Name: Metodi funzionali e fisiologici per valutare la rigenerazione mediana del nervo nel ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Impara metodi funzionali e fisiologici per valutare la rigenerazione del nervo mediano nel ratto. Questo protocollo include test comportamentali non invasivi e misurazioni elettrofisiologiche per studiare il recupero motorio e sensoriale.

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Diogo Casal ha ricevuto una sovvenzione dal Programma per l'Educazione Medica Avanzata, che è sponsorizzato da Pitào Calouste Gulbenkian, Fundao Champalimaud, Ministério da Saàde e Fundao para a Cioncia e Tecnologia, Portogallo. Gli autori sono molto grati al sig. Figure 1 Gli autori desiderano ringraziare l'aiuto tecnico del signor Alberto Severino nelle riprese e nel montaggio del video. Infine, gli autori desiderano ringraziare la signora Sara Marques per il suo aiuto in tutti gli aspetti logistici relativi all'acquisizione e alla manutenzione degli animali.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento presenta un protocollo per creare diversi tipi di lesioni MN e riparare nel ratto. Inoltre, illustra come valutare il recupero funzionale di questo nervo utilizzando diversi test comportamentali non invasivi e misurazioni fisiologiche.
In particolare, molti dei test funzionali descritti in questo documento, vale a dire il Ladder Running Test e il Rope Test, dipendono in modo significativo dalla volontà del ratto di svolgere il compito con l'aspettativa di ottenere la ricompensa alimentare51,52,53. Va notato che alcuni ceppi di ratto sono più suscettibili all'allenamento e l'esecuzione riproduciva in questo tipo di test51,52,53. Ad esempio, i ratti Lewis si comportano male in questi test sia in fase di allenamento che successivamente51,52,53.
L'alloggiamento dei ratti dovrebbe consentire un'ampia libertà di movimento in accordo con il loro naturale comportamento esplorativo, oltre a consentire agli animali sperimentali di familiarizzare con alcuni degli elementi presenti nei test funzionali19. Pertanto, vengono mostrate diverse forme di alloggiamento che consentono una maggiore libertà di movimento. Le grandi gabbie sono personalizzate con elementi di arricchimento che vengono successivamente utilizzati nei test funzionali (ad esempio, corde e scale).
Probabilmente, questi elementi arricchenti così come le gabbie con ruote da corsa incorporate e le singole sfere di allenamento forniscono una forma di fisioterapia postoperatoria simile a quella offerta ai pazienti umani operati sul sistema nervoso periferico10.
Significativamente, anche se alcuni autori sostengono sezionare i tessuti sottocutanei e fasciatura muscolare senza mezzi termini o da taglio pulito con un numero 15 bisturi, l'uso di termocauterio quando si sezionano queste strutture è raccomandato per ridurre al minimo il rischio di ematoma postoperatorio.
Va notato che numerosi test sono stati ideati per testare diversi aspetti della riparazione del nervo periferico nel ratto, vale a dire la rigenerazione assonale, la reinnervazione del bersaglio e il recupero funzionale, alcuni dei quali esulano dall'ambito di questo studio29,54,55,56. Ad esempio, l'analisi cinematica29,36,55 e la valutazione itomorfometrica29,36,57 sono ampiamente impiegati da più autori. Inoltre, molti di questi test comportano variazioni per massimizzare l'efficienza e/o la riproducibilità54. Ad esempio, l'algisemetria meccanica (cioè la valutazione delle risposte agli stimoli meccanici dolorosi) può essere valutata qualitativamente utilizzando un dato filamento von Frey, come descritto nel presente documento, o semiquantitativamente utilizzando filamenti di von Frey successivi, o anche quantitativamente utilizzando dispositivi elettronici che applicano pressioni crescenti fino a quando non viene osservata una risposta di ritiro fino a quando non viene osservata una risposta di ritiro30,54.
Allo stesso modo, anche se diversi autori usano l'analisi della pista a piedi per valutare la riparazione del nervo anteriore nel ratto, altri autori sostengono che le singole lesioni MN spesso non riescono a produrre cambiamenti riproducibili nei pawprint10,58,59. Inoltre, alcuni hanno dichiarato che questi cambiamenti non possono essere proporzionali al recupero muscolare10,60. Tenendo questo in mente, alcuni ricercatori hanno sostenuto l'uso di a piedi analisi pista nella preda principalmente quando si valuta il recupero dopo la frantumazione lesioni neve piuttosto che dopo la ricostruzione del nervo segmentale10,50,61.
Il test di presa è ampiamente utilizzato per valutare il recupero motorio dei muscoli controllati dal MN16,27. Per garantire uniformità e riproducibilità dei dati ottenuti con questo test, si raccomanda l'applicazione del test di presa utilizzando la metodologia consolidata proposta da Bertelli et al.16. Tuttavia, il protocollo attuale differisce in quanto non immobilizza regolarmente la zampa contralaterale per evitare indebito stress11,27. Va anche notato che altri autori, dopo aver immobilizzato la zampa illesa, valutano quantitativamente il test di grasping utilizzando un dinamometro o una scala27,56. Tuttavia, questa valutazione quantitativa può essere influenzata dalla forza che il ricercatore applica alla coda del ratto26. Inoltre, è difficile distinguere tra la forza generata dai muscoli digital flexor (esclusivamente innervati dal MN nel ratto e l'oggetto del Grasping Test9) dalla forza prodotta dai flessori del polso, che includono il flessore carpi ulnaris che riceve la sua innervazione dal nervo ulnare9,10,27. Per cercare di eludere questi potenziali pregiudizi, questo protocollo utilizza una scala ordinale simile alla scala del Consiglio di Ricerca Medica comunemente utilizzata per classificare la forza muscolare in esseri umani10,11,62. In alternativa, altri autori hanno descritto una valutazione dettagliata della presa utilizzando l'analisi video e un sistema di punteggio basato su video11,63.
Un potenziale svantaggio dell'uso del MN rispetto al nervo sciatico è che una maggiore quantità di informazioni è disponibile per quanto riguarda quest'ultimo nervo. Questo, a sua volta, può fare un confronto dei dati ottenuti con il MN con quello delle opere sperimentali precedenti più difficili46,48,64. Inoltre, la dimensione più piccola del MN rispetto al nervo sciatico rende la manipolazione chirurgica più impegnativa8,12,27,56,65.
Contrariamente alla metodologia descritta in questo documento, la valutazione dell'elettroeuromiografia può essere eseguita utilizzando elettrodi monopolari transcutanei posizionati nel braccio e nelle regioni del campo di guida51. Nonostante sia meno invasivo, questo metodo comporta il rischio di potenziale confusione a causa della possibilità di costimolazione del nervo ulnare nella regione del braccio9,51.
La maggior parte degli autori concordano sul fatto che non tutti i test utilizzati nel ratto forniscono risultati concordanti, poiché la riparazione del nervo periferico dipende da una complessa serie di fattori, che comprendono la sopravvivenza dei neuroni, l'allungamento e la potatura assonale, la sinaptogenesi, la riconquista di successo degli organi sensoriali e delle unità motorie denervated e la plasticità cerebrale7,10,50,66,67.
Infine, va notato che un avvertimento significativo dei modelli di roditori è che i nervi periferici del ratto sono molto più vicini ai loro organi finali e hanno aree trasversali molto più piccole rispetto alle strutture umane omologhe. Tuttavia, questa differenza di dimensioni garantisce dati sperimentali più veloci nei roditori e migliori risultati complessivi nei ratti rispetto agli esseri umani sono da aspettarsi68. Infatti, diversi autori avvertono che è necessario prestare attenzione quando si cerca di estrapolare dati sperimentali ottenuti nella riparazione del nervo periferico utilizzando roditori per gli esseri umani7,69. I modelli Primate sono considerati70più comparabili. Tuttavia, il loro uso è associato a vincoli etici, logistici e di bilancio71.
Anche se il nervo sciatico è il nervo più comunemente usato nella ricerca sul nervo periferico, il ratto MN presenta molteplici vantaggi. Ad esempio, le lesioni MN sono associate a una minore incidenza di contratture congiunte e all'automutilazione della zampa interessata11,12,16,56. Significativamente, l'autotomia successiva alla transezione del nervo sciatico affligge l'11-70% dei ratti. Ciò potrebbe rendere impossibili le valutazioni attuali come l'indice sciatico14. Questo, a sua volta, rende ingombrante la stima del numero di animali necessari per ottenere un determinato potere statistico15.
Inoltre, poiché il MN è più corto del nervo sciatico, il recupero del nervo si osserva prima58,72,73,74,75,76. Inoltre, il MN non è coperto da masse muscolari, rendendo la sua dissezione tecnicamente più facile di quella del nervo sciatico16. Inoltre, il MN ha un percorso parallelo al nervo ulnare nel braccio. Quindi, il nervo ulnare può essere facilmente utilizzato come innesto nervoso per riparare le lesioni da MN. Infine, negli esseri umani, la maggior parte delle lesioni nervose periferiche si verificano nell'arto superiore, che supporta ulteriormente l'uso di questo nervo nel ratto77,78.
Probabilmente, i roditori sono gli animali sperimentali più comunemente utilizzati nel regno della riparazione del nervo periferico48,79. Come mostrato, il ratto MN è un modello conveniente di lesione e riparazione del nervo periferico. Infatti, ci sono molteplici strategie standardizzate disponibili per valutare il recupero motorio e sensoriale, permettendo un confronto più facile dei risultati36,46,60,80,81,82. Molti di questi metodi non sono invasivi, consentendo una valutazione giornaliera.
Inoltre, la fisioterapia fa parte dello standard di cura dei pazienti che si riprendono da lesioni nervose periferiche. Come dimostrato in questo documento, ci sono diverse strategie per fornire un ambiente postoperatorio simile alla fisioterapia ai ratti sottoposti a lesioni MN4,5. Quindi, questo modello è particolarmente adatto a replicare lo scenario clinico, facilitando l'estrapolazione dei risultati alla specie umana12,27,48,56,58,83.
Come mostrato in questo documento, sono disponibili più strategie standardizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale nel modello MN del ratto. La maggior parte di queste sono procedure non invasive, consentendo una valutazione frequente. Inoltre, poiché la maggior parte delle lesioni nervose periferiche nella specie umana si verificano nell'arto superiore, le impostazioni di fisioterapia sperimentale menzionate possono imitare in modo più appropriato il recupero nel contesto clinico. Probabilmente, questo può facilitare l'estrapolazione dei risultati alla specie umana, convalidando ulteriormente l'uso di questo nervo nel ratto.

Le lesioni nervose periferiche si verificano regolarmente a seguito di traumi, infezioni, vasculite, autoimmunità, malignità e/o radioterapia1,2. Purtroppo, la riparazione del nervo periferico continua a presentare risultati clinicamente imprevedibili e spesso deludenti3,4. È ampiamente concorso il consenso sulla necessità di una notevole ricerca di base e traslazionale per migliorare la prospettiva delle persone colpite4,5,6,7.
Il ratto MN mostra grandi somiglianze con quella degli esseri umani8,9 ( Figura1). Originario del plesso brachiale nella regione ascellare, questo nervo scende nell'aspetto mediale del braccio, raggiungendo il gomito e ramificandosi verso la maggior parte dei muscoli nel compartimento ventrale dell'avambraccio. Il MN raggiunge la mano, dove innerva i muscoli thenar e i primi due muscoli lumcali, nonché a parte della pelle della mano del ratto9 (Figura 1).
Utilizzando il ratto MN, è possibile replicare adeguatamente le lesioni nervose periferiche in esseri umani10,11,12. Questo nervo ha diversi potenziali vantaggi di ricerca rispetto al nervo sciatico abitualmente usato. Poiché il MN si trova nell'arti anteriori dei ratti (simile agli arti superiori umani), può essere danneggiato sperimentalmente con un impatto molto minore sul benessere del ratto, rispetto al nervo sciatico, che innerva una parte sostanziale dell'arto pelvico13. Inoltre, negli esseri umani la maggior parte delle lesioni cliniche si verificanellione superiore, che corrisponde all'arto anteriore del ratto10,11,12,14,15,16.
Questo documento mostra come produrre diversi tipi di lesioni MN nel ratto. Inoltre, vengono presentati diversi modi per simulare la fisioterapia postoperatoria. Infine, vengono descritti i test per valutare il ripristino funzionale del MN. Sono disponibili diverse strategie standardizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale utilizzando un modello MN di lesione e riparazione del nervo periferico, consentendo così un facile confronto dei risultati. Il modello MN è particolarmente adatto per replicare lo scenario clinico, facilitando l'estrapolazione dei risultati alla specie umana.

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metodi funzionali e fisiologici per valutare la rigenerazione mediana del nervo nel ratto

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

L'obiettivo principale di questa indagine è quello di mostrare come creare e riparare diversi tipi di lesioni nervose mediane (MN) nel ratto. Inoltre, vengono presentati diversi metodi per simulare la fisioterapia postoperatoria. Molteplici strategie standardizzate vengono utilizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale utilizzando un modello MN di lesione e riparazione del nervo periferico, consentendo così un facile confronto dei risultati. Diverse opzioni sono incluse per fornire un ambiente simile alla fisioterapia postoperatoria ai ratti che hanno subito lesioni da MN. Infine, la carta fornisce un metodo per valutare il recupero del MN utilizzando diversi test non invasivi (ad esempio, test di presa, test del pungiglione, test del deflusso della scala, test di arrampicata su fune e analisi della pista a piedi), e misurazioni fisiologiche (termografia a infrarossi, elettroeuromiografia, valutazione della forza di flessione e determinazione del peso muscolare del carpire radiale). Di conseguenza, questo modello sembra particolarmente appropriato per replicare uno scenario clinico, facilitando l'estrapolazione dei risultati alla specie umana.
Anche se il nervo sciatico è il nervo più studiato nella ricerca del nervo periferico, l'analisi del ratto MN presenta vari vantaggi. Ad esempio, vi è una minore incidenza di contratture articolari e di automutilazione dell'arto interessato negli studi sulla lesione MN. Inoltre, il MN non è coperto da masse muscolari, rendendo la sua dissezione più facile di quella del nervo sciatico. Inoltre, il recupero di MN è osservato prima, perché il MN è più corto del nervo sciatico. Inoltre, il MN ha un percorso parallelo al nervo ulnare nel braccio. Quindi, il nervo ulnare può essere facilmente utilizzato come innesto nervoso per riparare le lesioni da MN. Infine, il MN nei ratti si trova nell'arto anteriore, simile all'arto superiore umano; negli esseri umani, l'arto superiore è il sito della maggior parte delle lesioni nervose periferiche.

Un totale di 34 ratti sono stati suddivisi in modo casuale nei seguenti gruppi: Sham (n - 17), Escisione (n - 17) e Innesto del Nervo (n - 10) per l'operazione. Tutti i ratti sono sopravvissuti all'intervento chirurgico e il periodo postoperatorio senza eventi. Una settimana dopo l'intervento chirurgico e per i successivi 100 giorni, tutti gli animali sono stati sottoposti ai test funzionali descritti sopra una volta alla settimana. I risultati rappresentativi di ciascuno di questi test sono descritti di seguito.
Test di presa
La percentuale di ratti con una risposta positiva nella prova di presa è stata più alta per il gruppo Sham. Questo valore è gradualmente aumentato nel tempo nei ratti dei gruppi Crush e Nerve Graft (Figura 3).
Test di pungiglione di spillo
I ratti del gruppo Sham hanno avuto i punteggi migliori nel test cumulativo di puntura di schienani rispetto ai ratti del gruppo Nerve Graft. Entrambi avevano punteggi migliori rispetto ai ratti nel gruppo Excision (Figura 4).
Test di corsa ladder
La velocità dei ratti nel test di corsa della scala era più alta nel gruppo Sham che nei ratti sottoposti alla lesione MN. Tra questi ultimi, il tempo per eseguire la scala tendeva a diminuire nel tempo, parallelamente al recupero MN (Figura 5).
Prova di corda
Come nel test di corsa della scala, il tempo impiegato dai ratti per scalare la corda era più breve nel gruppo Sham rispetto ai gruppi in cui il MN è stato ferito. La velocità dei ratti in questo test è aumentata quando il MN è stato permesso di recuperare (Figura 6).
Analisi dei sentieri a piedi
L'analisi delle tracce a piedi tendeva a mostrare cambiamenti nella morfologia delle impronte delle zampe (Figura 7). Questi cambiamenti sono stati spesso più pronunciati nelle lesioni schiaccianti che nelle lesioni nervose segmentali50.
Termography a infrarossi
La termografia è stata utile quando si esaminano le differenze di temperatura tra le zampe anteriori nei primi 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. Le differenze di temperatura erano più evidenti nei ratti con un MN più gravemente ferito, come in quelli del gruppo Excision (Figura 8 e Figura 9).
Electroneuromyography
La tabella 1 riassume l'importanza biologica delle misurazioni dell'elettroeuromiografia, fornendo risultati rappresentativi per i diversi gruppi sperimentali. Vari modelli sono stati osservati con elettroeuromiografia. Un CMAP normale era tipico di un ratto del gruppo Sham, mentre un CMAP polifasico era associato a un grado variabile di lesione del MN, come nei gruppi Crush e Nei gruppi Nerve Graft (Figura 10). Nel gruppo Excision non è stato osservato alcun CMAP.
Forza flexion polso
Dato che la flessione del polso dipende principalmente dalla MN, questo test è stato utilizzato per valutare il recupero motorio nel territorio di questo nervo. La forza di flessione del polso era più vicina alla normalità quando il recupero era massimo (Figura 11).
Peso muscolare e morfologia
Il peso e la morfologia del muscolo flessore carpis radialis dipendevano dal recupero MN, in quanto questo muscolo è innervato esclusivamente dal MN9,10. Così, peso normale e morfologia sono stati osservati nel gruppo Sham. Una perdita di peso e tropismo muscolare è stata osservata nei gruppi Crush, Nerve Graft, e Excision (Figura 12).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica dell'anatomia del nervo mediano del ratto. (1) Origine e terminazione del nervo mediano nel cervello del ratto (area verde - area motoria primaria; area blu - area sensoriale primaria). (2) Sezione trasversale del midollo spinale a livello di segmento C7; (3)Nervo ascellare; (4) Nervo muscoloso; (5)Nervo radiale; (6) Nervo mediano; (7) Nervo ulnare; (8) Ramo cutaneo mediale del braccio; (9) Ramo cutaneo mediale dell'avambraccio; (10) Arteria ascellare; (11) Arteria Brachiale; (12) Arteria mediana; (13) Arteria radiale superficiale; (14) Arteria Ulnar; (15) Ramo motore del nervo mediano al muscolo pronatore teres; (16) Ramo motore del nervo mediano al muscolo della carpis radialis flessore; (17) Ramo motore del nervo mediano al muscolo del digitalo superficiale flessore superficialis; (18) Ramo motore del nervo mediano al muscolo del cereno flessore profundus; (19) Ramo sensoriale del nervo mediano verso la regione del narina; (20) Arteria comune palmar del primo spazio interosseo; (21) Arteria digitale palmar radiale della prima cifra; (22) Ramo motorio del nervo mediano ai muscoli thenar; (23) Arco arterioso Palmar; (24) Nervo digitale palmar radiale della prima cifra; (25) Ulnar palmar nervo digitale della prima cifra; (26) Arteria comune palmar del terzo spazio interosseo; (27) I rami motori delle divisioni terminali del nervo mediano ai primi tre muscoli lumcali; (28) Ulnar palmar nervi digitali della seconda, terza e quarta cifra; (29) Le arterie digitali di Ulnar palmar alla quarta e alla quinta cifra; (30) Nervi digitali palmari radiali della seconda, terza e quarta cifra; (31) Arteria digitale radiale palmar della quinta cifra; (32) Territorio cutaneo del nervo mediano nella pedana (regione blu-ombreggiata). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig02.jpg"> Figura 2: Fotografia dell'arti gliarti destro del ratto che mostra l'anatomia chirurgica del nervo mediano nel braccio e nelle regioni ascellari. Cr, craniale; Io, mediale Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig02large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig03.jpg"> Figura 3: Percentuale di ratti con un test di presa positivo nel diverso gruppo sperimentale per un periodo di 100 giorni dopo l'intervento chirurgico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione della tiratura utilizzando i risultati cumulativi dei test di puntura di pin nella zampa anteriore operata normalizzata alla zampa contraplaterale nei diversi gruppi sperimentali. Le barre verticali rappresentano intervalli di confidenza del 95%. Le linee orizzontali nella parte superiore della figura indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali, ovvero "p&lt;0,01". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig05.jpg"> Figura 5: Velocità media nel test di corsa della scala nei diversi gruppi sperimentali. Le barre verticali rappresentano intervalli di confidenza del 95%. Gli asterischi nella parte superiore della figura indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi, ovvero p&lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig06.jpg"> Figura 6: Velocità media di arrampicata nella prova di fune nei gruppi Sham ed Excision. Le barre verticali rappresentano intervalli di confidenza del 95%. Gli asterischi nella parte superiore della figura mostrano differenze statisticamente significative tra i gruppi, ovvero p&lt;0,05; &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig07.jpg"> Figura 7: Parametri della pista a piedi nei diversi gruppi sperimentali. I valori sull'arto azionato sono espressi come percentuali di mezzi normalizzati all'arto contralaterale. (A) Fattore di posizione; (B) Lunghezza di stampa; (C) Fattore di diffusione delle dita; (D) Fattore intermedio di diffusione delle dita; (E) Lunghezza del passo; (F) Base di sostegno. Le barre verticali rappresentano intervalli di confidenza del 95%. Le linee orizzontali nella parte superiore della figura indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali. D30, D60, D90 : 30, 60 e 90 giorni dopo l'intervento chirurgico, &lt;0,05; &lt;0,01; p&lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig08.jpg"> Figura 8: Differenza media di temperatura registrata dalla termografia a infrarossi. I grafici a scatola rappresentano la differenza di temperatura tra la regione palmar del nervo mediano sul lato operato (lato destro) e il lato contralaterale (a sinistra) nei gruppi Sham (n - 17) ed Excision (n - 17), .p&lt;0.05; &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig09.jpg"> Figura 9: Tipico modello termografico a infrarossi di un animale del gruppo di escissione durante i primi 45 giorni dopo l'intervento chirurgico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig10.jpg"> Figura 10: Modelli tipici di Compound Muscle Action Potentials (CMAP) da un animale dei gruppi Sham e Nerve Graft 90 giorni dopo l'intervento chirurgico. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig10large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig11.jpg"> Figura 11: Valutazione della forza di flessione del polso su entrambe le zampe 90 giorni postoperatori in diversi gruppi sperimentali. La forza di flessione del polso è stata valutata utilizzando l'area sotto la curva (AUC) in un periodo di tempo di 30 s e utilizzando la stimolazione supratetanica. Le linee verticali indicano intervalli di confidenza del 95%. Le linee orizzontali nella parte superiore della figura evidenziano differenze statisticamente significative tra i gruppi, ovvero p;0,01 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig12.jpg"> Figura 12: Flexor carpi radialis peso muscolare e aspetto macroscopico 100 giorni dopo l'intervento chirurgico. (A) Box plot raffiguranti il peso muscolare standardizzato di carpi radialis in diversi gruppi sperimentali, il p&lt;0.01; p&lt;0.001. (B) Fotografie dei muscoli sui lati destro e sinistro nei gruppi sperimentali Sham ed Excision. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig12large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametro</td>
			<td>Significato del parametro</td>
			<td>Gruppo Sham</td>
			<td>Gruppo di escissione</td>
			<td>Gruppo NG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soglia di stimolazione neurologica (%)</td>
			<td>Valutazione della rigenerazione del nervo, in quanto vi è un numero minimo di fibre nervose necessarie per produrre un CMAP o una contrazione muscolare visibile12
</td>
			<td>281,63 x 271,65</td>
			<td>5359.98 : 3466,52</td>
			<td>2108,12 - 2115,13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soglia di stimolazione motoria (%)</td>
			<td>Valutazione della rigenerazione del nervo, in quanto vi è un numero minimo di fibre nervose necessarie per produrre un CMAP o una contrazione muscolare visibile12
</td>
			<td>462,52 : 118,91</td>
			<td>1694,10 - 503,24</td>
			<td>1249,50 : 503,24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Latenza (%)</td>
			<td>Valutazione della velocità di conduzione nervosa nelle fibre nervose più veloci, vale a dire le più grandi fibre mielinate44
</td>
			<td>113,55 x 25,04</td>
			<td>N/D</td>
			<td>132,80 - 69,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di trasduzione neuromuscolare (%)</td>
			<td>Valutazione della velocità di conduzione nervosa nelle fibre nervose più veloci, vale a dire le più grandi fibre mielinate44
</td>
			<td>92,01 - 20,88</td>
			<td>N/D</td>
			<td>91,30 x 26,51</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ampiezza CMAP (%)</td>
			<td>Valutazione del numero di unità motorie reinnervated34
</td>
			<td>110,63 : 45,66</td>
			<td>N/D</td>
			<td>41,60 x 24,84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durata CMAP (%)</td>
			<td>Valutazione della sincronia dell'innervazione muscolare, che dipende dal grado di reinnervazione muscolare e mielinizzazione delle fibre motorie innervanti44,45
</td>
			<td>101.12 - 23,92</td>
			<td>N/D</td>
			<td>151,06 - 54,52</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
NG, innesto nervoso CMAP, potenziale di azione muscolare composta. N/D, non applicabile Tutti i parametri sono espressi come percentuali dei valori contralaterali medi. Le variabili numeriche sono espresse come media - deviazione standard.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: valutazione elettroeuromiografica alla fine dell'esperimento.

Presentato è un protocollo per produrre diversi tipi di lesioni nervose mediane (MN) e la riparazione nel ratto. Inoltre, il protocollo mostra come valutare il recupero funzionale del nervo utilizzando diversi test comportamentali non invasivi e misurazioni fisiologiche.

Metodi funzionali e fisiologici per valutare la rigenerazione mediana del nervo nel ratto

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Usando il nervo mediano del ratto, è possibile replicare adeguatamente le lesioni nervose periferiche nell'uomo. Clinicamente, la maggior parte di queste lesioni si verifica, negli arti superiori che dà supporto all'uso di questo modello sperimentale. In questo articolo mostreremo come produrre diversi tipi di lesioni nervose mediane nel ratto.Inoltre, illustreremo come valutare il recupero funzionale di questo nervo usando diversi test. Il nervo mediano ha origine dai segmenti del midollo spinale da C6 a T1. Il nervo mediano è evidenziato in verde. In questo video, le tende chirurgiche non vengono utilizzate per scopi dimostrativi.Si prega di includere un drappo durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. La pelle nell'aspetto mediale del braccio destro e della regione pettorale viene incisa fino al piano delle fasce profonde. I vasi sanguinanti sono accuratamente legati.Successivamente, la fascia brachiale viene accuratamente tagliata, facendo attenzione a non danneggiare le strutture vascolari e nervose, nell'aspetto mediale del braccio. Un paio di forbici è aperto senza mezzi termini sotto, l'inserimento terminale del muscolo pettorale maggiore, al fine di stuzzicare questo muscolo, lontano dall'arteria e dalla vena ascellare sottostante, così come dai rami terminali del plesso brachiale. L'inserimento del muscolo pettorale maggiore, viene quindi diviso con un cautery elettrico.Il muscolo pettorale minore viene quindi esposto e tagliato. Il nervo mediale viene quindi sezionato senza mezzi termini dai vasi brachiali e dal nervo ulnare fino alla regione del gomito. È ora possibile osservare, i diversi rami terminali del plesso brachiale, vale a dire la mediana, l'ulnare, il radiale, l'ascellare e i nervi muscolocutanei.Con il nervo mediano esposto e isolato possono essere indotte diverse lesioni meccaniche. Un gruppo di Sham può essere creato, sezionando solo il nervo mediano. Nel gruppo di schiacciamento, il nervo mediano viene compresso, usando forcep di microchirurgia per 15 secondi.Il gruppo di escissione deriva dalla rimozione di un segmento lungo 10 millimetri del nervo mediano. Il ceppo prossimale del nervo mediano è legato con l'8-0 sutura di nylon per prevenire la crescita assonale. In alternativa, è possibile ruotare il segmento accisa di 180 gradi e usarlo come innesto nervoso autologo.In questo caso, i ceppi prossimali e distale della sezione nel nervo mediale vengono suturati all'innesto nervoso usando 10-0 punti di nylon. La fisioterapia fa parte dello standard di cura dei pazienti che si riprendono da lesioni nervose periferiche. Esistono diverse strategie per fornire fisioterapia post-operatoria ai ratti, che sono state sottoposte a lesioni nervose mediane.È importante scegliere i giovani ratti e consentire loro di avere contatti con gli strumenti fisioterapici prima dell'intervento chirurgico. Ciò garantisce un adattamento più semplice e veloce alle impostazioni dell'esercizio. Inoltre, gli strumenti di fisioterapia dovrebbero consentire ai ratti di avere un certo grado di libertà e idealmente consentire loro di eseguire movimenti fini con le fronte.Esistono diversi modi per eseguire la fisioterapia. Ad esempio, è possibile utilizzare singole sfere. Metti il topo all'interno della sfera e poi mettilo in una stanza con pochi ostacoli.Lascia che esplori la stanza per mezz'ora. Fallo una volta al giorno. I ratti possono anche essere alloggiati in gabbie individuali.Con ruote da corsa incorporate. In questo modo, i ratti possono esercitare, quanto vogliono e quando lo vogliono. Un'altra possibilità è accomodante, i ratti in gruppi in gabbie più grandi.Personalizza le gabbie utilizzando pelli, corde, ruote da corsa e altri elementi di arricchimento ambientale. Ciò consente loro un'ampia libertà di movimento, in accordo con il loro naturale comportamento esplorativo e consente ai ratti di familiarizzare, con alcuni degli elementi presenti, nei test funzionali. Prima di eseguire i test funzionali, familiarizzare i ratti con i dolcetti alimentari che hai scelto di usare come rinforzo positivo.Condurre i test la sera, quando i ratti sono naturalmente più attivi. Inizia con un test di presa. Posizionare il topo sulla griglia e sollevarlo dalla coda lasciandolo afferrare la griglia.Quando il topo è in grado di afferrare la griglia, con una forza simile con entrambe le sopracciglia. Significa che il nervo mediano funziona e il test di presa è considerato positivo. Se non è in grado di afferrare la griglia con la zampa ferita, il test di presa è considerato negativo.Per il test pin prick, posiziona il topo sulla piattaforma e attendi alcuni minuti fino a quando le attività esplorative e di toelettatura principali non si placano. Inizia quando il topo è fermo e in piedi sulle fronte. Con l'aiuto dello specchio, inserisci i capelli Von Frey attraverso la rete per colpire l'aspetto palmare della ara anteriore.Ripeti questo cinque volte su ogni bip, in alternativa, aspettando alcuni secondi dopo ogni valutazione. Segnare la risposta di ritiro come segue, zero per nessuna risposta di prelievo, se il topo rimuove lentamente la zampa dal filamento e due se il topo risponde rapidamente allo stimolo e rimuove la zampa o lecca la zampa. Posizionare il topo nella parte inferiore della scala e toccare delicatamente la coda del topo.Avvia il timer una volta che il topo inizia a camminare e fermarlo una volta che i suoi muso attraversano l'ingresso delle scatole. Registrare l'ora e ripetere il test tre volte. Metti il topo sul fondo della corda e convincilo a arrampicarlo toccando delicatamente la coda.Considera valido il test se l'animale non lo fa, esita durante il compito o smette di arrampicarsi. Avvia il timer una volta che l'animale inizia l'arrampicata e fermalo nel momento in cui il muso del topo attraversa l'ingresso della piattaforma. Dare al topo uno spuntino dopo l'esecuzione, le attività correttamente e consentirlo, alcuni minuti di riposo prima di ripeterlo.Posizionare un pezzo di carta grafica sul pavimento dei corridoi. Quindi, afferrare il topo per la coda e lasciarlo tenere il pennello da pittura, impregnato di blu di metilene. Mettilo all'ingresso del corridoio per farlo camminare all'interno della scatola.Rimuovere la carta grafica dal pavimento dei corridoi e ripetere i test fino ad ottenere un'impressione buona e rappresentativa di entrambe le avagrafie. Dalle stampe ottenute, selezionarne una con una buona stampa di sopracciglia successive e misurare i seguenti parametri. Lunghezza di stampa, diffusione delle dita, diffusione intermedia delle dita e fattore di posizione.Infine misurare la distanza tra il secondo dito di due stampe successive, la lunghezza del passo. Per eseguire la valutazione termografica, posizionare un pezzo di colla a doppio lato sulla spugna. Posizionare il topo su di esso e incollare le sopracciglia come mostrato.Attendere un minuto per dissipare lo scambio di calore dalla manipolazione delle zampe del topo. Afferrare la fotocamera con un angolo di 90 gradi e a circa 30 centimetri di distanza dai ratti. Fai due acquisizioni.In primo luogo, un termogramma per tutto il corpo, quindi, approssimando la fotocamera alla parte superiore del corpo del topo, crea il secondo. Dal termogramma ottenuto, troviamo una regione di interesse corrispondente all'area palmare delle supe. Misurare i valori medi, minimi e massimi di temperatura di quell'area su entrambe le zampe e calcolare le differenze di temperatura.Per eseguire la seguente valutazione, esporre il nervo mediano su entrambi i lati come spiegato in precedenza. Inizia posizionando il topo sulla schiena e metti l'elettrodo appena mostrato nella pelle. Gli elettrodi di terra sulla coscia del topo e gli elettrodi di stimolazione e registrazione, sull'arto superiore sinistro.Mettere un elettrodo di registrazione, sulla pancia muscolare del sublimis flexor digitorum, e gli elettrodi di stimolazione, approssimativamente nel nervo mediano. Inizia l'acquisizione con un'ampiezza di stimolo di 10 millivolt e aumentala gradualmente, in passi da 10 millivolt fino a raggiungere due volt. Durante l'acquisizione, registrare l'ampiezza stimolo per la prima flessione visibile delle dita.Questa è la soglia di stimolazione del motore. L'ampiezza minima dello stimolo, necessaria per ottenere un potenziale di azione muscolare composta, C.M.A.P.is una soglia di stimolazione neurologica. Infine, selezionate un C.M.A.P rappresentativo, in risposta a uno stimolo supramaximale e misurate i seguenti parametri, Latenza, Ampiezza e Durata.Per eseguire la valutazione della forza di flessione, in primo luogo passare un ciclo di sutura di seta cinque o sei attraverso l'area palmare di ogni ara anteriore e lasciarlo con cinque centimetri di lunghezza. Posizionare il topo sulla schiena. Inizia con la bip sinistra, aggancia la linea di sutura nel gancio del dinamometro e allinea la forepaw con il dinamometro, senza mettere troppa tensione sul gancio.Tenere gli elettrodi Stimolanti, approssimativamente nel nervo mediano. Regola l'ampiezza dello stimolo a 1,5 volt e registra la forza istantanea per 30 secondi. Dal plottaggio ottenuto, analizzare i valori di forza massima, minima e media e l'area sotto la curva.Il Flexor carpi radialis, innervato dal nervo mediano, viene rimosso bilateralmente e pesato in una scala di precisione. Per quanto riguarda alcuni risultati rappresentativi, nel test di presa, la percentuale di ratti con una risposta positiva, è più alta nel gruppo Sham e aumenta gradualmente nel tempo, nei ratti del gruppo Nerve Graft. I risultati dei test di Pin Prick sono più alti, nel gruppo Sham rispetto a quelli dei gruppi Graft o Excision.La velocità del topo nel test ladder running, è più alta nel gruppo Sham, rispetto a quella del topo sottoposto a lesione mediale da laboratorio. Tra gli accendini, il tempo di correre la scala, tende a diminuire nel tempo parando il recupero del nervo mediano. Analogamente a quanto osservato nel ladder running test, il tempo che i ratti prendono per scalare la corda, è inferiore nel gruppo Sham, rispetto ai gruppi in cui il nervo mediano è ferito.La velocità del ratto, in questo test, aumenta nei ratti, in cui un nervo mediano è autorizzato a riprendersi. Come mostrato in questi grafici a barre, l'analisi dei ratti che camminano, tende a mostrare cambiamenti nella morfologia delle impronte delle zampe. Questi cambiamenti sono spesso più pronunciati, nelle lesioni da schiacciamento che nelle lesioni nervose segmentali.Questo grafico mostra che la termografia sembra essere, uno strumento utile per cercare le differenze di temperatura, tra le avambraccio nei primi 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. Queste differenze di temperatura sono più evidenti, nei ratti con il nervo mediano più gravemente ferito, come in quelli del gruppo di escissione. La forza di flessione del ratto è direttamente correlata, con il grado di recupero nervoso.Essere più vicini alla normalità quando il recupero è massimo, come si può vedere in questi grafici a barre confrontando la forza, in entrambe le zampe nei gruppi escissione e innesto nervoso. Per quanto riguarda l'elettroeuromiografia, si possono osservare vari modelli. Un normale potenziale .M.A.P., è tipico di un topo del gruppo Sham.Mentre la forma polifasica C.M.A.P.is associata, con un grado variabile di lesione del nervo mediano, come accade nella schiacciamento e nei gruppi di innesto nervoso. Nel gruppo dell'Escissione, non c.M.A.P.L'onda e la morfologia del Flexor carpi radialis dipendono dal recupero nervoso mediano. Queste due immagini mostrano questi muscoli, nei gruppi Sham ed Excision.Come mostrato in questo articolo, il nervo mediano del ratto è un comodo modello di lesione e riparazione del nervo periferico. Sono disponibili più strategie standardizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale. Molti di questi non sono invasivi, consentendo la valutazione giornaliera.Infine, le impostazioni fisioterapiche sperimentali, possono simulare il recupero nel contesto clinico, facilitando la stipula dei risultati per la specie umana.

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