Name: Uso dellelemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Scopri come generare RNA circolari con un sistema di espressione genomica basato su minigeni contenenti elementi Alu. Questo protocollo consente di studiare la funzione e l'associazione con malattie degli RNA circolari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa DoD grant A-180075. Stefan Stamm ringrazia Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin è stata supportata dal DAAD, programma di scambio accademico tedesco, Justin R. Welden ha ricevuto il premio Max Steckler Award dell'Università del Kentucky.

1. Progettazione dei costrutti
<ol><li>Utilizzare il browser genoma UCSC24 per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione circolare di RNA e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i numeri di forza per l'amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi.</li>
	<li>Incollare la sequenza circolare dell'RNA (Supplemental Figure 1 è una sequenza di prova) in <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" target="_blank">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</a> e selezionare l'organismo giusto. Inviare la sequenza e passare alla visualizzazione browser, ridurre 1.5x o, a seconda dei casi (Figura 2A). NOTA: la sequenza di ricerca viene visualizzata nella riga superiore (Figura 2A, 1). A seconda dell'ordine degli esoni nell'RNA circolare, BLAT non collegherà tutti gli esoni. In questo esempio, exon 12 (Figura 2A, 4) non è connesso a 11 ( Figura2A, 2, 3), perché exon 12 è a monte di esone 11 nella sequenza circolare di RNA ( Figurasupplementare 1). Gli elementi ripetitivi si trovano nella traccia "ripeti masker", indicata da scatole, dove il colore nero-grigio indica la conservazione evolutiva (Figura 2A, 5).</li>
	<li>Passare il mouse sugli elementi ripetitivi per identificarne il sottotipo in una finestra mobile. Gli elementi Alu sono nella linea SINE (elemento nucleare breve intervallato). Utilizzare il pulsante 'default tracks' sotto la finestra per reimpostare il browser se si ottiene un'immagine diversa da quella della figura 2. NOTA: il mousingo degli esoni nel display genico genera una finestra con numeri esoni generati al computer. Questi numeri non corrispondono alla numerazione degli esoni stabilita nella letteratura e cambiano anche tra le isoformi.</li>
</ol>2. Selezionare la sequenza da clonare in un vettore di espressione
<ol><li>Scarica la sequenza di DNA mostrata nella finestra andando su Visualizza il DNA sulla linea superiore del browser del genoma UCSC. In Opzione di formattazione sequenza, selezionare Opzioni maiuscole/minuscole estese/colore.</li>
	<li>Selezionare il caso di default come Inferiore e selezionare Attiva/Disattiva caso per riferimento NCBI. Selezionare sottolineato, grassetto e corsivo per Controllo repeat . Fare clic su Invia. Ci saranno esoni come lettere maiuscole e introni come lettere minuscole. Controllare i bordi di eson/intron.</li>
	<li>In questo esempio è presente una sequenza 'ccctttacCTTTT', che indica che il browser mostra il complemento inverso. In questo caso, tornare indietro e selezionare la casella di complemento inverso fino a visualizzare i bordi di exon intron corretto (agEXONgt), in questo esempio AAAAAGgtaaaggg.</li>
	<li>Copiare il file con l'orientamento corretto (gli esoni interni sono circondati da ag... gt) in un documento di elaborazione testi ed evidenziare gli esoni (Figura supplementare 2). NOTA: In questo esempio, il frammento genomico che comprende esoni 9-12 è di circa 24 kb e quindi troppo grande per essere amplificato dal DNA genomico. Pertanto, ogni esonio circondato da circa 1 kb regione intronica è singolarmente amplificato e questi quattro frammenti sono assemblati in un vettore di clonazione.</li>
	<li>Selezionare i frammenti da amplificare (esone - 500 nt intron). Assicurarsi che l'intron non inizi o termini in una regione ripetitiva, poiché i primer di queste regioni non amplificano sequenze specifiche. Le aree selezionate sono illustrate nella Figura 2Be le relative sequenze sono illustrate nella figura supplementare 3. NOTA: In generale, più grandi sono i costrutti, più difficile sarà la clonazione. I frammenti possono essere assemblati sia passo saggio (cioè, esone 9 è combinato con il vettore e nel passo successivo exon 10 viene introdotto in questo costrutto tramite clonazione fino a quando tutti gli esoni sono a posto), o in alternativa, tutti i frammenti vengono assemblati contemporaneamente. Un approccio graduale funziona sempre ma richiede più tempo. Un assemblaggio simultaneo non sempre funziona e dipende da quanto bene i singoli frammenti possono essere amplificati dal DNA genomico e dalle dimensioni complessive del costrutto. Quindi di solito iniziamo con entrambi gli approcci contemporaneamente.</li>
</ol>3. Progettare i primer per la clonazione
<ol><li>Utilizzare uno strumento Web (<a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a>) per progettare le prime rinportatrici per la clonazione. Ad esempio, immettere i frammenti 9, 10, 11 e 12 e la sequenza vettoriale (Figura supplementare 3) a questo strumento.</li>
	<li>Per la sequenza vettoriale, aggiungere il sito di inserimento come ultimo nucleotide e successivamente aggiungere i frammenti. Poiché la numerazione dei vettori non inizia con un determinato sito di inserimento, il sito di inserimento nel vettore si trova e la parte a valle viene inserita davanti alla sequenza a monte. In questo esempio gli inserti iniziano subito dopo il sito HindIII [AAGCTT] e terminano subito dopo il sito PmeI [GTTTAAAC] di pcDNA3.1. La sequenza da cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc è incollato davanti alla posizione 1 nella sequenza pcDNA3.1 (gttgctggtgtttttcc ...).</li>
	<li>Regolare i primer se i loro punti di fusione sono più di 4 gradi centigradi di distanza, in quanto non funzioneranno in amplificazione. L'assemblaggio dei frammenti e delle sequenze di primer progettate è illustrato nella figura supplementare 4. I Primer per la clonazione possono anche essere progettati manualmente25.</li>
</ol>4. Rilevamento PCR e amplificatore
<ol><li>Reazione PCR standard: fare un mix di reazione per un volume totale di 50 L per reazione. Di seguito è riportata la ricetta per una reazione utilizzando la polimerasi 1: 10 L di 5 volte buffer di reazione 1 - L di 10 mm dNTP 2,5 ll di 10 M di Primer in avanti 2,5 ll di 10 M Primer inverso 0,5 litri di polimerasi 1 32,5 l'l di Nuclease free H2O<ol>
<li>Se si desidera, aggiungere 10 L di 5 volte GC Enhancer se il prodotto ha un elevato contenuto di GC; fare un mix separato contenente GC Enhancer per testare la reazione PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquota 49 -L della miscela in tubi PCR per campione di reazione.</li>
	<li>Aggiungere 1 l' di DNA alla PCR, la quantità varia da 10 pg a 1 ng.</li>
	<li>Abbassare i campioni per rimuovere i residui dai lati e metterli in una macchina PCR. Utilizzare la stessa macchina e gli stessi punti della macchina quando si ottimizzano le condizioni PCR.</li>
</ol>5. Ottimizzazione per frammenti di DNA più lunghi per l'uso di diverse polimerasi
<ol><li>Temperatura<ol>
<li>Ottimizzare la polimerasi 2 a lungo raggio.<ol>
<li>Utilizzare una temperatura di denaturazione più bassa (Polymerase 1: 98 gradi C, Polimerasi 2: 94 gradi centigradi).</li>
			<li>Utilizzare un tempo di denaturazione più lungo (Polymerase 1: 10 s, Polymerase 2: 30 s).</li>
			<li>Utilizzare un tempo di analising più lungo (Polymerase 1: 30 s, Polymerase 2: 60 s).</li>
			<li>Utilizzare un tempo di estensione più lungo (Polymerase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).</li>
			<li>Utilizzare una temperatura di estensione inferiore (Polymerase 1: 72 s, polimerasi 2: 65 gradi centigradi).</li>
			<li>Utilizzare una temperatura di annealing di 5 gradi sotto il Tm dei primer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ottimizzare le concentrazioni di primer (5 x da meno a 5 volte in più rispetto alla concentrazione originale del primer). Ottimizzare le concentrazioni di DNA da 10 pg a 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.</li>
		<li>Come esempio di un programma PCR per amplificare una dimensione del prodotto di 15 kb utilizzando Polymerase 2, eseguire una denaturazione iniziale a 94 gradi centigradi per 30 s, la denaturazione del DNA a 94 s seguita dall'annealing a 58 gradi centigradi per 30 s, e l'estensione del DNA a 65 s per 12 min 30 s. Eseguire un'estensione finale a 65 gradi centigradi per 10 min con una presa finale di 4 gradi centigradi. NOTA: La temperatura di annessione (Ta) specifica per le primer determinata da calcoli di temperatura basati sul web specifici per ogni polimerasi. I tempi di estensione possono variare e devono essere ottimizzati se i frammenti sono maggiori di 10 kb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tempi di estensione e concentrazioni di DNA<ol>
<li>Utilizzare tempi di estensione più lunghi per frammenti di DNA superiori a 6 kb: 1 min per 1 kb. I frammenti più lunghi dovrebbero usare meno DNA.</li>
		<li>Eseguire diluizioni di DNA per trovare la concentrazione ottimale del DNA per l'amplificazione, di solito da 1 pg a 1 ng per plasmidi o da 1 ng a 1 g per il DNA genomico. NOTA: Per la maggior parte della clonazione utilizzare la polimerasi 1, progettata fondendo il dominio di legame del DNA Sso7d in una polimerasi del DNA termostabile proprietario26. La polimerasi ha un basso tasso di errore e a causa del dominio Sso7d un'elevata processizia, necessaria per amplificare grandi frammenti genomici (10-15 kb). A causa di questa grande dimensione di frammento, l'assemblaggio enzimatico delle molecole di DNA27 viene utilizzato per l'inserimento nei vettori, in quanto questo metodo non richiede enzimi di restrizione. L'amplificazione di frammenti più lunghi di 15 kb diventa sempre più difficile con la polimerasi 1. Per l'amplificazione a frammento di grandi dimensioni utilizzare polimerasi 2 realizzata in piroccus-comela polimerasi di bozze fusa a Sso7d o il kit PCR a lungo raggio che dà, tuttavia, tassi di errore più elevati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Purificazione dei prodotti PCR per la clonazione
<ol><li>Eseguire metà dei prodotti PCR su gel di agarose dell'1% contenenti una macchia di acido nucleico intercalante (ad esempio, 1x GelGreen). Visualizza i gel macchiati su un transilluminatore lettore scuro. Questo DNA macchiato non è fedele alle dimensioni. NOTA: GelGreen intercala nel DNA, simile al bromuro di etidio, ma è eccitato dalla luce intorno a 500 nm (ciano), una lunghezza d'onda che non danneggia il DNA, che migliora notevolmente la clonazione.</li>
	<li>Parallelamente, eseguire metà dei prodotti PCR su un gel 1% che viene colorato post-esecuzione con bromuro di etidio (Figura 3A,B).</li>
	<li>Bande di accise della giusta dimensione dal gel colorato (passaggio 6.1) e isolano il DNA utilizzando un kit di pulizia gel e PCR. Nella deviazione dal suo protocollo standard, eluire il DNA solo in 20 - L di acqua doppia distillata, come di solito le concentrazioni di DNA sono basse.</li>
	<li>Prima della clonazione, controllare il DNA isolato su un gel di agarose per la concentrazione e l'integrità (Figura 3B). Puntare a un inserto molare 2:1 a un rapporto vettoriale. Quando si utilizzano più inserti, il rapporto è 2:2:2:1.</li>
</ol>7. Assemblaggio del DNA e rilevamento dei cloni
NOTA: La clonazione viene eseguita utilizzando un kit di assemblaggio del DNA enzimatico, con piccole modifiche. L'assemblaggio viene eseguito per 60 min a 50 gradi centigradi e generalmente la gamma inferiore del DNA viene utilizzata per l'assemblaggio (20-100 fmol/20 - reazione l). L'intero mix di reazione viene aggiunto alle cellule chimiche competenti e le intere cellule placcate su una piastra di agar di 6 cm.
<ol><li>Unire il vettore e l'inserto in un rapporto di 1:2 molare (20-500 fmol ciascuno) in 10 - L di acqua.</li>
	<li>Aggiungete 10 l di DNA Assembly Master Mix.</li>
	<li>Incubare i campioni per 60 minuti a 50 gradi centigradi.</li>
	<li>Successivamente, trasformare le celle competenti con la reazione di assemblaggio totale. Qui, utilizzare e. coli ceppo 1 cellule per i costrutti più brevi o E. coli ceppo 2 cellule per costrutti più lunghi o instabili. Le celle devono essere in un volume di 50.L.</li>
	<li>Scongelare le cellule sul ghiaccio e aggiungere 2 o più l del prodotto assemblato refrigerato alle celle competenti. Mescolare delicatamente il tubo 4-5 volte. Non vortice.</li>
	<li>Lasciare riposare il composto sul ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Scossa termica a 42 gradi centigradi per 30 s. Non mescolare.</li>
	<li>Trasferire il tubo di nuovo sul ghiaccio per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere al tubo 950 l di supporto SOC a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare il tubo di reazione a 37 gradi centigradi per 60 min. Agitare vigorosamente (300 giri/m).</li>
	<li>Piastre di selezione calde con l'antibiotico appropriato durante l'incubazione a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Pellet le cellule attraverso la centrifugazione (10.000 x g, 30 s) e piastre fuori 1/4 e 3/4 di cellule su due piastre di selezione e incubare a 37 gradi durante la notte.</li>
</ol>8. Convalida dei cloni
<ol><li>Utilizzare la colonia PCR, impiegando primer PCR che coprono i siti diassemblaggio( Figura 1C) per il rilevamento.</li>
	<li>Prendi uno stuzzicadenti sterile e tocca una singola colonia batterica.</li>
	<li>Toccare il fondo di un tubo PCR con lo stuzzicadenti che ha la colonia e poi strisciare lo stuzzicadenti su una piastra antibiotica agar, incubare la piastra striata a 37 gradi centigradi o temperatura ambiente per i costrutti sensibili durante la notte.</li>
	<li>Sovrapporre il tubo PCR toccato con la colonia con un mix PCR contenente i primer di rilevamento. Questi sono progettati utilizzando primer 3 (<a href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/" target="_blank">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</a>). Il programma ha la possibilità di forzare la progettazione di primer attraverso una sequenza definita utilizzando i segni "[ccc]" per selezionare i primer attraverso la giunzione di assieme. Il DNA dei ceppi positivi viene isolato e verificato mediante sequenziamento.</li>
</ol>9. Analisi dell'RNA circolare che esprime i geni dei reporter
<ol><li>Per l'analisi, i geni dei reporter transfecti nelle cellule eucariotiche. Qui, utilizzare le cellule HEK293 (ATTC #CRL-1573) in quanto danno alta efficienza di trasfezione. Per risparmiare sui costi, utilizzare soluzioni PEI (polyethyleneimine).</li>
	<li>Per la soluzione PEI, sciogliere l'idrocloruro lineare in polietileneimine (PEI) a 1 mg/mL in acqua a basso pH, pH 2. Porta il pH a 7 con NaOH. Filtro sterile con filtri da 0,22 m e conservato a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Dividi le cellule in sei pozzi (circa 150.000 cellule per pozzo) e lasciale crescere durante la notte nel 10% di FBS nei supporti DMEM.</li>
	<li>Aliquota 1 g del gene reporter in un tubo sterile e aggiungere 200 -L di sterile filtrato 150 mM NaCl. Mescolare con il DNA vortice.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione PEI a questo mix e vortice, centrifugare brevemente per raccogliere campioni sul fondo del tubo. Utilizzare un rapporto di 1 g di DNA per 3 L di PEI.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 10 min e quindi aggiungere direttamente alle cellule HEK 293.</li>
	<li>Incubare le cellule HEK293 a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2,durante la notte.</li>
	<li>Isolare l'RNA per RT-PCR tramite un kit di isolamento dell'RNA.</li>
</ol>10. Trattamento RNase R per rimuovere gli RNA lineari
<ol><li>Utilizzare 10 g di RNA totale in un tubo privo di RNase.</li>
	<li>Aggiungeteall'RNA10 L di 10x buffer RNase R (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl 2).</li>
	<li>Aggiungere RNase R all'RNA (1 ol - 20U).</li>
	<li>Aggiungete 1 l' di glycol blu all'RNA e portate il volume fino a 100 l un po' di acqua sterile.</li>
	<li>Incubare campioni a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 100 l di fenolo/cloroformio e vortice per 1 min.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per 1 min a fasi separate.</li>
	<li>Prendere il supernatante (fase acquosa) e aggiungere 1 volume (circa 80 -L di cloroformio).</li>
	<li>Vortice per 1 min, e quindi centrifugare per 1 min a fasi separate.</li>
	<li>Prendi supernatante, aggiungi 1:10 vol KAc e 2,5 vol etanolo, e precipita a -20 gradi centigradi per 1-4 h. Centrifughe a 4 gradi centigradi per 30 min a piena velocità (21.000 x g). Ci sarà un piccolo pellet blu nella parte inferiore.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e lavare con l'80% di etanolo. Lasciare asciugare l'aria per 5 min a temperatura ambiente e sciogliere in 10 acqua l.</li>
</ol>11. Analisi RT-PCR
<ol><li>Utilizzare 1 g di RNA per reazione RT.</li>
	<li>Fare mix di reazione per un volume totale finale di 20 -L per reazione. Per una sola reazione, utilizzare 1 L di 10 mM dNTP, 1 -L di 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 L di 5 volte Buffer First-Strand e 0,5 L di Trascrizione Inversa.</li>
	<li>Aliquota 6,5 l di miscela di reazione in nuovi tubi PCR.</li>
	<li>Mescolare fino a 5 primer in un unico mix. Tuttavia, alcuni primer possono vari accoppiamenti con altri primer nel PCR (Figura 5). Le sequenze di Primer sono nella tabella 2. Usiamo abitualmente primer esone-giunzione specifici per geni, ma è anche possibile l'innesco con hexamer casuali.</li>
	<li>Aggiungere l'insulto di 10 M al tubo di reazione RT desiderato.</li>
	<li>Aggiungere 1 g di RNA al tubo di reazione PCR.</li>
	<li>Aggiungere RNase-free H2O fino a un volume totale di 20 .L.</li>
	<li>Girare i tubi verso il basso per rimuovere i residui sul lato dei tubi e posizionare in termociclore.</li>
	<li>Eseguire la reazione RT in termociclore a 50 gradi centigradi per 50 minuti.</li>
	<li>Conservare RT cDNA a -20 gradi centigradi o procedere alla reazione PCR.</li>
</ol>

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</ol>

Niente da rivelare.

In generale, gli RNA circolari sono bassi abbondanti1, il che complica lo studio della loro funzione e formazione. Simile agli RNA lineari13, l'uso di minigeni reporter permette l'identificazione di cis e fattori trans-agire che regolano la formazione di RNA circolari. Pertanto, questo approccio genera ipotesi che possono essere ulteriormente testate utilizzando i geni endogeni.
Il passo più critico è la progettazione del gene reporter. L'assembl...

RNA circolari Gli RNA circolari (circRNA) sono rna a singolo spiaggiamento chiusi covalentmente chiusi che sono espressi nella maggior parte degli organismi. Vengono generati unendo un sito di giunzione a un downstream 5' a un sito di giunzione a monte 3', un processo chiamato back-splicing (Figura 1A)1. Le sequenze nel pre-mRNA che presentano una base complementare fino a 30-40 nt portano i siti di giunzione posteriore in un corretto allineamento per la formazione di circRNA2. Nell'uomo, gli elementi Alu 1, che rappresentano circa l'11% del genoma3, formano ampie strutture di RNA a doppio filamento nel pre-mRNA a causa della loro auto-complementarità4,5 e quindi promuovono la formazione di circRNA1.
Attualmente, sono state descritte tre funzioni principali dei circRNA. Alcuni circRNA legano microRNA (miRNA) e attraverso il sequestro agiscono come spugne di miRNA6. I circRNA sono stati implicati nella regolazione trascrizionale e post trascrizionale, attraverso la concorrenza con la giunzione lineare7 o la modulazione dell'attività del fattore di trascrizione8. Infine, i circRNA contengono brevi cornici di lettura aperte e studi di prova di principio dimostrano che possono essere tradotti9,10. Tuttavia, la funzione della maggior parte dei circolrRNA rimane enigmatica. La maggior parte degli RNA circolari è stata rilevata utilizzando i metodi di sequenziamento di nuova generazione11. Analisi dettagliate di singoli geni utilizzando approcci RT-PCR mirati rivelano che un gran numero di RNA circolari rimane da scoprire12.
Uso dei geni dei reporter per analizzare l'elaborazione pre-mRNA L'analisi dell'mRNA derivato dai costrutti di segnalazione del DNA trasinfezione in cellule è un metodo ben consolidato per studiare lo splicing pre-mRNA alternativo, che può essere applicato agli RNA circolari. In generale, l'eson alternativo, gli introni circostanti e gli estrusioni coniugali vengono amplificati e clonati in un vettore di espressione eucatra. Spesso, gli introni sono accorciati. I costrutti sono trasfettati in cellule eucariotiche e di solito analizzati da RT-PCR13,14. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per mappare i siti di giunzione regolamentare e i fattori di trans-azione negli esperimenti di co-trasfezione13,15,16,17,18. Inoltre, la generazione di minigeni proteici ha permesso lo screening di sostanze che cambiano lo splicing alternativo19,20.
Il metodo è stato applicato agli RNA circolari. Attualmente, almeno 12 backbone minigene sono stati descritti nella letteratura e sono riassunti nella tabella 1. Ad eccezione del sistema di espressione basato sul tRNA21,22, tutti dipendono dai promotori di polimerasi II. Qui, descriviamo un metodo per generare minigeni di reporter umani per determinare i fattori di cis e trans-azione coinvolti nella generazione di RNA circolari. Una panoramica del metodo che utilizza sequenze di un reporter genepubblicato 23 è illustrata nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Cloridrato</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di costruzione</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td>Clare Chemical Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di assemblaggio del DNA enzimatico</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia per gel e PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Glyco Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 sito di</td><td>clonaggio Sito</td><td></td> <td>di policlonaggio<a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polimerasi 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Polimerasi 2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>Polimerasi a lungo raggio (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>Polimerasi 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Kit per polimerasi a lungo raggio Qiagen</td></tr> Kit di isolamento <tr>dell'RNA<td>a trascrittasi inversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion di Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicentro/Lucigeno</td></tr><tr><td>Cellule stabili</td><td>e competenti NEB</td><td>C3040H</td><td>Cellule stabili NEB</td></tr><tr><td>Batteri di clonazione standard</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha strumento Web competente</td></tr><tr><td>per la progettazione di primer</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Calcoli di temperatura basati sul Web</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

uso dell'elemento alu contenente minigenes per analizzare gli rna circolari

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Oltre agli mRNA lineari, molti geni eucarioti generano RNA circolari. La maggior parte degli RNA circolari sono generati dall'unendo un sito di giunzione di 5' con un sito di giunzione a monte a monte di 3' all'interno di un pre-mRNA, un processo chiamato back-splicing. Questa circolarizzazione è probabilmente aiutata da strutture secondarie nel pre-mRNA che portano i siti di giunzione in stretta vicinanza. Nei geni umani, si pensa che gli elementi alu promuovano queste strutture secondarie dell'RNA, poiché gli elementi Alu sono abbondanti e presentano complementarità di base tra loro quando sono presenti in direzioni opposte nel pre-mRNA. Qui, descriviamo la generazione e l'analisi di grandi elementi Alu contenenti geni reporter che formano RNA circolari. Attraverso l'ottimizzazione dei protocolli di clonazione, è possibile generare geni reporter con una lunghezza di inserto fino a 20 kb. La loro analisi negli esperimenti di co-trasfezione consente l'identificazione di fattori normativi. Pertanto, questo metodo può identificare le sequenze di RNA e i componenti cellulari coinvolti nella formazione circolare dell'RNA.

I geni dei reporter consentono la determinazione di fattori regolatori che influenzano la formazione circolare dell'RNA. Tuttavia, questi geni reporter sono grandi e contengono elementi ripetitivi che spesso rendono instabili i costrutti del DNA. A causa delle loro grandi dimensioni, è spesso necessario eliminare parti degli introni, che si ottiene amplificando i pezzi genomici contenenti gli esoni e le parti intronica laterali più piccole. Questi pezzi di DNA sono assemblati enzimaticamente, permettendo la costruzione s...

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Questo protocollo è significativo perché consente all'utente di generare un sistema di espressione genomica che può subire splicing alternativo e in questo caso formare RNA circolari che possono essere testate per la loro funzione e associazione di malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aprirà la strada ad altri per utilizzare questo protocollo in biologia molecolare e clonazione quando studiano lo splicing alternativo nella formazione e nella funzione dell'RNA circolare. Il mio consiglio a qualcuno che prova questa tecnica per la prima volta sarebbe quello di ottimizzare le condizioni PCR.Eseguire gradienti o eseguire touchdown PCR con diverse temperature di ricottura e tempi di estensione. Di solito frammenti più lunghi superiori a sei KB estenderanno un KB per ciclo e diverse temperature di ricottura dovrebbero essere testate per la migliore amplificazione. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale perché darà agli utenti una migliore rappresentazione visiva degli aspetti più difficili della procedura, in particolare la generazione di primer.Per iniziare questa procedura, caricare il browser del genoma UCSC e utilizzarlo per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione di RNA circolari e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i primer per l'amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi. Incollare la sequenza di RNA circolare nella ricerca blat umana e selezionare l'organismo giusto.Invia la sequenza, vai alla visualizzazione del browser e ingrandisci 1,5 timer o, a caso. Quindi, passare il mouse sugli elementi ripetitivi per identificarne il sottotipo in una finestra mobile. Gli elementi Alu sono nella linea del seno.Utilizzare il pulsante traccia predefinito sotto la finestra per reimpostare il browser se si ottiene un'immagine errata. Per prima cosa vai a vedere, DNA sulla linea superiore del browser del genoma USCS per scaricare la sequenza di DNA mostrata nella finestra. Nell'opzione di formattazione sequenziamento selezionare le opzioni estese maiuscole/minuscole/colore.Selezionate il caso di default come inferiore e selezionate attiva/disattiva maiuscole/minuscole per NCBI RefSeq. Selezionate sottolineatura e grassetto (Bold) e Corsivo (Italic) per RepeatMasker. Fare clic su Invia.Ci saranno esoni come lettere maiuscole e introni come lettere minuscole. Controllare i bordi dell'esone/introne. Se il browser mostra il complemento inverso, tornare indietro e selezionare la casella del complemento inverso fino a visualizzare i bordi esone/introne corretti.Copiare quindi il file con l'orientamento corretto in un documento di elaborazione testi ed evidenziare gli esoni. Selezionate i frammenti da amplificare assicurandoche l'introne non inizi o finisca in una regione ripetitiva poiché i primer in queste regioni non amplificano sequenze specifiche. Per iniziare, usa uno strumento Web per progettare i primer per la clonazione.Per la sequenza vettoriale, aggiungere il sito di inserimento come ultimo nucleotide e successivamente aggiungere i frammenti. Poiché la numerazione vettoriale non inizia con un dato sito di inserimento, il sito di inserimento nel vettore si trova e la parte downstream viene messa davanti alla sequenza a monte. Regolare i primer se i loro punti di fusione sono distanti più di quattro gradi Celsius e non funzionano nell'amplificazione.In questo studio, i geni reporter che generano RNA circolari vengono clonati e analizzati. I prodotti PCR ottimizzati sono separati su un gel di agarosio dell'1% contenente gel verde 1X. Le singole bande rappresentano i prodotti PCR che verranno utilizzati nell'assemblaggio del DNA enzimatico.Queste bande vengono quindi tagliate dal gel e purificate. Il prodotto PCR purificato non è fedele alle dimensioni previste con gel verde, quindi i prodotti sono separati anche su un gel di agarosio all'1% che viene successivamente colorato con bromuro di etidio per garantire che i prodotti siano delle dimensioni corrette. Per iniziare, impostare un kit di assemblaggio enzimatico del DNA.Combinare il vettore e gli inserti in un rapporto molare da uno a due. Quindi, aggiungere 10 microlitri di mix master di assemblaggio del DNA. Incubare i campioni per 60 minuti a 50 gradi.Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio durante l'incubazione. Le cellule devono essere in un volume di 50 microlitri. Quindi, trasformare le cellule competenti con la reazione totale di assemblaggio.Aggiungere due microlitri del prodotto assemblato refrigerato alle celle competenti. Mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo da quattro a cinque volte. Non vortice.Mettere la miscela sul ghiaccio per 30 minuti. Scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Quindi riposizionare sul ghiaccio per due minuti.Successivamente, aggiungere 950 microlitri di supporti SOC a temperatura ambiente al tubo. Incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti mentre si trema a 300 giri/min. Durante questa incubazione, riscaldare due piastre di selezione che contengono l'antibiotico appropriato.Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo di reazione a 10.000 g per 30 secondi per pellettare le cellule e placcare il 25% delle cellule su una piastra di selezione e il 75% dall'altra. Incubare queste piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Prima di iniziare la trasfezione, controllare il DNA per restrizione digerire.Qui, un tau minigene rappresentativo che contiene esoni da nove a 12 viene tagliato con enzimi di restrizione indicati per escludere le principali ricombinazioni. Per la trasfezione, sciogliere prima il cloridrato lineare di polietilene in acqua ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro a pH due. Utilizzare idrossido di sodio per portare il pH fino a sette e filtrare sterilemente la soluzione con un filtro da 0,22 micrometri.Conservare la soluzione a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronta per l'uso. Quindi dividere le cellule nei pozzi di una piastra a sei porri e lasciarle crescere durante la notte su supporti DMEM contenenti il 10% fbs. Il giorno dopo, aliquote un microgrammo del gene riportato in un tubo sterile e aggiungere 200 microlitri di cloruro di sodio filtrato sterile da 150 millimolare.Mescolare con il vortice. Successivamente, aggiungere la soluzione di polietilenimina a questa miscela con un rapporto di tre microlitri di polietilenimina per ogni microgrammo di DNA. Centrifugare brevemente per raccogliere campioni nella parte inferiore del tubo.Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungerlo direttamente alle celle HEK293. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Il giorno dopo, usa un kit di isolamento dell'RNA per isolare l'RNA per RT-PCR. cDNA da due campioni derivati da tessuti cerebrali umani sono amplificati con primer circolari di RNA che circondano l'esone 1210 inverso e l'esone circolare 1211 in avanti. Mentre si vede la banda prevista corrispondente all'RNA circolare tau, le altre bande forti sono artefatti che non corrispondevano al genoma umano.Questo esperimento viene ripetuto con identiche condizioni PCR, ma la trascrizione inversa è stata eseguita solo con il primer inverso circ tau exon 1210. Solo la banda prevista viene amplificata e convalidata tramite sequenziamento. L'RNA viene quindi trattato con RNasi R che rimuove l'RNA lineare.L'RNA circolare è rilevabile dopo il trattamento mentre l'RNA lineare non fornisce più un segnale rilevabile. L'RNA è isolato 24 ore dopo la trasfezione e analizzato da RT-PCR. L'amplificazione dell'mRNA tau lineare mostra due bande dovute allo splicing alternativo dell'esone 10.Il loro rapporto cambia con l'espressione over dei fattori di splicing. L'amplificazione dell'RNA tau circolare 1210 mostra la dipendenza dell'espressione dell'RNA tau circ sull'espressione di alcuni fattori di giunzione in particolare la chinasi CLK2 simile alla Cdc2 e la proteina SR 9G8. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è la progettazione e la posizione dei primer quando si costruisce un minigene.Il primer non dovrebbe trovarsi in elementi ripetitivi e dovrà essere ottimizzato in condizioni diverse a seconda del frammento amplificato. Seguendo questa procedura, altri metodi che possono essere eseguiti testeranno la funzione degli RNA circolari. Gli utenti possono testare la traduzione o il sequestro delle proteine per identificare una funzione per lo specifico RNA circolare a cui l'utente è interessato.Questa tecnica ha spianato la strada all'utilizzo di frammenti genomici in un sistema minigene in grado di esprimere es oltre gli RNA circolari consentendo all'utente di testare e identificare la propria funzione e in alcuni aspetti la loro associazione alla malattia. L'implicazione di questa tecnica si estende verso potenziali terapie e diagnostica di una particolare malattia, ad esempio tauopatie, malattie neurodegenerative associate alla patologia tau. Abbiamo scoperto che la proteina tau associata ai microtubuli, nota come MAPT, genera RNA circolari che crediamo contribuiscano alla patologia della malattia e questo metodo ci consente di studiare completamente questi RNA circolari e identificarne la funzione e la relazione con la malattia.Questo metodo potrebbe fornire informazioni su una migliore comprensione degli RNA circolari, delle loro funzioni e del ruolo che possono svolgere in determinate malattie. Questo metodo può essere applicato nella clonazione di altri minigeni che esprimono RTA circolari tra le specie in cui può fornire informazioni sulla loro funzione. L'amplificazione dei prodotti PCR si rivela la più difficile con lunghi frammenti amplificati dal DNA genomico, insieme ad avere più elementi ripetitivi all'interno del frammento.

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Linear-amplificazione mediata (LAM)-PCR è un metodo sviluppato per identificare le posizioni esatte di integrare vettori virali nel genoma. La tecnica si è evoluta per essere il metodo superiore per studiare la dinamica clonali nei pazienti di terapia genica, biosicurezza delle tecnologie innovative vettore, la diversità delle cellule T, modelli di cellule staminali del cancro, ecc...

Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

Questo video mostra i passaggi di base per eseguire l'analisi dell'intero trascrittoma su campioni di midollo spinale embrionale di pollo sezionati dopo la trasfezione con elettroporazione in ovo.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

Questo articolo presenta un metodo sensibile chiamato Circle-Seq per purificare il DNA circolare extracromosomico (eccDNA). Il metodo comprende la purificazione della colonna, la rimozione del DNA cromosomico lineare rimanente, l'amplificazione del circolo rotante e il sequenziamento ad alto rendimento. Circle-Seq è applicabile allo screening su scala genomica dell'eccDNA eucariotico e allo studio dell'instabilità del genoma e della variazione del numero di copie.

Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

I due diversi 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) protocolli descritto qui fanno uso di due diversi DNA polimerasi per mappare sequenze che includono un segmento dell'open reading frame (ORF), il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR di una trascrizione usando RNA ottenute da linee cellulari tumorali differenti.

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.

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Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.

Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

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Scopri come generare RNA circolari con un sistema di espressione genomica basato su minigeni contenenti elementi Alu. Questo protocollo consente di studiare la funzione e l'associazione con malattie degli RNA circolari.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

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