Name: Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Impara l'immunolabelling di mitragliari necrotici nelle biopsie muscolari utilizzando topi mdx. Questa tecnica con uptake di IgG identifica cellule necrotiche e migliora la comprensione della degenerazione muscolare nei disturbi neuromuscolari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Associazione Francese contre les Myopatie con il programma Translamuscle. Gli autori ringraziano il Dr. Perla Reyes-Fernandez e il Dr. Matthew Borok per la loro attenta lettura del manoscritto.

Gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la legislazione francese e comunitaria (numero di licenza 11-00010).
1. Preparazione della gomma tragacanth
<ol><li>In un bicchiere di vetro, sciogliere 6 g di polvere di tragacanto in 100 mL di acqua deionizzata. Coprire con un foglio e lasciare per almeno 3 h. Occasionalmente mescolare manualmente con una spatola metallica come la miscela diventa rapidamente viscoso.</li>
	<li>Lasciare la miscela di tragacanto a 60 gradi durante la notte in un bagno d'acqua o in forno. Sigillare con cura il becher per evitare l'essiccazione. Mescolare almeno una volta prima dell'aliquota.</li>
	<li>Aliquota e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.</li>
</ol>2. Collezione muscolare
NOTA: Per questo esperimento, un topo mdx maschio di 4 settimane è stato sacrificato dalla lussazione cervicale. Questa procedura non richiede anestesia ed è un metodo di uccisione umano in conformità con la legislazione locale.
<ol><li>Dissezione del muscolo tibiale anteriore (TA)<ol>
<li>Dopo aver rasato la gamba del topo, posare il mouse sulla schiena e pin i piedi su una tavola di sughero con aghi. Utilizzando forbici di precisione (o bisturi) e pinze, rimuovere la pelle della gamba dal piede fino al ginocchio per esporre l'intera lunghezza della tibia e TA.</li>
		<li>Con le forbici, fare un'incisione tra la tibia e TA. Questo faciliterà la separazione della TA dall'osso e fornirà una facile presa all'epimysio. Utilizzando pinze di precisione, rimuovere con attenzione lo strato di epimysio dalla superficie dell'TA. NOTA: Da questo passaggio, il TA può essere più suscettibile all'essiccazione, che dovrebbe essere evitato.</li>
		<li>Nella regione della caviglia, isolare il tendine TA da altri tendini con pinze. Tirare delicatamente il tendine TA per isolarlo dalla tibia e dai muscoli circostanti.</li>
		<li>Quando il ventre TA è completamente separato, tenere il tendine in modo che solo la parte prossimale del muscolo TA è attaccata al ginocchio. Recidere delicatamente il tendine prossimale il più vicino possibile all'osso del ginocchio.</li>
		<li>Mettere la TA in una garza leggermente smorzata con salina per evitare l'essiccazione prima di congelare il muscolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-raffreddare 70-100 mL di isopentane in un becher di plastica o politetrafluoroetilene immergendolo parzialmente in azoto liquido. Lasciare raffreddare fino a quando l'isopentane nella parte inferiore del becher diventa un solido bianco.</li>
	<li>Su un pezzo circolare di sughero (20 mm x 11 mm x 8 mm), posizionare 0,5 mL di gomma tragacanth. Preetichettare attentamente l'altro lato del sughero in modo che la biopsia possa essere identificata correttamente dopo la fase di congelamento.</li>
	<li>Incorporare la TA nella gomma con pinze, tendine distale. Per consentire sezioni trasversali appropriate del muscolo, tenere il muscolo con il suo asse perpendicolare alla superficie del sughero. La qualità delle criosezioni migliorerà se la biopsia non è completamente incorporata nella gomma. Lasciare che almeno la metà della TA (lato del tendine) sia scoperta dalla gomma.</li>
	<li>Immergere rapidamente il tappo con il muscolo incorporato nello strato non congelato e freddo èopentane. Si noti che il tappo galleggia nel liquido èopentane. Tenere il campione a testa in giù come il muscolo deve essere immerso in isopentane. Lasciare i campioni nell'isopentane per circa 2 min per consentire il congelamento completo. NOTA: Da questa fase, la TA deve rimanere congelata fino alla criosezione. Conservare il muscolo nel ghiaccio secco prima di essere conservato a lungo termine in un congelatore a -80 gradi centigradi.</li>
</ol>3. Criosezione
<ol><li>Impostare la temperatura criostat a -25 gradi centigradi. Mantenere la temperatura dell'oggetto a circa -20 gradi centigradi. Fissare l'oggetto nel criostato utilizzando il composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). Tagliare il muscolo fino a raggiungere la pancia muscolare, quindi tagliare le sezioni di 7,10 m. NOTA: la stabilizzazione della temperatura dell'oggetto richiede almeno 10 min.</li>
	<li>Conservare i vetrini di vetro utilizzati per la raccolta di criosezioni a temperatura ambiente (RT). Raccogliere almeno due sezioni su ogni diapositiva. Le sezioni muscolari si attaccano e si scongelano automaticamente al contatto dello scivolo di vetro caldo. Rimuovere la diapositiva e tenerla a RT.</li>
	<li>Lasciare asciugare le sezioni almeno 20 min a RT in un ambiente ventilato.</li>
	<li>Conservare le criosezioni su vetrini di vetro a -80 gradi centigradi fino all'uso.</li>
</ol>4. Immunolabelling
<ol><li>Scongelare i vetrini a RT per almeno 15 min in un ambiente ventilato.</li>
	<li>Delineare l'area delle sezioni con una penna idrofobica. Lasciare asciugare la barriera idrofobica.</li>
	<li>Fissare il tessuto con 2% paraformaldeide per 10 min in una camera umida.</li>
	<li>Lavare le sezioni con fosfato tampone salina (PBS) 2x per 5 min ciascuno.</li>
	<li>Bloccare le sezioni muscolari con il siero di capra del 10% diluito in PBS per 1 h a RT in una camera umida.</li>
	<li>Incubare le sezioni per 2 h a RT (o pernottamento a 4 gradi centigradi) in una camera umida con gli anticorpi primari diluiti nel 5% del siero di capra. Per una semplice etichettatura di assorbimento IgG in miofibre, incuba solo sezioni con anticorpo di coniglio per la pan-lamininina del topo. NOTA: Altri antigeni della matrice extracellulare possono essere mirati purché forniscano una chiara etichettatura della matrice extracellulare circostante delle mionine. I marcatori per la rigenerazione muscolare, l'infiammazione o altri parametri possono essere combinati finché gli anticorpi non sono sollevati in un ospite di topi. Il microscopio utilizzato per l'analisi deve includere un colore di fluorescenza supplementare.</li>
	<li>Lavare le sezioni con PBS 3x per 5 min ciascuna.</li>
	<li>Incubare le sezioni con anticorpo secondario policlonale capra fluorescente rosso al coniglio IgG H&L e all'anticorpo secondario policlonale fluorescente verde per topo IgG H&L. Incubare a RT per 45 min in una camera umida.</li>
	<li>Lavare con PBS 3x per 10 min ciascuno.</li>
	<li>Montare le sezioni in un supporto di montaggio fluorescente contenente 100 ng/mL 4,6-diamidino-2-fenilondole (DAPI) e coprire ogni vetrino con un coverslip.</li>
	<li>Lasciare asciugare durante la notte a 4 gradi centigradi prima dell'imaging.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li>
<li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases%3A+cytochemical+and+immunocytochemical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differerentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655(2018).</li>
<li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li>
<li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li>
<li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li>
<li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+blood-brain+barrier+integrity%3A+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives%3F+Frontiers+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%229%22%5BJournal%5D)">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+%28mdx%29+and+normal+muscle+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li>
<li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La necrosi della miofibra è una conseguenza comune dell'esercizio traumatico nei muscoli normali. È ben compensato da una potente capacità rigenerativa dei progenitori muscolari locali. Tuttavia, in diverse condizioni muscolari come nelle MD, la capacità rigenerativa delle cellule satellitari è compromessa dalla miocrosi cronica e dall'eccessiva fibrosi. Recenti scoperte mostrano che le fibre muscolari possono morire per necroptosi, una forma regolamentata di necrosi. Più specificamente, l'inibizione della necroptosi può...

Il muscolo scheletrico è costituito principalmente da fibre muscolari (miofibre), responsabili della caratteristica funzione contrattuale volontaria. Queste cellule sono multinucleate, strutture post-mitotiche che supportano lo stress meccanico che si verificano durante la contrazione. La stabilità strutturale della membrana della miofibra (sarcolemma) e della sua matrice extracellulare sono cruciali per l'omeostasi dei tessuti. Le cellule satellitari costituiscono la principale popolazione progenitrice muscolare nel muscolo scheletrico maturo ed esistono in uno stato quiescente nei muscoli sani. Dopo la morte della miofibra, la rigenerazione muscolare è supportata da cellule satellitari a seguito di un programma miogenico che prevede l'attivazione, la proliferazione, la differenziazione e la fusione delle cellule satellitari per formare in ultima analisi nuove miofibre multinucleate.
La scomparsa della mionina può verificarsi in più condizioni muscolari, tra cui traumi meccanici, lesioni da ischemia-reperfusione, o distrofie muscolari, ed è associata alla morfologia necrotica delle cellule morte1,2. La morte necrotica è caratterizzata dalla rapida permeabilità della membrana plasmatica e dal rilascio del contenuto cellulare nel compartimento extracellulare3. Può derivare da un processo non regolamentato che non comporta una corretta segnalazione cellulare (cioè necrosi accidentale) o da un percorso intracellulare orchestrato (cioè necrosi regolamentata). Nelle miofibre, sia regolato4 e non regolamentato5 processi possono portare alla necrosi. Una conseguenza tipica della miocrosi è il rilascio di modelli molecolari associati ai danni, attivando una potente risposta infiammatoria6. La presenza di macrofagi è osservata a circa 48 h e 72 h a seguito della lesione7. Oltre al loro ruolo nella distanza dei detriti necrotici, sono importanti anche nella rigenerazione muscolare8,9.
Le distrofie muscolari (MD) sono un gruppo eterogeneo di patologie che spesso derivano da un difetto nella struttura del sarcolemma. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia giovanile legata all'X che colpisce circa 1 su ogni 3.500 nascite maschiliintutto il mondo, ed è causata dall'assenza di espressione distrofina al sarcolemma. La degenerazione cronica del tessuto muscolare nei ragazzi della DMD porta a una debolezza muscolare estrema e alla mortalità precoce. L'infiammazione derivante dalla morte necrotica migliora la citotossicità e favorisce la fibrosi muscolare e la perdita della funzione muscolare11,12. Si prevede che i trattamenti attualmente in sperimentazione clinica che colpiscono le radici dei disturbi degenerativi muscolari, come la terapia genica, alleviano la mioonecrosi. Sono quindi necessarie tecniche semplici per quantificare con precisione la degenerazione muscolare.
Diversi metodi sono regolarmente utilizzati per monitorare la perdita di miofibra in vivo. La misurazione dell'attività enzimatica della creatina chinasi (CK) nel sangue consente una quantificazione affidabile della necrosi in corso nei tessuti muscolari e cardiaci. In situ, la colorazione ematossia e eosina (H&E) è il metodo più popolare attualmente utilizzato nella diagnosi per valutare il rimodellamento della rigenerazione degenerazione. Tuttavia, la base molecolare dell'etichettatura H&E delle cellule morte rimane poco chiara. Inoltre, le modifiche del colore che suggeriscono la morte della miofibra nella colorazione H&E sono relativamente sottili e non facilitano la quantificazione affidabile e riproducibile. Metodi che rivelano la frammentazione del DNA, come il transfersasi dUTP nick end labelling (TUNEL) del deossinucleotidicolo terminale, la morte necroticaimperfetta 3. Sono anche scarsamente adattati per monitorare la morte di cellule sinciziali come le miofibre. L'iniezione di coloranti vitali, come la tinta blu di Evan (EBD), rappresenta un'utile alternativa per valutare le miofibre che hanno perso l'integrità del sarcolemma, ma non è necessariamente conveniente in alcuni protocolli sperimentali. Ad esempio, la presenza di EBD nei campioni di sangue può influenzare i risultati delle misurazioni CK, un test colorimetrico. Inoltre, l'assorbimento intracellulare di EBD rende difficile la co-immunolabelling. Pertanto, un metodo alternativo che consente l'etichettatura diretta delle miofibre sottoposte a necrosi è di interesse.
Il meccanismo d'azione dei coloranti vitali si basa sulla perdita dell'integrità della membrana plasmatica nelle mitraglie necrotiche e sull'assorbimento passivo del coloranti iniettato. Allo stesso modo, le miofibre necrotiche assorbono proteine del sangue come l'albumina, per le quali EBD ha una forte affinità13,14, immunoglobuina G (IgG) e IgM15. La presenza anomala di proteine ematiche all'interno delle miofibre rappresenta quindi marcatori convenienti per la mionecrosi in situ. Colorare queste proteine può essere un'alternativa per l'uso di coloranti vitali.
Utilizzando l'assorbimento di IgG come marcatore della miocrosi in situ, questo protocollo viene utilizzato per valutare la degenerazione muscolare nel tibialis anteriore (TA) di topi mdx distrophin-carenti. Questo metodo presenta vantaggi significativi rispetto alle tecniche alternative: 1) è riproducibile e semplice nella sua esecuzione; 2) non richiede alcun trattamento animale prima della raccolta muscolare, come l'iniezione di coloranti vitali circolanti, e 3) come qualsiasi immunoetichettatura convenzionale, è compatibile con la co-etichettatura.

<table><tbody><tr><td>Dischi circolari di sughero</td><td>Pyramid Innovation</td><td>R30001-E</td><td>Non dimenticare di etichettare chiaramente il tappo in modo che l'ID del campione possa essere determinato dopo il congelamento</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050 sn34</td><td>La criosezione muscolare deve essere eseguita tra -20 e -25 °C. Spessore: 7-10 micrometri.</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Una barriera idrofobica intorno alle sezioni muscolari. Previene la dispersione del terreno durante l'incubazione</td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>FST</td><td>91117-10</td><td>/</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor Plus 488</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11029</td><td>Diluizione: 1/500</td></tr><tr><td>anticorpo IgG (H+L) anti-capra di capra Alexa Fluor Plus 594</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A32740</td><td>Diluizione: 1/500</td></tr><tr><td>siero di capra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td>Nella fase di blocco, utilizzare una diluizione del 10% in PBS. Per l'incubazione degli anticorpi, utilizzare una diluizione al 5% nel</td></tr><tr>mezzo di congelamento PBS<td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78-78-4</td>.<td> Deve essere raffreddato in un becher posto in azoto liquido.</td></tr><tr>I topi <td>mdx mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td><td>Mdx sono mutati per il gene della distrofina. A partire dalle tre settimane di età, i muscoli sono caratterizzati da degenerazione cronica</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D1</td><td>/</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Cellpath</td><td>KMA-0100-00A</td><td>Matrice di inclusione</td></tr><tr><td>PFA (Paraformaldeide)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28908</td><td>Utilizzato per il fissaggio della criosezione (è possibile utilizzare PFA al 2% o al 4%)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Eurobio</td><td>CS3PBS00-01</td><td>Terreno di diluizione per immunomarcatura</td></tr><tr><td>Forbice di precisione</td><td>FST</td><td>fst 14001-12 e fst 14001-14</td><td>Utilizzato per la raccolta muscolare</td></tr><tr><td>Anticorpo di coniglio contro il topo pan-Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td>Diluizione: 1/1000</td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1128</td><td>Aliquote da mantenere a +4&deg; E</td></tr></tbody></table>

immunolabelling degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

La necrosi delle fibre muscolari (mionecrosi) svolge un ruolo centrale nella patogenesi di diverse condizioni muscolari, tra cui le distrofie muscolari. Le opzioni terapeutiche che affrontano le cause della patogenesi della distrofia muscolare dovrebbero alleviare la degenerazione muscolare. Pertanto, è necessario un metodo per testare e quantificare l'estensione della morte cellulare nelle biopsie muscolari. I metodi convenzionali per osservare la degenerazione della miofibra in situ sono scarsamente quantitativi o si basano sull'iniezione di coloranti vitali. In questo articolo, viene descritto un protocollo di immunofluorescenza che macchia le miofibre necrotiche prendendo di mira l'assorbimento dell'immunoglobulina G (IgG) da parte delle miofibre. Il metodo di assorbimento IgG si basa su caratteristiche cellulari che caratterizzano la scomparsa necrotica, tra cui 1) la perdita di integrità della membrana plasmatica con il rilascio di modelli molecolari associati ai danni e 2) l'assorbimento di proteine plasmatiche. Nelle sezioni trasversali murine, la co-immunolabelling di miofibre, proteine a matrice extracellulare e IgG di topo consente un'identificazione pulita e diretta delle miofibre con il destino necrotico. Questo semplice metodo è adatto per l'analisi quantitativa e applicabile a tutte le specie, compresi i campioni umani, e non richiede l'iniezione di tinri vitali. La colorazione delle miofibre necrotiche da parte dell'assorbimento DiGG può anche essere abbinata ad altre co-immunolabelling.

Le miofibre sono circondate da una matrice extracellulare contenente laminina. La colorazione rossa delimita la periferia delle miofibre e ne consente l'identificazione. IgG è mostrato in verde. I nuclei sono macchiati con DAPI e si trovano blu al microscopio. Tuttavia, i nuclei sono mostrati in bianco qui (Figura 1). Una debole immunoreattività IgG è prevista nel compartimento extracellulare, che può essere aumentata in caso di infiammazione. La colorazione ...

Descritto qui è un protocollo per l'immunolabelling diretto delle minofibre necrotiche nelle criosezioni muscolari. Le cellule necrotiche sono permeabili alle proteine del siero, tra cui l'immunoglobulina G (IgG). Rivelare l'assorbimento di IgG da miofibre permette l'identificazione e la quantificazione delle miofibre che subiscono necrosi indipendentemente dalla condizione muscolare.

Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

La necrosi del miofibra è caratteristica di molteplici disturbi neuromuscolari e svolge un ruolo centrale nella patogenesi. Un metodo specifico e affidabile per valutare la degenerazione muscolare è importante per la diagnosi e la ricerca traslizionale. Questa tecnica estremamente adattabile consente l'etichettatura di più antigeni contemporaneamente nella stessa sezione all'interno di quella miofibra.È possibile con coloranti vitali. La colorazione H&E è un metodo empirico che non è adattabile per coniugazione affidabile e riproducibile. La colorazione di assorbimento IgG, tuttavia, è specifica per le cellule muscolari necrotiche e applicabile alle biopsie umane.Questa tecnica può fornire informazioni su tutti i disturbi neuromuscolari caratterizzati da miocrosi. Dopo aver rimosso i capelli dalla gamba di interesse, posizionare l'animale mdx maschio di quattro settimane in posizione supina e fissare le zampe a una tavola da sughero. Utilizzando forbici o forcep di precisione rimuovere la pelle della gamba dal piede al ginocchio per esporre l'intera lunghezza della tibia e del tibiale anteriore.Usa le forbici per fare un'incisione tra la tibia e il tibiale anteriore. Utilizzare le

immunolabelling-myofiber-degeneration-in-muscle-biopsies

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold...

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Prove crescenti indicano che l'eccessiva infiltrazione di lipidi all'interno del muscolo scheletrico provoca lipotossicità e diabete. Qui, presentiamo un protocollo completo, che include l'elaborazione dei tessuti, la colorazione con Bodipy, l'acquisizione di immagini e l'analisi, per quantificare le dimensioni, la densità e la distribuzione subcellulare delle goccioline lipidiche in un modo specifico per il tipo di fibra.

Tipo di fibra e analisi subcellulare specifica del contenuto di goccioline lipidiche nel muscolo scheletrico

Questo protocollo descrive l'isolamento delle singole fibre muscolari intate dal soleo ossidativo e l'istituzione di colture mioblastiche altamente purificate derivate da queste fibre. La procedura ottimizzata fornisce in modo affidabile circa 300–500 miofibre intatte per topo, permettendo analisi molecolari e cellulari a valle.

Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre

Praticare delle biopsie fini di aspirazione dell'ago (FNAB) da tirocinanti è relativamente impegnativo, a causa della mancanza di un facilmente disponibile, lesione appropriato. Preparazione di una lesione AV fantasma per praticare la procedura di FNAB e competenza mastering è relativamente facile.

Preparazione e utilizzo lesioni Phantom alla pratica Belle biopsie agoaspirazione

Impara l'immunolabelling di mitragliari necrotici nelle biopsie muscolari utilizzando topi mdx. Questa tecnica con uptake di IgG identifica cellule necrotiche e migliora la comprensione della degenerazione muscolare nei disturbi neuromuscolari.

Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

Esplora altri video