Name: Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Scopri come etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi dei pesci teleostei usando la perfusione cardiaca con DiI-fissativo nel modello Oryzias latipes. Questa tecnica semplice e adattabile aiuta a studiare l'anatomia vascolare cerebrale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Dr Shinji Kanda per la dimostrazione di perfusione cardiaca con soluzione fissativa in Medaka, Sig. ra Lourdes Carreon G Tan per l'aiuto con l'allevamento di Medaka, e il signor Anthony Peltier per le illustrazioni. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio di ricerca della Norvegia, Grant Number 248828 (programma Digital Life Norway).

Tutta la manipolazione degli animali è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita, e sotto la supervisione di investigatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione di stock DiI dissolvendo 5 mg di cristallo DiI in 1,5 mL di tubo di plastica con 1 mL di 96% EtOH. Vortex per 30 s e tenere coperto con foglio di alluminio. Nota: La soluzione di azioni DiI può essere conservata al buio a-20 ° c per diversi mesi.</li>
	<li>Preparare il supporto per pesci (Figura 1a) tagliando un pezzo di polistirolo a 5 cm di lunghezza, 3 cm di larghezza e 2 cm di spessore, e incollandolo ad un piatto di plastica di diametro 9 cm. Fare un foro a forma di barca di 3 cm con una lama di bisturi nel polistirolo.</li>
	<li>Preparare il sistema di che irrora (Figura 2) aggiungendo una cannula di plastica lunga 30-50 cm all'estremità dell'ago.</li>
	<li>Preparare 40 mL di soluzione di paraformaldeide fresca al 4% (PFA) diluendo 10 mL di PFA al 16% con 30 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) in un tubo di plastica da 50 mL.</li>
	<li>Preparare 10 mL di soluzione di Fixative/DiI diluendo 1 mL di soluzione di azione DiI in 9 mL di PFA appena preparata 4% in un tubo di plastica da 10 mL. Tenere al buio fino all'uso. Nota: I cristalli DiI che non sono disciolti possono essere conservati nel tubo di soluzione di magazzino, e nuovo etanolo può essere aggiunto per preparare nuova soluzione di stock DiI (vedi passo 1,1).</li>
	<li>
Preparare 50 mL di brodo tricaina (MS-222).
	<ol>
<li>Sciogliere 200 mg di polvere di tricaina in 48 mL di H2O. aggiungere 2 ml di base tris da 1 M (pH 9). Regolare a pH 7 con 1 M HCl e conservare a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire 5 mL di brodo di tricaina in 50 mL di acqua pulita in un piccolo bicchiere.</li>
	<li>Preparare diverse pipette di vetro da 5 cm (Figura 2) allungando un capillare di vetro con un estrattore di pipette seguendo le istruzioni del fabbricante.</li>
</ol>2. dissezione e perfusione
Nota: PFA è un composto volatile tossico, quindi la dissezione e la perfusione devono essere eseguite in un cofano o in una stanza ventilata, e l'utente deve indossare una maschera antigas.
<ol><li>Prepara gli strumenti di dissezione, comprese le piccole forbici, e una pinza affilata e una forte prima della dissezione.</li>
	<li>Riempire la siringa con la soluzione preparata di PFA/DiI posizionandola nel tubo 50 mL e disegnando. Quindi posizionare l'ago con la cannula all'estremità della siringa (Figura 2).</li>
	<li>Fissare la siringa al banco utilizzando diversi pezzi di nastro posizionati in direzioni diverse, regolare la posizione del microscopio e la sede per ottenere una buona posizione per la dissezione e per la pressione del pistone della siringa (Figura 1B). Nota: In questo protocollo, il gomito viene utilizzato per premere il pistone della siringa, ma altre possibilità opzioni possono essere utilizzate, ad esempio, l'assistenza di un'altra persona.</li>
	<li>Euthanize il pesce con un sovradosaggio di tricaina posizionando il pesce nella soluzione preparata al passo 1,7. Attendere 30 s e testare i riflessi del pesce afferrando la sua pinna caudale con le pinze. Il pesce può essere utilizzato quando ha smesso di rispondere agli stimoli.</li>
	<li>Posizionare il pesce nel supporto del pesce con l'addome rivolto verso l'alto e fissare un ago all'estremità della testa e un altro sopra la coda per mantenere il pesce in posizione.</li>
	<li>Aprire l'addome anteriore con le forbici tagliando orizzontalmente lo strato superficiale della pelle.</li>
	<li>Utilizzando pinze, rimuovere la pelle sopra il cuore fino a quando un chiaro accesso al ventricolo e l'arterioso di bulbo è fornito (Figura 3).</li>
	<li>Aggiungere una pipetta di vetro all'estremità del capillare e rompere l'estremità della punta della pipetta di vetro. Nota: Il buco della punta rotta dovrebbe essere abbastanza grande da lasciare il liquido fuori, ma ancora abbastanza piccolo per entrare facilmente nel tessuto. La pipetta di vetro può essere riutilizzata se non rotto o intasato.</li>
	<li>Portare la pipetta di vetro vicino al ventricolo e aggiungere pressione al pistone della siringa con il gomito per forzare il liquido fuori.</li>
	<li>Fissare il ventricolo cardiaco con la pipetta di vetro aggiungendo pressione alla siringa.</li>
	<li>Direttamente dopo, perforare il venoso sinusale con pinze per consentire al sangue di lasciare la circolazione. Nota: Il ventricolo cardiaco diventa più fragile a causa del fissativo. Diventa anche meno rosso come il sangue viene diluito con la soluzione Fixative/DiI.</li>
	<li>Dal ventricolo, regolare l'angolo della pipetta di vetro per trovare l'ingresso del bulbo arterioso. Portare l'apertura della pipetta all'interno dell'arterioso bulbo come mostrato nella Figura 2e aggiungere maggiore pressione alla siringa. Nota: Il bulbo arterioso è trasparente e il tessuto è elastico. Quando si sostituisce il sangue con dii/Fixative, la pipetta di vetro all'interno del cuore dovrebbe diventare più visibile e aggiungendo pressione, la dimensione del bulbo arterioso dovrebbe espandersi. Questo passaggio è cruciale per assicurarsi che sia stata utilizzata una pressione sufficiente per sostituire tutto il sangue con la soluzione fissativa/DiI e che tutti i vasi sanguigni siano stati raggiunti. Spesso quando ha successo, il PFA provoca contrazioni muscolari e il pesce si muoverà.</li>
	<li>Continuare ad aggiungere pressione sulla siringa per 30-60 s ancora mantenendo la pipetta di vetro all'interno del bulbo arterioso.</li>
	<li>Rimuovere la pipetta di vetro e gli aghi dal pesce.</li>
	<li>Dissezionare il cervello e l'ipofisi, e incubare i tessuti in fresco 4% PFA in PBS per 2 h al buio a temperatura ambiente. Nota: La dissezione del cervello e dell'ipofisi in precedenza è stata descritta in dettaglio in due modi diversi da Fontaine et al.26 e Ager-Wick et al.27. A causa della fissazione, il tessuto diventa abbastanza duro e il legame fragile tra il cervello e l'ipofisi può essere rotto. Dopo la dissezione, la lavorazione post-fissazione può essere eseguita anche durante la notte a 4 ° c.</li>
	<li>Sciacquare il tessuto due volte in PBS per 10 minuti prima di prepararsi per l'imaging. Nota: Il tessuto può quindi essere montato tra scivolo e coperchio slittamento con distanziali in mezzo e supporto di montaggio per l'imaging confocale (Vedi Figura 4), o sezionato con un VIBRATOME come descritto in dettaglio in Fontaine et al.26 prima del montaggio tra scivolo e coperchio per l'imaging con uno stereomicroscopio (vedere Figura 4).</li>
</ol>

<ol><li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li>
<li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li>
<li>Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+PJ+%22Brain+energy+metabolism+in+Fundamental+neuroscience%22">Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience</a>. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).</li>
<li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts%2C+with+special+emphasis+on+flatfish+%28Pleuronectiformes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li>
<li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li>
<li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+median+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168(1965).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li>
<li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li>
<li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li>
<li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li>
<li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetic%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).</li>
<li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29+reveals+a+putative+novel+developmental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li>
<li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions%3A+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

La perfusione cardiaca con DiI in precedenza è stata utilizzata per etichettare i vasi sanguigni in diverse specie di modello24, tra cui il pesce teleostico13.
Come DiI è direttamente consegnato alla membrana cellulare endoteliale per perfusione nella vasculatura, è possibile aumentare il rapporto segnale-rumore aumentando la concentrazione DiI nella soluzione fissativa. Inoltre, il fluoroforo fornisce una colorazione intensa quando ec...

I vasi sanguigni giocano una parte essenziale del corpo dei vertebrati in quanto forniscono i nutrienti necessari, ossigeno e segnali ormonali a tutti gli organi. Inoltre, dal momento che la scoperta del loro coinvolgimento nello sviluppo del cancro1, hanno ricevuto molta attenzione nella ricerca clinica. Sebbene alcune pubblicazioni abbiano indagato sui meccanismi che consentono la crescita e la morfogenesi dei vasi sanguigni, e un gran numero di geni importanti per la loro formazione sono stati identificati2, molto resta da intendere per quanto riguarda l'interazione tra cellule o tessuti e il sangue circolante.
La visualizzazione della vasculatura del sangue nel cervello e nell'ipofisi è importante. I neuroni nel cervello richiedono un elevato apporto di ossigeno e glucosio3, e l'ipofisi contiene fino a otto importanti tipi di cellule che producono ormoni che utilizzano il flusso sanguigno per ricevere il segnale dal cervello e inviare i loro rispettivi ormoni a diversi organi periferici4,5. Mentre nei mammiferi, il sistema del portale alla base dell'ipotalamo chiamato l'eminenza mediana, collega il cervello e l'ipofisi6, tale ponte sanguigno chiaro non è stato descritto nel pesce teleostico. Infatti, nei teleosts, i neuroni preoptico-ipotalamici proiettano direttamente i loro assoni nel Pars nervosa dell'ipofisi7 e per lo più innervano i diversi tipi di cellule endocrine direttamente8,9. Tuttavia, alcuni di questi neuroni hanno le loro terminazioni nervose situate nello spazio extravascolare, in prossimità di capillari sanguigni10. Pertanto, la differenza tra il pesce teleostico e i mammiferi non è così chiara, e la relazione tra la vasculatura del sangue e le cellule del cervello e dell'ipofisi richiede una maggiore indagine nel pesce teleostico.
Il zebrafish ha, in molti aspetti, un sistema vascolare anatomicamente e funzionalmente paragonabile ad altre specie di vertebrati11. È diventato un potente modello di vertebrato per la ricerca cardiovascolare principalmente grazie allo sviluppo di diverse linee transgeniche dove i componenti del sistema vascolare sono etichettati con proteine reporter fluorescenti12. Tuttavia, l'anatomia esatta del sistema circolatorio può variare tra le specie, o anche tra due individui appartenenti alla stessa specie. Pertanto, la visualizzazione dei vasi sanguigni può essere di grande interesse anche in altre specie teleostico per le quali non esistono strumenti di transgenesi.
Diverse tecniche sono state descritte per etichettare i vasi sanguigni in entrambi i mammiferi e teleosts. Questi includono l'ibridazione in situ per i geni specifici della vasculatura, la colorazione della fosfatasi alcalina, la microangiografia e le iniezioni di colorante (per una recensione vedere13). Fluorescente lipofilico cationico indocarbocyanine Dye (dii) è stato utilizzato per la prima volta per studiare la mobilità laterale dei lipidi della membrana come viene mantenuto nei bilayer del lipido e può migrare attraverso di essa14,15,16. Infatti, una molecola di DiI è composta da due catene di idrocarburi e croofori. Mentre le catene di idrocarburi si integrano nella membrana a cellule a doppio strato lipidico delle cellule a contatto con esso, i croofori rimangono sulla sua superficie17. Una volta nella membrana, le molecole DiI diffondono lateralmente all'interno del doppio strato lipidico che aiuta a macchiare le strutture della membrana che non sono a diretto contatto con la soluzione DiI. Iniettare una soluzione DiI attraverso la perfusione cardiaca, quindi etichetterà tutte le cellule endoteliali a contatto con il composto permettendo l'etichettatura diretta dei vasi sanguigni. Oggi DiI è utilizzato anche per altri scopi di colorazione, come la singola molecola di imaging, la mappatura del destino, e traccia neuronale. È interessante notare che esistono diversi fluorofori (con diverse lunghezze d'onda di emissione) che consentono la combinazione con altre etichette fluorescenti, e l'incorporazione così come la diffusione laterale di DiI possono verificarsi in entrambi i tessuti dal vivo e fissi18, 19. la
La formaldeide, scoperta da Ferdinand Blum nel 1893, è stata utilizzata ampiamente fino ad oggi come la sostanza chimica preferita per la fissazione dei tessuti20,21. Mostra un'ampia specificità per la maggior parte degli obiettivi cellulari e conserva la struttura cellulare22,23. Conserva anche le proprietà fluorescenti della maggior parte dei fluorofori, e quindi può essere utilizzato per fissare gli animali transgenici per i quali le cellule bersaglio esprimono proteine reporter fluorescenti.
In questo manoscritto, un precedente protocollo sviluppato per etichettare i vasi sanguigni nei piccoli modelli sperimentali di mammiferi24 è stato adattato all'uso nei pesci. L'intera procedura richiede solo un paio di ore per eseguire. Esso dimostra come profumi una soluzione fissativa di formaldeide contenente dii nel cuore del pesce al fine di etichettare direttamente tutti i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi del modello di pesce Medaka. Medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia, che si trova principalmente in Giappone. Si tratta di un organismo modello di ricerca con una suite di strumenti molecolari e genetici disponibili25. Pertanto, l'identificazione dei vasi sanguigni in questa specie così come in altri permetterà di migliorare la nostra comprensione su come il cervello e le cellule ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldeide Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 mL PP/PE senza ago</td><td>Siringhe</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td></tr><tr><td>Aghi per siringa BD Precisionglide Aghi</td><td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>18G (1.20*40)</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato 10 cm OD 1.2 mm</td><td>strumento sutter</td><td>BF120-94-10</td><td>pipetta</td></tr> <tr><td>in vetroDiI (1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocianina perclorato)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE tubo O.D 1,7 mm e I.D 1,1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>canula</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Super gel colla</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un dii-fissativo

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

I vasi sanguigni innervano tutti i tessuti nei vertebrati, permettendo la loro sopravvivenza fornendo i nutrienti necessari, ossigeno, e segnali ormonali. È uno dei primi organi ad iniziare a funzionare durante lo sviluppo. I meccanismi di formazione dei vasi sanguigni sono diventati un argomento di alto interesse scientifico e clinico. Negli adulti, tuttavia, è difficile visualizzare la vascolarizzazione nella maggior parte degli animali viventi a causa della loro localizzazione in profondità all'interno di altri tessuti. Tuttavia, la visualizzazione dei vasi sanguigni rimane importante per diversi studi come l'endocrinologia e la neurobiologia. Mentre diverse linee transgeniche sono state sviluppate nel pesce zebra, con i vasi sanguigni visualizzati direttamente attraverso l'espressione delle proteine fluorescenti, non esistono strumenti simili per altre specie di teleostico. Utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello, il protocollo attuale presenta una tecnica rapida e diretta per etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi che irrora attraverso il cuore con fissativo contenente dii. Questo protocollo consente di migliorare la nostra comprensione su come le cellule cerebrali e ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.

Questo protocollo dimostra una procedura passo per passo per etichettare i vasi sanguigni nel cervello Medaka e ipofisi, e allo stesso tempo fissare il tessuto. Dopo l'etichettatura mediante iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI nel cuore, i vasi sanguigni possono essere osservati su fette utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 4) o su tessuto intero utilizzando un microscopio confocale (Figura 5). Sia sulla fetta di tessut...

L'articolo descrive un protocollo rapido per l'etichettatura dei vasi sanguigni in un pesce teleostico da perfusione cardiaca di DiI diluito in fissativo, utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello e concentrandosi sul tessuto del cervello e dell'ipofisi.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi dei pesci teleost, e usiamo la perfusione cardiaca con un fissatore contenente DiI nella specie modello medaka. Quindi questa tecnica che è semplice ed efficiente aiuterà a rispondere a importanti domande riguardanti l'anatomia vascolare nel cervello e l'ipofisi del pesce teleost, così come la relazione tra neuroni o cellule endocrine e vasi sanguigni. Alcuni vantaggi di questa tecnica includono una preparazione semplice e veloce e la sua adattabilità alle specie ittiche teleost.Per preparare un supporto per pesci, tagliare un pezzo di polistirolo a una lunghezza di cinque centimetri, una larghezza di tre centimetri e uno spessore di due centimetri e incollare il polistirolo a un piatto di plastica di nove centimetri di diametro. Quindi usa un bisturi per fare un buco a forma di barca di tre centimetri nel polistirolo. Per preparare il sistema di perfusione, aggiungere una cannula di plastica lunga da 30 a 50 centimetri all'estremità dell'ago del sistema di perfusione.Per preparare pipette di vetro di cinque centimetri, utilizzare un estrattore di pipetta per allungare i singoli capillari di vetro secondo le istruzioni del produttore. Prima di iniziare la dissezione, caricare una siringa da 10 millilitri con la soluzione dii-fissativa preparata e posizionare un ago con una cannula all'estremità della siringa. Quindi utilizzare diversi pezzi di nastro posizionati in diversi orientamenti per fissare la siringa al banco e regolare la posizione del microscopio e del sedile per ottenere una buona posizione per la dissezione e per premere il pistone della siringa con il gomito.Quindi, posizionare un pesce eutanasiato nell'addome del detentore del pesce lato verso l'alto e fissare la testa e la coda con i perni. Utilizzare le forbici per tagliare orizzontalmente lo strato superficiale della pelle per aprire l'addome anteriore e utilizzare le flessori per rimuovere la pelle sopra il cuore fino a ottenere un chiaro accesso al ventricolo e al bulbo arterioso. Aggiungere un tubo di vetro all'estremità del capillare e rompere la punta della pipetta.Portare il tubo di vetro vicino al ventricolo e aggiungere la pressione del gomito al pistone della siringa per forzare il liquido mentre si fissa il ventricolo cardiaco con la pipetta. Quindi perforare immediatamente il seno velenoso con le forcep per rilasciare il sangue dalla circolazione. Dal ventricolo, regolare l'angolo della pipetta di vetro per localizzare l'ingresso del bulbus arteriosus e spostare l'apertura della pipetta all'interno del bulbus arteriosus.Quindi aggiungere pressione alla siringa per altri 30-60 secondi mantenendo la pipetta all'interno del bulbo arterioso. Per un'etichettatura ottimale di tutti i vasi sanguigni è fondamentale perfondere nel bulbo arterioso abbastanza a lungo da sostituire tutto il sangue con la soluzione dii-fissante. Dopo circa 60 secondi di perfusione, quando non si osservano più perdite di sangue, rimuovere la pipetta di vetro e gli aghi dal pesce e raccogliere il cervello e l'ipofisi in paraformaldeide fresca al 4% per due ore a temperatura ambiente al buio.Quindi risciacquare i tessuti due volte in PBS fresco per 10 minuti per lavaggio prima di preparare i campioni per l'imaging. Dopo l'iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI come dimostrato, i vasi sanguigni etichettati possono essere osservati su fette di tessuto mediante microscopia stereo fluorescente o su tutto il tessuto mediante microscopia confocale. Si noti che se la soluzione viene iniettata nel ventricolo cardiaco al posto del bulbus arteriosus o se la soluzione viene iniettata con una pressione troppo bassa e /o per un periodo troppo breve, si osserverà un'etichettatura inadeguata dei vasi.Inoltre, quando si imaging lo stesso tessuto con gli stessi parametri di imaging, si può osservare una diminuzione dell'intensità di etichettatura dopo diversi giorni, con il segnale che appare più diffuso all'interno del campione di tessuto. Le fette di tessuto provenienti da linee transgeniche all'interno delle quali le cellule di interesse esprimono proteine fluorescenti reporter possono essere ulteriormente etichettate per proteine specifiche di interesse utilizzando protocolli standard di immunofluorescenza che consentono lo studio delle interazioni tra i vasi sanguigni e altri tipi di cellule. È importante raggiungere il bulbus arteriosus.Quando ciò viene ottenuto, l'aggiunta di pressione al pistone della siringa dovrebbe indurre un'espansione del bulbo confermando una procedura riuscita. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare l'interazione tra cellule endocrine e vasi sanguigni nell'ipofisi del teleost in generale, ma forse più specificamente per indagare possibili differenze o somiglianze tra i sistemi portale nel teleost e nei mammiferi. Poiché questo uso politico ha precauzioni di composti tossici e volatili come l'uso di una maschera antigas e di una stanza ventilata, dovrebbe sempre essere preso quando si eseguono queste procedure.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Dimostriamo l'uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman...

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

Qui noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Analisi di anatomia roditore cerebrovascolari svolge un ruolo importante nella ricerca sperimentale ictus. In questo contesto, la perfusione intravascolare con lattice colorato è stato considerato come uno strumento standard per diversi anni. Tuttavia, questa tecnica comporta diverse limitazioni tecniche che mettono a repentaglio la sua riproducibilità. Qui, descriviamo un metodo semplice per visualizzare i vasi cerebrali in modo riproducibile. Iniezione di una miscela di due inchiostri carbon...

Perfusione intravascolare di inchiostro nero di carbonio permette la visualizzazione affidabile dei vasi cerebrali

Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.

Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea

Dimostriamo l'induzione chimica della dilatazione dei grandi vasi sanguigni nei topi come modello per lo studio della disfunzione cerebrovascolare, che può essere utilizzato per la demenza vascolare e la modellazione del morbo di Alzheimer. Dimostriamo anche la visualizzazione del sistema vascolare iniettando un composto di gomma siliconica e fornendo una chiara guida visiva per misurare i cambiamenti nelle dimensioni dei vasi sanguigni.

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

Scopri come etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi dei pesci teleostei usando la perfusione cardiaca con DiI-fissativo nel modello Oryzias latipes. Questa tecnica semplice e adattabile aiuta a studiare l'anatomia vascolare cerebrale.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Esplora altri video