Name: Preparazione di cellule liquide microwell supportate al grafene per la microscopia elettronica di trasmissione in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri la preparazione di cellule liquide microwell supportate al grafene per microscopia elettronica in situ. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale della crescita e dissoluzione di nanocristalli d'oro con risoluzione elevata.

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Ringraziamo Tilo Schmutzler per la preparazione della soluzione HAuCl 4. Inoltre, ringraziamo R. Christian Martens per la lettura delle prove. Sostegno finanziario della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso il Research Training Group GRK 1896 " La microscopiain situ con elettroni, raggi X e sonde a scansione" e attraverso il Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM "Ingegneria dei materiali avanzati" è riconosciuto con gratitudine.

1. Fabbricazione di modelli di cellule liquide basate su microwell
<ol><li>Togliere i residui organici e gli strati di ossido nativo da un singolo wafer di silicio spesso 175 m, monocristallo, dopato al boro (1 – 30) , 100 mm di diametro (100). Applicare un passo di ossidazione con H2O2 e TMAH, seguito da un tuffo HF nella soluzione 1 – 5% HF.</li>
	<li>Ossidare termicamente il wafer in un'atmosfera di ossigeno secco a 800 gradi centigradi per far crescere uno strato di ossido con uno spessore di 11 nm (Figura 2a). 3% Dichlorethene (DCE) viene utilizzato per legare la contaminazione metallica.</li>
	<li>Depositare uno strato stoichiometrico Si3N4 tramite deposizione di vapore chimico a bassa pressione (LPCVD). Lo spessore dello strato Si3N4 definisce la profondità del pozzo. Scegliere un valore adatto per l'esperimento pianificato (ad esempio, 500 nm) (Figura 2b).</li>
	<li>Definire la geometria del pozzo laterale strutturando il lato anteriore tramite fotolitografia e incisione a ioni reattiva (RIE) (Figura 2c). Le dimensioni adatte sono ad esempio strutture circolari con raggio di 2,5 m disposte in serie esagonali. Scegliere con attenzione la distanza del pozzo (ad esempio, 5 m), per evitare instabilità nella struttura.</li>
	<li>Depositare altri 20 nm di stoichiometrica Si3N4 di LPCVD, che forma la membrana inferiore della cellula liquida (Figura 2d). Seguire la procedura descritta in precedenza (vedere il passaggio 1.3).</li>
	<li>Utilizzare una seconda fotolitografia/passo RIE per strutturare il retro che definisce successivamente le dimensioni geometriche del telaio LC e le sue finestre TEM (Figura 2e) (Diametro fotogramma: 3 mm).</li>
	<li>Attraverso la microlavorazione sfusa nel 20% KOH a 60 gradi centigradi, rimuovere il Si nell'area predefinita e creare una membrana Si3N4 di cassaindipendenti (Figura 2f).</li>
	<li>Rimuovere gli ioni metallici residui in una fase di pulizia finale con soluzione HCl al 10% e acqua deionizzata (DI).</li>
</ol>2. Trasferimento di grafene su griglie TEM
<ol><li>Sorrida il tessuto su cui è collocato il bit commerciale a pochi strati (6 –8) CVD-graphene sulla PMMA. Immergere il grafene rivestito di PMMA in un piatto Petri riempito con acqua DI (Figura 3a). NOTA: Il numero di strati di grafene può essere determinato utilizzando tecniche fattibili32,33.</li>
	<li>Posizionare lo strato di grafene su una carta da filtro e tagliarlo in pezzi adatti a coprire tutti i pozzi fabbricati (ad esempio, 4 mm2) (Figura 3b).</li>
	<li>Immergere nuovamente i pezzi tagliati nel piatto Petri (Figura 3c).</li>
	<li>Utilizzare una griglia TEM rivestita con uno strato di supporto di carbonio holey per pescare i pezzi prodotti dall'acqua DI. Per farlo, immergere con attenzione la griglia in acqua e catturare il grafene galleggiante sulla superficie. Tenere la griglia con una pinzetta anti-capillare (Figura 3d,e). NOTA: fare attenzione che il sito di grafene dello stack grafene-PMMA rimanga in cima durante l'intera procedura. In caso contrario, la successiva rimozione di PMMA solleverà lo strato di grafene.</li>
	<li>Lasciare asciugare i fogli per qualche ora.</li>
	<li>Rimuovere lo strato di protezione PMMA in un bagno di acetone per 30 min e aggiungere consecutivamente ulteriori passaggi di pulizia immergendo in etanolo e acqua DI senza asciugare il campione in mezzo. Utilizzare un recipiente piatto (ad esempio, un piatto Petri) per semplificare il trasferimento del campione in seguito.</li>
	<li>Asciugare il campione in seguito per 30 min in condizioni ambientali.</li>
</ol>3. Preparazione degli spettri
<ol><li>Preparare il campione per l'incorporazione nel GSMLC. Per farlo, prepara una soluzione di stock da 1 mM risolvendo 196.915 mg di cristalli HAuCl4.3H2O in 0,5 L di acqua DI.</li>
	<li>Prendere la quantità desiderata di campioni dalla soluzione di riserva. In questo caso, viene applicato 0,5 ll. Questo può essere fatto utilizzando una siringa o una pipetta Eppendorf.</li>
</ol>4. Carico GSMLC
<ol><li>Sciacquare il modello di cellule liquide fabbricate con acetone ed etanolo.</li>
	<li>Applicare un ambiente O2/N2 (20%/80%) plasma per 5 min per migliorare la umidità della membrana.</li>
	<li>Distribuisci 0,5 l di soluzione di campioni sul modello o sullo strato di grafene. Garantire una procedura di lavoro liscia per ridurre al minimo i cambiamenti di concentrazione dovuti all'evaporazione.</li>
	<li>Posizionare la griglia TEM sullo strato Si3N4 micromodellato con il grafene rivolto verso il modello. Premere la griglia TEM rivestita di grafene sul modello. Fare attenzione a non distruggere la membrana si3N4 fondo.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione in eccesso con un tessuto per accelerare l'essiccazione cellulare e quindi mitigare i cambiamenti di concentrazione (Figura 4a). Dopo circa 2 – 3 min, l'interazione del grafene-Si3N4 van-der-Waals sigilla sufficientemente la cellula liquida (Figura 4b). In alternativa, lasciare asciugare completamente la cella senza rimuovere la soluzione in eccesso. Quest'ultimo offre un più alto tasso di successo nell'elaborazione cellulare. Tuttavia, si prevede che i cambiamenti di concentrazione basati sull'evaporazione nella soluzione del campione siano più gravi quando si utilizza questo approccio. NOTA: il processo di essiccazione riuscito può essere verificato con un cambiamento di contrasto nella periferia (confrontare la figura 4a,b).</li>
	<li>Rimuovere con attenzione la griglia TEM con una pinzetta spingendo una punta di pinzetta tra la griglia e il telaio GSMLC. NOTA: I movimenti cutanei potrebbero rompere la membrana sottostante. Per ridurre i danni alla forza di taglio, iniziare dalla griglia parallela al bordo della finestra più piccolo.</li>
	<li>Controllare se almeno una membrana del GSMLC è ancora intatta tramite microscopia ottica (Figura 4c). Se tutte le membrane fossero rotte, LCTEM sarebbe impossibile.</li>
</ol>5. Imaging TEM e analisi video
<ol><li>Caricare il campione in un TEM (S)direttamente dopo la preparazione utilizzando un supporto TEM standard. NOTA: Come riportato per GLC19, GSMLCs può asciugare nel tempo. Pertanto, il tempo tra il caricamento e l'imaging deve essere ridotto al minimo.</li>
	<li>Immagine del campione con una tecnica di imaging adatta, a seconda del campione e del microscopio. In questo caso, viene utilizzato un dispositivo (S)TEM azionato ad una tensione di accelerazione di 300 kV. Utilizzare una dose bassa per ridurre al minimo gli artefatti indotti dal fascio e un breve tempo di esposizione per evitare la sfocatura correlata al movimento34. In caso di esperimenti a lungo termine, bloccare il fascio per ridurre i danni da radiazioni. NOTA: grazie a una migliore risoluzione temporale, TEM deve essere preferito rispetto a STEM per le analisi cinetiche34 e una riduzione ridottadi 35. STEM, tuttavia, è preferito per l'indagine su strati liquidi spessi ed elementi ad alta risoluzione a causa della sua maggiore risoluzione spaziale negli esemplari spessi34,35.</li>
	<li>
Metodo di segmentazione dell'immagine
	<ol>
<li>Utilizzare una piattaforma di elaborazione delle immagini adatta per estrarre le caratteristiche di interesse. Per il tracciamento e l'analisi delle particelle, utilizzare l'immagine open source ImageJ-distribuzione FIJI36.</li>
		<li>Utilizzate la funzione Analizza particelle per ottenere informazioni precise (area proiettata, baricentro) di ogni particella in ogni fotogramma. NOTA: questa funzione richiede immagini binarie.</li>
		<li>Collegare le particelle tra i fotogrammi con l'aiuto del plugin TrackMate37. Per impostazione predefinita, TrackMate sta cercando particelle luminose su uno sfondo scuro, quindi inverti le immagini (nel caso di BF-TEM) prima di iniziare TrackMate.</li>
		<li>Combina i risultati di TrackMate e Analyze Particles con uno script adatto utilizzando l'ecosistema open source basato su Python SciPy38,39.</li>
		<li>Utilizzare FIJI per estrarre i contorni precisi di strutture più complesse come i dendriti. In questo caso, analizzare le particelle può essere applicato, nonché (vedere l'inset di Figura 6a). NOTA: potrebbe essere possibile analizzare manualmente le funzioni di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Non abbiamo niente da rivelare.

A differenza delle celle liquide disponibili in commercio, i GSMLC su misura hanno il vantaggio di poter essere progettati per adattarsi ai supporti TEM prontamente disponibili e non richiedono un costoso supporto TEM dedicato a celle liquide.
L'architettura GSMLC qui dimostrata combina aspetti dei SiLC e dei GLC che potrebbero potenzialmente portare a vantaggi unici. Da un lato, i SILC consentono una precisa determinazione della posizione e della forma delle cellule, ma richiedono membrane Si3N4 relativamente spesse per ridurre gli effetti sporgenti, riducendo in ultima analisi la risoluzione realizzabile. I GLC, d'altra parte, presentano pareti di membrana eccezionalmente sottili costituite da grafene, ma soffrono di dimensioni e posizioni casuali della tasca. Combinando questi due approcci a membrana tramite GSMLC, la limitazione di risoluzione causata dai confini cellulari35 può essere ignorata. Poiché la struttura del pozzo è fabbricata direttamente nello strato Si3N4, l'attuale membrana Si3N4 può essere costruita ancora più piccola rispetto ai SiLC, semplificando le analisi HRTEM che sono già state dimostrate nei GSMLC6 . Ancora, va notato che HRTEM in generale è possibile con SiLC e48. Inoltre, grandi aree di osservazione possono essere realizzate senza forti aree di finestra rigonfiamento a causa delle piccole aree di membrana delle singole camere campione. In tal modo, l'aumento dello spessore correlato al rigonfiamento35 può essere escluso in larga misura, come dimostrato da Dukes et al. Ciò è dimostrato nella Figura 7, in cui viene visualizzato un'immagine STEM di un campo scuro anulare ad alto angolo (HAADF) rappresentativo di GSMLC al caricato. Questa immagine è stata acquisita utilizzando un sistema dual-beam. Poiché la luminosità dell'immagine acquisita in questa configurazione è direttamente correlata allo spessore del campione, è chiaramente visibile che i micropozzi sigillati presentano solo piccoli rigonfiamenti negativi. Kelly et al.24 hanno dimostrato che il rigonfiamento negativo e parziale ben essiccazione visibile in Figura 7 dipende dal diametro del pozzo. Ridurre il diametro del pozzo è quindi un approccio fattibile per omogeneizzare ulteriormente lo spessore del liquido.
A causa della forma tascabile equilibrio dei GLC, lo spessore del liquido è anche fortemente dipendente dal sito35. I SiLC seguono il design di due membrane derivanti da diversi wafer Si. Sostituendo la membrana superiore Si3N4 con il grafene, la fabbricazione di celle liquide è semplificata. Ciò significa che la possibile delaminazione di due Si-wafer incollati durante le successive fasi di incisione umida può essere evitata e l'allineamento di due pezzi di wafer durante il caricamento della cella viene omesso. La superficie piana su un lato di questa architettura cellulare consente metodi di analisi in situ complementari come l'analisi EDXS del campione6, che è limitata nelle architetture SiLC convenzionali da effetti di ombreggiatura a ripidi Si bordi50 .
I micropozzi premodelli di sigillazione con grafene sul pozzo inferiore e superiore sono stati dimostrati primadel 24,25. L'applicazione di due membrane di grafene può migliorare la risoluzione raggiungibile. Un duplice trasferimento di grafene, tuttavia, complicherebbe ulteriormente il processo di preparazione; soprattutto perché questo ha dimostrato di essere il passo di preparazione più sensibile (vedi sotto). Inoltre, si prevede che il rigonfiamento della membrana di cui sopra sarà ancora più critico nel caso di due membrane di grafene, perché il grafene è molto più flessibile di uno strato Si3N4. In queste architetture, i micropozzi sono stati costruiti utilizzando la fresatura a fascio ionico a fuoco sequenziale (FIB). Sebbene questo approccio abbia dimostrato di produrre risultati di alta qualità, la fresatura FIB è tecnica di produzione cellulare complicata e costosa. L'utilizzo di tecniche di modellazione a colpo singolo massicciamente parallele che sono già standard nell'industria dei semiconduttori di oggi, come la nanoimprint o la fotolitografia, tuttavia, ha il principale vantaggio di essere veloce, economico e scalabile per la produzione di massa.
Va notato che l'approccio qui presentato non consente il funzionamento del flusso di liquido, che è realizzabile da altri disegni e modelli28. Poiché il carico e il volume liquido sono comparabili per GSMLC e GLC, una contaminazione di vuoto elevato a causa della rottura della membrana può essere evitata19. Questo elimina la necessità di un controllo della guarnizioni ingombrante. Anche se i vantaggi dei SILC e dei GLC sono stati combinati, gli svantaggi di entrambi gli approcci sono ancora presenti nei GSMLC. La fabbricazione delle cellule richiede un'infrastruttura di camera pulita per la tecnologia del silicio, che non è necessariamente presente nei laboratori TEM. Inoltre, il caricamento del liquido non è banale. Richiede una formazione dedicata, simile alle cellule di grafene. Questo, tuttavia, vale anche per i sistemi disponibili in commercio. Qui, la fase di preparazione più sensibile è la rimozione della griglia TEM dopo il trasferimento del grafene perché i movimenti di avruzione cutanea o il nervosismo rischiano di rompere lo strato Si3N4. I finestrini a membrana ridondanti, tuttavia, aumentano le possibilità di preservare almeno un'area di membrana. Di conseguenza, la resa (quantità di chip GSMLC operabili) ottenuta da uno sperimentatore addestrato è di tre su quattro6, e quindi supera quella ottenuta con le cellule a base di grafene (da uno a due su quattro)19.
Come per i GLC, l'incapsulamento di liquidi nei GSMLC si basa sulle interazioni van-der-Waals18. Di conseguenza, la contaminazione dell'interfaccia potrebbe ridurre il tasso di successo nell'elaborazione dei GSMLC19. Inoltre, a seconda della costante Hamaker della fase liquida da incapsulare, le caratteristiche di bagnatura durante la procedura di caricamento (e quindi la resa ottenibile) possono differire51 e quindi la preparazione può essere complicata. La nostra esperienza dimostra che questo è il caso se, per esempio, le specie di anfifilici sono presenti.
L'architettura GSMLC consente una configurazione flessibile dei pozzi, consentendo l'adattamento a vari prerequisiti sperimentali. Inoltre, l'architettura è adatta per le indagini sulla tomografia elettronica su un ampio intervallo di inclinazione-angolo di 75 gradi, che consentirebbe anche la tomografia degli elettroni in situ 52. Pertanto, anche con i GSMLC potrebbero essere istituite la tomografia in situ e post mortem del campione in liquido.

La scienza dei materiali moderni, la chimica e la biologia cellulare richiedono una profonda comprensione dei processi dinamici e degli effetti sottostanti su scala sub-micron. Nonostante la potenza delle tecniche avanzate di microscopia ottica come la microscopia a fluorescenza stimolata e deplezione1,le tecniche di imaging diretto per accedere a morfologie dettagliate richiedono microscopia elettronica. In particolare, la microscopia elettronica a trasmissione in situ (S)TEM ha dimostrato di illuminare preziose informazioni sulle dinamiche di processo incapsulando liquidi in celle dedicate e a basso vuoto2. Vari esperimenti come le indagini quantitative sulla cinetica della formazione di nanostrutture e sulla termodinamica3,4,5,6, imaging di campioni biologici7, 8 (IN vio , 9 (in vie , 10 e studi di meccanismi di stoccaggio dell'energia11,12 insieme a studi completi di dinamica del processo di corrosione13 o nanobolle fisica14,15, 16 hanno svelato molti fenomeni utilizzando (S)TEM che non erano accessibili utilizzando tecniche di microscopia standard.
Nell'ultimo decennio sono stati stabiliti due importanti approcci per realizzare teM (LCTEM) a cellule liquide in situ. Nel primo approccio, il liquido è incapsulato in una cavità tra due membrane Si3N4 prodotte tramite la tecnologia di processo Si17, mentre nel secondo, piccole tasche liquide si formano tra due fogli di ossido di grafene o grafene 10,18. La manipolazione sia delle cellule liquide a base di silicio (SiLC) che delle cellule liquide a base di grafene (GLC) è stata dimostrata19,20,21. Anche se entrambi gli approcci hanno subito miglioramenti significativi22,23,24,25, mancano ancora nella combinazione dei rispettivi vantaggi. In generale, esiste un compromesso tra l'incapsulamento del campione in sacche di grafene spesso indefinite con un piccolo volume liquido che consente l'imaging ad alta risoluzione18, e volumi cellulari ben definiti con conseguente membrane e strati liquidi più spessi, che forniscono un ambiente più vicino alla situazione naturale del liquido sfuso26 a scapito della risoluzione2. Inoltre, alcuni esperimenti dipendono da un flusso liquido26,27 che è stato realizzato solo nelle architetture SiLC e richiede un titolare TEM dedicato28.
Qui presentiamo la fabbricazione e la manipolazione di un approccio a cellule liquide per un approccio ad alte prestazioni in situ LCTEM tramite cellule liquide di microwell (GSMLC) supportate dal grafene per le analisi TEM. Uno schizzo del GSMLC è presentato in Figura 1. I GSMLC hanno dimostrato di essere in grado di consentire i risultati di microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione in situ (HRTEM)6 e sono fattibili anche per la microscopia elettronica a scansione in situ 29. Il telaio basato sulla tecnologia Si consente la produzione di massa di cellule riproducibilmente sagomate con spessore liquido su misura e membrane extra-sottili da un singolo wafer. La membrana del grafene che copre queste cellule mitiga anche le perturbazioni indotte dal fascio di elettroni8,30,31 da quando il fascio di elettroni passa prima attraverso la membrana superiore del grafene. La topografia piatta delle cellule consente metodi di analisi complementari come la spettroscopia a raggi X dispersivo di energia (EDXS)6 senza effetti di ombreggiatura derivanti dalla cellula liquida stessa, consentendo una varietà di in situ di alta qualità esperimenti di microscopia elettronica a cellule liquide.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>VWR Chemicals</td><td>50488858</td><td>VLSI</td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td>deionizzata</td><td>di produzione propria</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette anti-capillari</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LH72.1</td><td>0203-N5AC-PO Etanolo in lega Dumoxel</td></tr><tr><td></td><td>VWR Chemicals</td><td>85651.360</td><td>VLSI</td></tr><tr><td>FIJI è solo ImageJ</td><td>FIJI.sc</td><td>versione 1.51</td><td></td></tr><tr><td>Oro Quantifoil, Carbonio amorfo Griglie TEM Plano</td><td>GmbH</td><td>S173-8</td><td>R 2/2 Au 300 mesh</td></tr><tr><td>HAuCl4 &middot; 3 H2O cristallo</td><td>Alfa Aesar</td><td>36400.06</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Project Jupyter</td><td>Versione 5.7.2</td><td></td></tr><tr><td>Matplotlib-Package</td><td>John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom e il team di sviluppo di Matplotlib</td><td>Versione 3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>NumPy-Package</td><td>Sviluppatori NumPy</td><td>Versione 1.15.4</td><td></td></tr><tr><td>Pandas-Package</td><td>AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. e PyData Development Team</td><td>Versione 0.23.4</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python Software Foundation</td><td>Versione 3.7</td><td></td></tr><tr><td>Scipy-Package</td><td>SciPy developers</td><td>Versione 1.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Seaborn-Package</td><td>Michael Waskom</td><td>Versione 0.9.0</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Siegert Wafer GmbH</td><td></td><td>Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 &; m, 4", tipo p, drogato con boro (1-30 Ohm cm), lucidato su entrambi i lati</td></tr><tr><td>a inclinazione singola Supporto TEM</td><td>Philips</td><td></td><td>Assicurarsi che la cella si adatti</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Philips</td><td>CM 30 (S)TEM</td><td>300 kV</td></tr><tr><td>Grafene a trasferimento banale</td> Materiale <td>ACS</td><td>TTG60011</td><td>rivestito in PMMA, 6 -- 8 ML</td></tr></tbody></table>

preparazione di cellule liquide microwell supportate al grafene per la microscopia elettronica di trasmissione in situ

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

La fabbricazione e la preparazione di cellule liquide microwell (GSMLC) supportate dal grafene per la microscopia elettronica in situ è presentata in un protocollo graduale. La versatilità dei GSMLC è dimostrata nel contesto di uno studio sulle dinamiche di incisione e crescita delle nanostrutture d'oro da una soluzione precursore di HAuCl 4. I GSMLC combinano i vantaggi delle cellule liquide convenzionali a base di silicio e grafene offrendo profondità di pozzi riproducibili insieme alla facile produzione di cellule e alla manipolazione del campione in esame. I GSMLC sono fabbricati su un singolo substrato di silicio che riduce drasticamente la complessità del processo di produzione rispetto ai progetti di cellule liquide a base di due wafer. In questo caso, non sono necessarie fasi di incollaggio o di allineamento. Inoltre, il volume del liquido chiuso può essere adattato alle rispettive esigenze sperimentali semplicemente regolando lo spessore di uno strato di nitrato di silicio. Ciò consente una significativa riduzione del rigonfiamento della finestra nel vuoto del microscopio elettronico. Infine, viene presentata una valutazione quantitativa all'avanguardia del tracciamento di singole particelle e della formazione di dendriti negli esperimenti a cellule liquide utilizzando solo software open source.

Dopo il caricamento della cellula, un trasferimento di grafene di successo è indicato da un aspetto diverso ombreggiato sui pozzi sotto un microscopio ottico. Questo è visibile, ad esempio, nella membrana destra di Figura 3c. Come accennato, è fondamentale rimuovere con attenzione la griglia TEM per non rompere il sottile strato Si3N4. Nel caso di una membrana rotta, residui lucint e curvi sono chiaramente visibili nel microscopio ottico, come mostrato nelle due membrane a sinistra della figura 3c. A causa delle molteplici aree di visualizzazione nel design GSMLC utilizzato, la cella può essere utilizzata fintanto che almeno una membrana è intatta. Le membrane rotte possono essere utilizzate per l'allineamento TEM senza esporre il campione al fascio di elettroni.
Un incapsulamento riuscito della soluzione del campione può essere verificato durante la microscopia elettronica. La figura 5 presenta singole micrografie di Supplementary Video 1, dove la dissoluzione di un insieme di nanoparticelle e la crescita di una struttura dendritica sono valutate statisticamente in un GSMLC. Oltre al movimento indotto dalla deriva dell'immagine, sono visibili movimenti di particelle ortogonali individuali minori, che indicano che le particelle in soluzione sono presenti. Inoltre, la prevalenza della dissoluzione delle particelle dimostra che è presente una reazione bagnato-chimica che non sarebbe possibile senza un liquido di successo che racchiude. Altre indicazioni tipiche per i liquidi chiusi sono la formazione di bolle indotta dal fascio19 o il movimento delle particelle. La presenza di particelle Au nelle sole cellule con funzionalità di grafene non indica in modo conclusivo un ambiente liquido, poiché le particelle potrebbero derivare anche dalla riduzione indotta dal grafene di HAuCl440. Una quantificazione dei picchi di ossigeno del liquido chiuso tramite spettroscopia di perdita di energia elettronica (EELS) può anche essere eseguita per verificare un ambiente liquido41.
Al fine di ottenere informazioni sulla crescita delle particelle e sulla cinetica di dissoluzione, è importante studiare ogni particella individualmente piuttosto che analizzare lo sviluppo dei parametri medi42. È inoltre fondamentale escludere le particelle ai bordi del telaio che vengono catturate solo parzialmente dalla fotocamera perché i cambiamenti di posizione correlati all'effetto di deriva di tali particelle potrebbero essere scambiati come processi di crescita o dissoluzione. Si ritiene che l'incisione sia causata da specie ossidative generate dalla radiolisi indotta dal fascio di elettroni43. Per produrre statistiche sufficienti, è necessario il tracciamento computazionale di singole particelle. Stimando l'esponente di crescita della variazione del raggio equivalente delle singole particelle nel tempo, è possibile ottenere informazioni sulla cinetica della reazione sottostante. Per farlo, è possibile introdurre un raggio equivalente basato sull'area delle particelle proiettate, anche se non tutte le particelle sono completamente sferiche6,44. La figura 5b mostra il tracciamento dei raggi equivalenti nel tempo per sei particelle rappresentative evidenziate nella figura 5a. La figura 5c mostra la distribuzione di 73 particelle che si dissolvono dal presente studio. Vengono considerate solo le particelle in cui un modello allometrico spiega che il raggio diminuisce ad almeno il 50% (coefficiente di determinazione rettificato).
Inoltre, una struttura dendrite emerge rapidamente dopo circa 42 s nello stesso pozzo raffigurato figura 6a. La formazione di dendrite è un altro tipico processo ben documentato nelle cellule liquide45,46. Per quantificare la crescita dei dendrite, vengono analizzati i contorni strutturali (vedere insetto nella figura 6a). L'evoluzione del raggio della punta e della velocità nel tempo (vedere La figura 6b,c) rivela la relazione iperbolica prevista47 (Figura 6d). La crescita della dendrite è causata dalla supersaturazione locale degli Au-ioni a causa della suddetta incisione delle particelle. Nella figura 5a,è chiaramente visibile che le particelle si stanno ancora sciogliendo mentre il sistema sovrasaturato si rilassa in crescita dendrite. Ciò può essere causato da variazioni di concentrazione locale sia negli Au-ioni che nelle specie ossidative a causa dell'elevata viscosità del liquido nel GSMLC che è stato osservato prima di6. Una discussione dettagliata di questo fenomeno, tuttavia, esula dall'ambito di questo lavoro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig1.jpg"> Figura 1: Schizzo di un GSMLC: schemi della struttura di una cellula liquida a microwellsupportata dal grafene. Ristampato da https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Ulteriori autorizzazioni devono essere indirizzate all'American Chemical Society (ACS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig2.jpg"> Figura 2: Fabbricazione di telai GSMLC. Il processo di fabbricazione dei fotogrammi GSMLC è schematicomente disegnato. (a) Ossidazione di Si wafer dopo la pulizia. (b) LPCVD di Si3N4. (c) Il lato anteriore Si3N4 patterning per fotolitografia e RIE per definire il volume della cella. (d) Deposizione di Si3N4 per formare la finestra della cella inferiore. (e) Litografia sul retro e RIE. (f) Microlavorazione sfusa con KOH per creare una membrana Indipendente Si3N4 contenente micropozzi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig3.jpg"> Figura 3: Trasferimento di CVD-grafene a pochi strati con strato di protezione PMMA su una griglia TEM. Viene visualizzato il trasferimento del bit-layer di CVD-grafene sul PMMA sulla parte superiore di una griglia TEM rivestita in carbonio holey. (a) Immersione del grafene CVD a pochi strati sulla PMMA in un piatto Petri pieno di acqua DI. (b) La pila di grafene/PMMA trasferita su una carta da filtro viene tagliata in pezzi adatti a coprire i fotogrammi GSMLC. (c) Ri-immersione di un pezzo di grafene/PMMA tagliato. (d) Trasferimento dello strato di grafene/PMMA su una pila TEM rivestita in carbonio (e) grafene/PMMA dopo un trasferimento riuscito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig4.jpg"> Figura 4: Rimozione della griglia TEM superiore. Il processo di essiccazione di un GSMLC caricato è documentato con l'aiuto di un microscopio ottico. (a) Una griglia TEM rivestita di grafene viene posizionata sopra il GSMLC direttamente dopo il caricamento. Lo strato di grafene è visibile come rettangolo turchese che copre tutte e tre le aree di visualizzazione. I suoi contorni sono approssimativamente disegnati dal rettangolo nero. (b) Una membrana quasi completamente aderente è visibile dal cambiamento di contrasto tra il bagnato (scuro, confronto con (a)) e l'area aderente (turchese) dopo circa due minuti. (c) Viene mostrato un GSMLC dopo il decollo della griglia TEM, che rivela due membrane rotte (sinistra e centrale) e una membrana con micropozzi caricati e sigillati con successo (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2.jpg"> Figura 5: Sviluppo rappresentativo dei raggi delle nanoparticelle. È stato tracciato lo sviluppo del raggio di 183 singole particelle. (a) Sequenza di immagini tratte dal Video supplementare 1. Vengono evidenziate sei particelle rappresentative. I cerchi colorati corrispondono al raggio equivalente ottenuto. (b) Trama logaritmica dei raggi delle particelle. (c) L'istogramma di 73 particelle in cui è stato determinato un esponente allometrico negativo utilizzando una routine automatizzata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig6.jpg"> Figura 6: Dinamica Dendrite: il raggio della punta di cinque rami dendriti viene analizzato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard rispettiva. (a) Sequenza di immagini tratta da Supplementary Video 1 che mostra il dendrite emergente, che è visibile dopo circa 42 s. L'insetto nell'immagine a destra mostra i contorni dendriti in evoluzione. Qui, i contorni rosa corrispondono a 42,09 s, rosso a 42,7 s, e viola a 43,3 s. (b) Sviluppo del raggio (medio) punta nel tempo. (c) La velocità della punta media tracciata nel tempo. (d) Il raggio medio della punta logaritmicamente tracciato rispetto alla velocità media della punta, rivelando una dipendenza iperbolica (curva arancione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig7.jpg"> Figura 7: SEM Immagine di un GSMLC caricato: viene visualizzata un'immagine SEM rappresentativa acquisita in modalità HAADF STEM in un SEM di un GSMLC caricato a bassa tensione di accelerazione (29 kV). Oltre ai prominenti micropozzi larghi 5 m, sono visibili due griglie circolari di carbonio a cane bizna parzialmente sovrapposte (diametro di 2 m) derivanti dal trasferimento di grafene chiarito sopra. La prima rete di carbonio deriva da un trasferimento di grafene fallito. È chiaramente visibile che l'ombreggiatura della membrana rimane per lo più costante sopra la regione del pozzo, ma si scurisce leggermente verso il centro del pozzo. Ciò spiega un rigonfiamento debole e negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video supplementare 1: Video in situ che mostra i risultati rappresentativi di uno studio TEM a campo luminoso a cellule liquide sull'incisione di nanoparticelle Au e sulla successiva crescita di una struttura dendrite causata dalla supersaturazione della soluzione campionessa circostante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/Supplementary_Video_1.avi">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Viene presentato un protocollo per la preparazione di cellule liquide di microwell supportate dal grafene per la microscopia elettronica in situ di nanocristalli d'oro dalla soluzione precursore di HAuCl4. Inoltre, viene presentata una routine di analisi per quantificare le dinamiche di incisione e crescita osservate.

Preparazione di cellule liquide microwell supportate al grafene per la microscopia elettronica di trasmissione in situ

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...

La microscopia elettronica a celle liquide è una tecnica potente per studiare le nano caratteristiche in C2 nei mezzi liquidi ad alta risoluzione e fornisce informazioni uniche e in tempo reale sui processi dinamici su scala nanometrica. La cella liquida microwell supportata dal grafene combina i vantaggi delle architetture cellulari basate sul grafene e sulla tecnologia del silicio. Consente la correlazione con metodi analitici, come la spettroscopia EDX, a vista.La tecnica ci consente di seguire direttamente i processi di un materiale nei liquidi, mentre si verificano. Questa osservazione in situ è al centro del nostro gruppo di formazione alla ricerca. Microscopia in situ con elettroni, raggi X e sonde di scansione finanziate dalla Fondazione tedesca per la ricerca.A dimostrare la procedura sarà Diplom-Chemist, Robert Branscheid, un membro dello staff del mio laboratorio. Per iniziare, trasferire il grafene sulle griglie TEM, bagnando prima il tessuto che supporta i sei-otto strati di grafene CVD su PMMA. Fare attenzione che l'acqua non sia applicata direttamente alla membrana PMMA.Immergere completamente il grafene rivestito di PMMA in una piastra di Petri piena di acqua DI, quindi utilizzare carta da filtro per raccogliere lo strato di grafene. Fare attenzione che il lato grafene della pila pmma di grafene rimanga in cima durante l'intera procedura. Tagliare lo strato di grafene in pezzi abbastanza grandi da coprire tutti i pozzi fabbricati.Quindi, immergere di nuovo i pezzi tagliati nella piastra di Petri. Successivamente, utilizzando un paio di pinzette anti-capillari, raccogliere una griglia TEM rivestita con uno strato di supporto di holey-carbon. Immergere con cura la griglia nell'acqua e catturare il grafene che galleggia sulla superficie.Lasciare asciugare le lenzuola per alcune ore. Quindi, rimuovere lo strato di protezione PMMA trasfererlo in un bagno di acetone per 30 minuti. Dopo il bagno di acetone, immergere immediatamente il campione in etanolo e acqua DI senza essiccare il campione tra una soluzione e l'altro.Utilizzare un recipiente piatto per rimuovere facilmente il campione in seguito. Al termine, rimuovere il campione dall'acqua DI e asciugarlo in seguito per 30 minuti in condizioni ambientali. Creare un modello di cella liquida con microlici a microcorrementi mediante la ricerca nel protocollo di testo.Risciacquare il modello di cella liquida fabbricato con acetone, seguito da etanolo. Quindi, applicare un plasma ambientale 20% ossigeno, 80% azoto per cinque minuti per migliorare la wettability della membrana. Distribuire 0,5 microlitri della soluzione campione sul modello o sullo strato di grafene.Garantire una procedura di lavoro fluida per ridurre al minimo i cambiamenti di concentrazione dovuti all'evaporazione. Quindi, posizionare la griglia TEM sullo strato di nitruro di silicio micro-modellato con il grafene rivolto verso il modello. Premere con cura la griglia TEM rivestita di grafene sul modello, assicurandosi di non distruggere la membrana inferiore in nitruro di silicio.Rimuovere la soluzione in eccesso con un tessuto per accelerare l'essiccazione cellulare e mitigare i cambiamenti di concentrazione. Dopo circa due o tre minuti, osserva un cambiamento di contrasto mentre le interazioni con il nitruro di silicio di grafene Van der Waals sigillano la cellula liquida. Quindi, posizionare il campione al microscopio ottico.Utilizzare un paio di pinzette per rimuovere con cura la griglia TEM spingendo la punta tra la griglia e il telaio a celle liquide a microwell supportato dal grafene. Per ridurre i danni da forza pura, inizia dal sito della griglia parallelo al bordo della finestra più piccolo. Assicurarsi che almeno una membrana delle celle liquide a microwell supportate dal grafene sia ancora intatta.Utilizzando un supporto TEM standard, caricare il campione nel supporto. Subito dopo la sua preparazione, caricare il supporto e il campione nel microscopio elettronico a trasmissione a scansione. Immagini il campione in modo appropriato per quanto riguarda sia le caratteristiche del campione che del microscopio.Utilizzare una dose bassa per ridurre al minimo l'artefatto pre-indotto e un breve tempo di esposizione per evitare sfocatura legata al movimento. Per esperimenti a lungo termine, bloccare il fascio per ridurre i danni da radiazioni. Dopo aver acquisito le immagini, utilizzare una piattaforma di elaborazione delle immagini adatta per estrarre le funzionalità di interesse.Per il tracciamento e l'analisi delle particelle, usa la distribuzione Open Source ImageJ, Fiji. Dopo aver caricato un'immagine e averla convertita in un'immagine binaria, utilizzare la funzione analyze particles per ottenere informazioni precise sull'area proiettata e sul barycenter della particella per ogni particella in ogni fotogramma. Invertire l'immagine originale in modo che le particelle appaiano come punti luminosi.Quindi, collega le particelle tra i fotogrammi con l'aiuto del plugin TrackMate. Per impostazione predefinita, TrackMate cerca particelle luminose su uno sfondo scuro. Infine, combina i risultati di TrackMate e analizza le particelle con uno script adatto, utilizzando l'ecosistema open source basato su Python, SciPy.Un incapsulamento riuscito della soluzione del campione può essere verificato durante la microscopia elettronica. Questo video mostra la dissoluzione di un insieme di nanoparticelle e la crescita di una struttura dendritica. Al fine di ottenere informazioni sulla crescita delle particelle e sulla cinetica di dissoluzione, è importante indagare ogni particella individualmente, piuttosto che analizzare lo sviluppo di parametri medi.Stimando l'esponente di crescita, alfa, della variazione di raggio equivalente delle singole particelle nel tempo, è possibile ottenere informazioni sulla cinetica di reazione sottostante. Qui viene visualizzata la distribuzione dell'alfa, basata su 73 particelle dissoluzione. Sono considerate solo le particelle in cui un modello allometrico spiega il declino del raggio ad almeno il 50%.Alla fine del video, emerge una struttura dendrite. La formazione di dendrite è un altro processo tipico e ben documentato nelle cellule liquide. Per quantificare la crescita dei dendrite, vengono analizzati i contorni strutturali.L'evoluzione del raggio della punta e della velocità nel tempo rivela la relazione iperbolica attesa. La crescita della dendrite è causata dalla super saturazione locale degli ioni d'oro a causa della suddetta incisione delle particelle. In questa parte del video, è chiaramente visibile che le particelle si stanno ancora dissolvendo, mentre il sistema sovrasaturato si rilassa nella crescita della dendrite.Ciò può essere causato da variazioni di concentrazione locali sia negli ioni dorati che nelle specie ossidativi. Il carico liquido e il suhrf dipendono fortemente dal campione di interesse perché l'adesione al grafene e i tempi di essiccazione richiesti possono variare se vengono applicate diverse soluzioni di campione. L'architettura a celle liquide a microwell supportata dal grafene consente anche metodi in situ complementari come le rese in EDSX.Inoltre, sem in modalità di trasmissione e gli esperimenti di tomografia sono stati eseguiti con successo. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, divenne possibile svelare il meccanismo di crescita di oro, argento, kawsh-en e altre particelle fino alla risoluzione atomica. I risultati sono un ottimo accordo con le misurazioni della risonanza plasmatica acquisite dai nostri colleghi del dipartimento di fisica che partecipano anche al gruppo di formazione alla ricerca.Sebbene non sia mostrata qui, la produzione di telaio portante impiega specie corrosive e tossiche. Si prega di fare attenzione durante il funzionamento e prendere le precauzioni richieste.

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