri piatto contenente 10 ml di RPMI1640 medium.</li>
	<li>Ottenere una sospensione a singola cellula rettificando l'intero Timo contro due estremità smerigliate dei vetrini del microscopio e quindi filtrare la sospensione attraverso 100 μm filtro a cellule.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione da 10 ml di timo in un tubo da 50 ml e centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante, risospendere in 40 mL di 1X PBS, e contare i numeri di cella con un emocytometro.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospendere in 20 mL di 1X PBS in un tubo da 50 mL come una sospensione singola cellula con fino a 2 x 108 cellule (se più di 2 x 108 cellule, risospendere il resto delle cellule in un altro 20 ml di 1 x PBS in un diverso 50 ml tubo).</li>
	<li>Fare 5 μM di CFSE in volume uguale (20 mL) di 1X PBS in un tubo separato 50 mL pipettando 40 μL di soluzione stock CFSE (2,5 mM) in 20 mL di 1X PBS e mescolare bene invertendo il tubo 2-3 volte.</li>
	<li>Aggiungere i 20 mL di CFSE dal passo 1,7 nel 20 mL di sospensione cellulare dal passo 1,6 (la concentrazione finale di CFSE è ora 2,5 μM). Nota: per ogni sospensione cellulare da 20 mL, è necessario un 20 mL di tubo CFSE.</li>
	<li>Invertire la cella e il tubo della miscela CFSE 2-3 volte e incubare la miscela al buio a temperatura ambiente per un massimo di 2 min, quindi arrestare la reazione aggiungendo 10 mL di siero di cavallo inattivato dal calore.</li>
	<li>Centrifugare la miscela di provette 50 mL a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Nota: se l'etichettatura CFSE ha esito positivo, il pellet cellulare diventerà di colore giallo chiaro.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di 1X PBS e contare i numeri di cella con un emocytometro.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare nuovamente il pellet cellulare con 40 mL di media RPMI1640.</li>
	<li>Rimuovere le cellule supernatanti e risospendere con il mezzo di coltura tissutale RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calore inattivato), 20 mM di glutammina e 1x Pen/STREP) ad una concentrazione di 7 x 106 cellule/ml in un piatto di coltura di tessuto di 100 mm. Nota: se si ottengono più cellule, sarà necessario un piatto di coltura tissutale separato di 100 mm.</li>
	<li>Aggiungere la staurosporina nella coltura della sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1 μM e la coltura per 4 h a 37 ° c in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO2.</li>
</ol>2. preparazione di macrofagi peritoneali
<ol><li>Iniettare due topi C57B6 (o qualsiasi topo manipolato dal gene in laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL del 3% di tioglicicolato invecchiato al giorno 0.</li>
	<li>Euthanize i topi al giorno 5 come al passo 1,1, tagliare e sbucciare aprire la pelle addominale, ma lasciare il peritoneo intatto. Sciacquare la cavità peritoneale spingendo rapidamente 10 mL di tampone di lavaggio (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL fissata con un ago da 18 G.</li>
	<li>Recuperate lentamente il tampone di lavaggio con lo stesso ago/siringa e raccogliete il tampone di lavaggio in un tubo da 50 mL (i dettagli si riferiscono all'articolo15del Lab Janssen).</li>
	<li>Lavare il gavaggio peritoneale due volte con 1x PBS, risospendere i macrofagi peritoneali nel mezzo di coltura tissutale RPMI1640 a una densità di 2 x 106 cellule/ml e aliquota 500 μl in ogni pozzetto della piastra 24-well. Lasciare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere le cellule galleggianti aspirando e sostituendo con 500 μL di mezzo di coltura fresco, due volte.</li>
	<li>Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della tirosina del recettore TAM, RXDX-106, alle concentrazioni indicate nelle leggende figura in ogni pozzo della coltura macrofage e incubare per un altro 2 h.</li>
</ol>3. co-coltura di macrofagi peritoneali con timociti apoptotici
<ol><li>Raccogliere i timociti apoptotici dal passo 1 e lavare tre volte con RPMI1640 medio. L'efficienza dell'induzione apoptotica può essere misurata in questa fase con il kit Annexin V/7-AAD.</li>
	<li>Distribuire 0-12 x 106 cellule (in 500 μl di media) in ogni pozzo delle colture di macrofage dal protocollo #2, secondo la disposizione sperimentale (ad esempio, vedere Figura 1). Questo rende l'intero volume di coltura di 1 mL in ogni pozzo della piastra 24-well. Aggiungere l'anticorpo bloccante nella coltura immediatamente prima dell'aggiunta di thymocytes apoptotici.</li>
	<li>Coltura della miscela cellulare a 37 ° c per 4 h in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO2.</li>
	<li>Lavare ogni pozzo della coltura con 1x PBS (contenente 500 μM EDTA) due volte per rimuovere le cellule apoptotiche libere galleggianti.</li>
	<li>In questa fase, macchiare i macrofagi con CD11b-PE legati alla placca.<ol>
<li>Lavare i macrofagi a piastre con tampone di colorazione (1x PBS, 1% BSA) una volta.</li>
		<li>Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare la piastra a 4 ° c per 20 min.</li>
		<li>Lavare ogni pozzetto di piastra tre volte con il tampone di colorazione.</li>
		<li>Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere con la piastra per l'analisi delle immagini sotto il microscopio fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, staccare i macrofagi legati alla placca aggiungendo 1 mL di lidocaina 1% in PBS e incubando per 10 min a 37 ° c.</li>
	<li>Scollegare i macrofagi a piastre con il pipettaggio ripetuto.</li>
	<li>Trasferire la sospensione di macrofage in un singolo tubo FACS a fondo rotondo da 5 mL da ciascun pozzetto della piastra 24-well.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE (1:200 diluizione nel tampone di colorazione).</li>
	<li>Incubare la sospensione cellulare nel tampone di colorazione a 4 ° c per 20 min.</li>
	<li>Lavare due volte la sospensione cellulare con tampone di colorazione.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere all'analisi FACS con un citometro a flusso e analizzare la percentuale dei macrofagi di positività CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
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<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'apoptosi è un processo di morte cellulare altamente conservato che coinvolge molte cascate di segnale e induce l'espressione proteica, la secrezione e il trasporto. L'apoptosi è spesso associata a cambiamenti della morfologia cellulare17. Le cellule apoptotiche rilasciano attivamente citochines e chemokine che attraggono i fagociti per migrare al sito e avviare il processo di engulfment, un percorso estremamente complesso sotto stretto controllo18. Dall'altro lato, la mor...

Il nostro corpo genera 1-10 miliardi di cellule apoptotiche su base giornaliera. Tale numero elevato di cellule apoptotiche deve essere cancellato in modo che le risposte immunitarie rimangano quiescenti. Per garantire la clearance delle cellule apoptotiche in modo tempestivo, numerosi tipi di cellule residenti tessuto e cellule circolanti sviluppano meccanismi per inghiottire le cellule apoptotiche1. La regolazione disfunzionale dell'apoptosi è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione di varie malattie infiammatorie e autoimmunità2. L'apoptosi svolge anche un ruolo critico nella patogenesi dello sviluppo del cancro e la sua conseguente resistenza ai trattamenti convenzionali3,4. La rimozione delle cellule apoptotiche generalmente promuove una risposta antinfiammatoria, che può essere legata alla tolleranza immunologica5. La violazione della clearance delle cellule apoptotiche spinge l'auto-immunizzazione e contribuisce allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche sia negli esseri umani che nei topi6.
Quando le cellule subiscono l'apoptosi, espongono la fosfatidilserina (PtdSer) dall'opuscolo interno al foglietto esterno della membrana. PtdSer sarà quindi riconosciuto dai fagociti attraverso i recettori superficiali. Oltre una dozzina di recettori sono stati identificati per riconoscere e/o facilitare l'fiamme di cellule apoptotiche. In generale, ci sono almeno tre tipi di recettori superficiali coinvolti nella clearance delle cellule apoptotiche: recettori tethering, riconoscono le cellule apoptotiche; solletico recettori, avviare engulfment; i recettori di da chaperon, facilitano l'intero processo7. Le tirosina chinasi del recettore TAM (RTK TAM) consistono in TYRO-3, AXL e Mer e sono espresse principalmente da cellule mieloidi del sistema immunitario8. La funzione primaria di TAM RTKs è quella di servire come recettori tethering, facilitando la rimozione fagocitica di cellule apoptotiche e detriti. Il nostro gruppo ha studiato la clearance della cellula apoptotica mediata da TAM nell'impostazione dell'autoimmunità per molti anni. La proteina K-dipendente dall'arresto della crescita proteica specifica 6 (Gas6) e proteina S (Pro) si lega e attiva i recettori Tam9,10. Gas6 è prodotto nel cuore, nei reni e nei polmoni. Pro è prodotto principalmente nel fegato11. TAM riconosce le cellule apoptotiche in modo tale che il N-terminale di Gas6/ProS si lega al PtdSer su una cellula apoptotica e il C-terminal di Gas6/ProS si lega ai recettori TAM che ancorati sulla superficie dei fagociti. Insieme con gli altri recettori, fiamme di cellule apoptotiche si verifica12. Anche se Mer può legarsi sia ai ligandi Pro e Gas6, abbiamo scoperto che Gas6 sembra essere l'unico ligando per la fagocitosi di macrofage mediata da Mer di cellule apoptotiche, che può essere bloccata dall'anticorpo anti-Mer13. I macrofagi sono fagociti professionali. La clearance rapida delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi è importante per l'inibizione dell'infiammazione e delle risposte autoimmuni contro gli antigeni intracellulari. La tirosina chinasi del recettore del Mer è critica per l'fiamme macrofage e la clearance efficiente delle cellule apoptotiche14. Nella milza del topo, Mer si esprime principalmente sulla zona marginale e sui macrofagi corporei tangibili13.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo di base per indurre l'apoptosi cellulare e dimostrare modi per misurare il processo e l'efficienza dell'efferocitosi. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare l'efferocitosi da altri tipi di cellule in fiamme di cellule apoptotiche di diverse origini.

<table><tbody><tr><td>tampone di lisi d'ack</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubi</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini smerigliati</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo (inattivato termicamente)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Preparare l'1% di tampone in 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprina (100mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Aggiungere 214,3 ml di DMSO in 100mg per ottenere una soluzione di calza 1mM</td></tr><tr><td>Tioglicolato Medio Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Preparare un tampone tioglicolato al 3% in 1&acute; PBS, sterilizzato in autoclave e conservare al buio per 3 mesi.</td></tr></tbody></table>

analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

L'apoptosi cellulare è un processo naturale e svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale, nella regolazione omeostatica, nell'induzione della tolleranza immunitaria e nella risoluzione dell'infiammazione. L'accumulo di detriti apoptotici nel corpo può innescare risposte infiammatorie croniche che portano a malattie immunitarie sistemiche nel tempo. Alterata clearance delle cellule apoptotiche è stata implicata in una varietà di malattie autoimmuni. La clearance apoptotica è un processo complesso raramente rilevato in condizioni fisiologiche. Si tratta di abbondanti recettori superficiali e molecole di segnalazione. Studiando il processo di clearance delle cellule apoptotiche fornisce meccanismi molecolari penetranti e successive risposte biologiche, che possono portare allo sviluppo di nuove terapie. Qui, descriviamo i protocolli per l'induzione di thymocytes apoptotici, la preparazione di macrofagi peritoneali, e l'analisi della clearance delle cellule apoptotiche da citometria di flusso e microscopia. Tutte le cellule subiscono l'apoptosi in un certo stadio, e molte cellule residenziali e circolanti possono captazione di detriti apoptotici. Pertanto, il protocollo qui descritto può essere utilizzato in molte applicazioni per caratterizzare l'associazione di cellule apoptotiche e l'ingestione da molti altri tipi di cellule.

Analisi dell'fiamme peritoneale del macrofago mediato di thymocytes apoptotici. I macrofagi peritoneali e le cellule apoptotiche sono state preparate e co-coltivate come descritto nel protocollo. I macrofagi sono stati staccati e macchiati con l'anticorpo anti-CD11b di PE coniugato per 20 minuti sul ghiaccio. I macrofagi sono stati poi lavati ed elaborati in un citometro a flusso. Come si è visto, non esiste un macrofago positivo CFSE nel quadrante in basso a destra quando non sono state aggiunte cellule...

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Il nostro corpo genera da uno a 10 miliardi di cellule apoptotiche ogni giorno. L'efficiente clearance di queste cellule aiuta a rimuovere i detriti cellulari e a mantenere gli inventari. Questo metodo può essere usato in molte applicazioni per caratterizzare il legame e l'ingestione di cellule apoptotiche da molti altri tipi di cellule fagocitiche.A dimostrare questa procedura sarà Yuxuan Zhen, un tecnico senior nel mio laboratorio. Per raccogliere i timociti, dopo aver aperto la cavità toracica di un ingenuo topo C57 nero 6, utilizzare forcette curve a punta fine per estrarre il timo. Mettere l'organo in un piatto di coltura tissutale contenente 10 millilitri di RPMI 1640 Medium.Macinare l'intero timo contro le estremità smerigliate di due vetrini del microscopio e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Raccogliere i timociti mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 40 millilitri. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e rimorsi fino a due volte 10 alle otto cellule in 20 millilitri di PBS fresco per tubo da 50 millilitri.Etichettare le celle con cinque CFSE micromolare in 20 millilitri di PBS per tubo. Invertire i tubi da due a tre volte per mescolare prima di incubare i timociti per non più di due minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 millilitri di siero di cavallo inattivato dal calore e raccogliere le cellule per centrifugazione.Resuspend le cellule etichettate in 40 millilitri di PBS fresco per il conteggio e la centrifugazione seguita da un lavaggio aggiuntivo con 40 millilitri di mezzo. Dopo il lavaggio medio, risosopendare i timociti a un sette per 10 alle sei cellule per millilitro della concentrazione media di coltura tissutale e seminare le cellule in un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri. Quindi aggiungere la staurosporina alla coltura cellulare a una concentrazione finale micromolare e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per quattro ore.Per l'isolamento macrofago peritoneale, iniettare due topi C57 neri 6 intraperitonealmente con un millilitro di tioglicollato invecchiato al 3% al giorno zero prima di aprire la pelle addominale senza disturbare il peritoneo il quinto giorno. Per lavare la cavità peritoneale, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per spingere rapidamente 10 millilitri di tampone di lavaggio nella cavità prima di aspirare lentamente il tampone di lavaggio per la raccolta in un tubo da 50 millilitri. Lavare la lavanda peritoneale due volte con PBS.Resospendare i macrofagi peritoneali a una concentrazione media di coltura tissutale due volte 10 a sei cellule per millilitro. Seme successivo 500 microlitri di macrofagi in ogni pozzo di una piastra di 24 pozza e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per due ore. Alla fine dell'incubazione, aspirare il supernatante a rimuovere le cellule galleggianti e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura tissutale ad ogni pozzo.Aggiungere immediatamente zero a 12 per 10 ai sei timociti in 500 microlitri di mezzo ad ogni pozzo della coltura e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura tissutale per quattro ore. Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene due volte con PBS fresco per rimuovere eventuali cellule apoptotiche galleggianti libere seguite da un singolo lavaggio con tampone di colorazione. Etichettare successivamente i macrofagi legati alla piastra con 200 microlitri di tampone di colorazione integrati con un anticorpo anti-CD11b appropriato per pozzo e posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti.In questo esperimento rappresentativo, fino al 30% dei macrofagi peritoneali stimolati dal tioglicollato hanno dimostrato un segnale positivo nel canale CFSE che indica che questi fagociti avevano ingerito cellule apoptotiche etichettate CFSE. L'osservazione microscopica dell'inghiottimento di macrofagi delle cellule apoptotiche è essenziale per studiare la capacità dei macrofagi di ingerire cellule apoptotiche come macrofagi positivi CFSE sparsi nel quadrante in basso a destra a causa di diverse intensità che indicano che il numero di cellule apoptotiche all'interno dei singoli macrofagi è diverso. Un rapporto più elevato tra cellule apoptotiche e macrofagi non solo aumenta il numero di macrofagi che ingeriscono cellule apoptotiche, ma migliora anche la capacità dei macrofagi di ingerire cellule più apoptotiche.In un'altra serie di esperimenti, circa il 15% dei macrofagi divenne positivo al CFSE quando il CFSE etichettato timociti apoptotici fu aggiunto alla coltura del macrofago per quattro ore indicando che questi macrofagi erano i macrofagi fagocitici. L'anticorpo Mer blocca l'efferocitosi macrofagia in modo dose-dipendente e il blocco complessivo può rappresentare circa il 30% dell'efficienza dell'efferocitosi nell'ambiente attuale. Inoltre, un inibitore del recettore TAM appena approvato attenua l'efferocitosi del macrofago in modo dose-dipendente fino a una concentrazione di circa 100 nanomolare.Ricorda sempre di controllare la percentuale di cellule apoptotiche poiché questo numero influisce direttamente sull'efficienza dell'efferocitosi. I macrofagi fagocitici possono essere ulteriormente analizzati dalla macchia occidentale per indagare le molecole di segnalazione regolate dal processo di inghiottimento e dalla microscopia per studiare la dinamica dell'inghiottimento.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo il test di efferocitosi per studiare la clearance delle cellule apoptotiche utilizzando la microscopia confocale. L'efferocitosi è un processo in più fasi in cui le cellule apoptotiche vengono inghiottite dai fagociti e degradate all'interno di vescicole chiamate efferosomi. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare porzioni internalizzate e non internalizzate di singole cellule apoptotiche e quantificare l'efferocitosi.

Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

Questo video mostra una procedura per analizzare l'efferocitosi mediata da macrofagi peritoneali di timociti di topo apoptotico mediante microscopia a fluorescenza.

Analisi dell'efferocitosi dei timociti apoptotici da parte dei macrofagi peritoneali

Questo video mostra un test di apoptosi in cellule tumorali indotta da cellule T effettrici pre-attivate. Co-coltivando queste cellule con cellule tumorali marcate con nuclei fluorescenti, viene aggiunto un substrato fluorogenico scissibile della caspasi. Le cellule tumorali apoptotiche mostreranno un colore diverso nei loro nuclei, portando alla doppia fluorescenza. Questa doppia fluorescenza è indicativa di cellule tumorali in fase di apoptosi.

Un test in vitro per studiare la citotossicità delle cellule T CD8+ pre-attivate contro le cellule tumorali

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione degli eventi di segnalazione intracellulare indotti in cellule vitali dall'interazione fisica con cellule morte o morenti adiacenti. Il protocollo si concentra sugli eventi di segnalazione indotti dal riconoscimento mediato dal recettore delle cellule morte, in contrapposizione al loro assorbimento fagocitario o al rilascio di mediatori solubili.

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.

Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in Drosophila Embrioni

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Descriviamo qui un protocollo per studiare la citotossicità di pre-attivato CD8+ T cellule contro le cellule tumorali dalla rilevazione apoptotic microscopia del cancro cellule via in tempo reale. Questo protocollo può studiare i meccanismi dietro la soppressione delle cellule T indotta da cellula mieloide e valutare composti puntati replenishing T cellule tramite blocco delle cellule mieloidi soppressive immuni.

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Impara a preparare timociti apoptotici e macrofagi peritoneali per studiare l'efferocitosi. Questo metodo consente di valutare l'ingestione cellulare e gli effetti di inibitori specifici sulla fagocitosi.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

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