Name: Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Scopri la sintesi enzimatica di acidi grassi epossidici enantiopuri da DHA, EPA e acido arachidonico usando l'enzima BM3. Questo metodo rapido ed economico facilita la ricerca sui meccanismi biologici di questi metaboliti.

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Questo lavoro è finanziato da R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fondi di avvio dalla Michigan State University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jun Yang (Università della California a Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) per l'assistenza con l'ottimizzazione della reazione enzimatica, e il Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectromometria e Metabolomics Facility) per assistenza con l'acquisizione dei dati HRMS.

AVVISO: Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.
1. Espressione di tipo selvaggio BM3
<ol><li>Inoculare pBS-BM3 trasinfezione DH5 E. coli (una generosa donazione dal Dr. F. Ann Walker) in 5 mL di brodo LB sterile con 0,5 mg di ampicillina aggiunto in un tubo di coltura 20 mL.</li>
	<li>Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri/min. Aggiungere la coltura di avviamento notturno (5 mL) e 100 mg di ampicillina a 1 L di brodo Sterile LB in un pallone Fernbach o Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi centigradi per 6 h a 200 giri/min, quindi a 30 gradi centigradi per 18 h a 200 giri/min.</li>
	<li>Raccogliere e centrifugare la coltura cellulare a 4 gradi centigradi per 10 min a 1.000 x g. Scartare il supernatante e conservare il pellet cellulare a -78 gradi centigradi fino alla purificazione degli enzimi. NOTA: Il supernatante può essere sterilizzato chimicamente con il trattamento con candeggina o sterilizzato utilizzando un autoclave e poi versato nello scarico.</li>
</ol>2. Purificazione di BM3.
<ol><li>
Lisi cellulare
	<ol>
<li>Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8). AVVISO: il PMSF è tossico per contatto.</li>
		<li>Mentre sul ghiaccio, sonicare le cellule per 1 min con un omogeneizzatore ad ultrasuoni (impostazione di potenza di uscita 10, dovere 100%), seguita da una rottura di 1 min sul ghiaccio al fine di lisizzare le cellule. Ripetere questa procedura 6 volte. Centrifugare la lisata cellulare a 4 gradi centigradi per 30 min a 11.000 x g per pellet detriti cellulari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografia affinità
	<ol>
<li>Preparare una forte colonna di cromatografia di scambio di anioni (vedi Tabella dei materiali; diametro: 2,8 cm x 6 cm, volume della colonna: 37 mL) lavando con 5 volumi di colonne (CV) del buffer A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere le linguetta delle cellule alla colonna equilibrata e lavare la colonna con 3 CV di tampone freddo A. Elute il BM3 lavando la colonna con tampone freddo B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).</li>
		<li>Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastro. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare il flash con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a -78 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Epossidazione del DHA da parte di BM3
<ol><li>Preparare la reazione aggiungendo 0,308 g (0,940 mmol) di DHA in 18,8 mL di dimeilfossido (DMSO) a 2 L di buffer di reazione di agitazione (0,12 fosfato di potassio, 5 mM MgCl2, pH 7.4) insieme a 20 nM dell'enzima BM3 scongelato. La concentrazione di enzimi può essere determinata dal metodo di analisi spettrale monossido di carbonio/dithionite19.</li>
	<li>Mentre la soluzione si sta agitando, iniziare la reazione aggiungendo 1 equivalente di NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto, sale tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disciolto nel buffer di reazione. Mescolare la reazione per 30 min mentre l'aria bollente attraverso la miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e ago.</li>
	<li>Utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella deimateriali), controllare l'assorbimento della miscela di reazione a 340 nm per determinare se NADPH è esaurito. Se non vi è alcuna assorbimento rimanente che indica il consumo di NADPH, la reazione è completa. NOTA: In genere, la reazione è completa dopo 30 min.</li>
	<li>Spegnire la miscela di reazione aggiungendo lentamente 1 M di acido osalico, dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge 4.</li>
</ol>4. Estrazione di EDP
<ol><li>Estrarre la soluzione tampone spento con 2 L di etere dietillo (anidroso, privo di perossido) 3 volte. Raccogliere lo strato di etere (6 L) e asciugare con solfato di magnesio idroelettrico (MgSO4).</li>
	<li>Filtrare l'MgSO4 dalla soluzione e concentrare lo strato di etere essiccato su un evaporatore rotante per produrre il residuo EDP grezzo.</li>
	<li>Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash (una cartuccia di silice da 40 g è sufficiente). Iniziare al 10% di acetato di etilico (EtOAc) in esagoni e rampa fino al 60% EtOAc in esagoni oltre 22 min. NOTA: Tre picchi principali sono ottenuti e raccolti, eluindo nell'ordine di 1. DHA non reagito; 2. miscela di isomeri EDP; e 3. (normali prodotti di sovraossidazione (cfr. figura 1)).</li>
	<li>Unire le frazioni e concentrarle sull'evaporatore rotativo. Da questo esempio, 0,074 g, (24%) DHA non reagito, 0,151 g (47%) di isomeri EDP, e 0,076 g, (22%) di-epossido sono stati ottenuti.</li>
</ol>5. Esterificazione degli EDP, separazione di 16(S),17(R)- e 19(S),20(R)-EDP e saponificazione degli esteri
AGGIORNAMENTO: Il trimethylsilyldiazometathane (TMS-diazometae) è molto tossico sia per il contatto che per l'inalazione. Utilizzare solo in un cofano di fume con l'attrezzatura protettiva personale adeguata.
<ol><li>Diluire gli epossido (0,151 g, 0,435 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo o piccola fiala con 2 mL di metanolo idrosotro (MeOH) e 3 mL di toluene anidride, aggiungere una barra di stir, e aggiungere TMS-diazometatano (1,2 semilari equivalenti, o 0,26 mL di una soluzione di 2 M in hexanes) sotto argon.</li>
	<li>Attendere 10 min e aggiungere ulteriore TMS-diazometano (0.050 mL) fino a quando non rimane un colore giallo pallido.</li>
	<li>Dopo 30 min, concentrare con cura la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash. Elute con 4% EtOAc in esagoni (utilizzando una colonna di gel di silice o cartuccia 40 g) per 22 min. In questo esempio, 19,20-EDP ester metil (0,116 g, 74%) e 16,17-EDP ester metile (0,029 g, 19%), sono stati ottenuti come oli chiari (rendimento totale, 93%).</li>
	<li>Raccogliere le frazioni contenenti i regioisomers edthyl ester purificati. 19(S), 20(R)-EDP metil ester eluise per prime, seguite da 16(S),17(R)-EDP ester metile.</li>
	<li>Se rimangono frazioni miste (contenenti entrambi gli isomeri; possono essere valutate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) in 8:1 hexane/EtOAc e macchiate con permanganato di potassio (KMnO4)), ri-cromatografate con lo stesso sistema solvente di prima.</li>
	<li>Concentrare le frazioni contenenti i singoli regioisomers. NOTA: a questo punto, l'identità e la purezza possono essere valutate da NMR (utilizzando CDCl3 come solvente; vedere la legenda per la figura 2).</li>
	<li>Per convertire i singoli regioisomers di ester metile EDP alle loro forme acide, diluire l'ester EDP in THF:water (circa 0,7 mL/0,1 mmol di ester). Aggiungere 2 M aqueous LiOH (3 equivalenti molare) e mescolare durante la notte. NOTA: la completezza della reazione può essere valutata da TLC, utilizzando 3:1 exanes/EtOAc, colorazione con KMnO4; il prodotto ha un fattore di ritenzione di 0,3 USD.</li>
	<li>Spegnire lentamente la reazione con l'acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge 3-4. Aggiungere acqua ed acetato etilico (1-2 mL/0,100 mmol di ester) e separare gli strati. Estrarre lo strato d'acqua con EtOAc (3 x 5 mL), lavare con soluzione salamoia satura (NaCl) e asciugare lo strato EtOAc sopra anhydrous solfato di sodio (Na2SO4).</li>
	<li>Concentrare la soluzione di acetato etiliato utilizzando un evaporatore rotante, aggiungere esanei (10 mL) e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per azeotropicale rimuovere l'acido formica residuo. Purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash, eluindo con 10-30% EtOAc oltre 15 min.</li>
	<li>Concentrare le frazioni desiderate e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato. NOTA: In questa fase, la purezza enantiomerica può essere valutata (da HPLC chirale, vedere le leggende per Figura 3 - Figura 4 per colonna e condizioni). La purezza chimica può essere valutata da C18 (achiral) HPLC (vedi Tabella dei materiali e riferimento 14).</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li>
<li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyeicosatrienoic+acids%2C+hypertension%2C+and+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li>
<li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211(2016).</li>
<li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K%28%2B%29-channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li>
<li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li>
<li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+TC+%22Trends+in+the+use+of+complementary+health+approaches+among+adults%3A+United+States%2C+2002%E2%80%932012%22">Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012</a>. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).</li>
<li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li>
<li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li>
<li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins%3A+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-%2C+dihydroxy-%2C+and+epoxy-fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).</li>
<li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhan%2C+MA+%22Method+for+the+synthesis+of+DHA%22">Method for the synthesis of DHA</a>. , WO2012126088A1 (2012).</li>
<li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+synthesis+of+17%2C18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li>
<li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li>
<li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical%2C+enantiospecific+syntheses+of+14%2C15-EET+and+leukotoxin+B+%28vernolic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li>
<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
<li>Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , 
 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
<li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+site+substitution%2C+F87V%2C+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+%2814S%2C+15R%29-arachidonic+acid+epoxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA - 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l'enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l'estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di se...

Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell'acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell'infiammazione1,2 , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5. È interessante notare che gli enantiomeri specifici e i regioisomeri degli epossido di AA e EPA sono noti per avere effetti variabili sull'vasoconstriction6,7. Mentre gli effetti fisiologici degli enantiomeri e dei regioisomeri degli EET e degli EEQ sono stati documentati, si sa poco sull'effetto degli analoghi acidi essidomiomiatori (EDP) formati dal DHA. L'uso diffuso dell'olio di pesce8, che è ricco sia di EPA che di DHA, ha suscitato interesse anche per gli EDP9. I benefici di questi integratori sono creduti per essere in parte a causa dei metaboliti DHA a valle (16,17-EDP e 19,20-EDP essendo il più abbondante) perché in vivo livelli di EDP si coordinano molto bene con la quantità di DHA nella dieta10, 11.
Lo studio dei meccanismi e degli obiettivi di questi acidi grassi epossidici mediante metabolomica, biologia chimica e altri metodi si è dimostrato impegnativo, in parte perché esistono come miscele di regio- e stereo-isomeri, e un metodo per ottenere quantità pure del anti-enantiomeri e regioisomers. I mezzi convenzionali per sintetizzare chimicamente questi composti si sono dimostrati inefficaci. L'uso di perossididi come l'acido meta-cloroperoxybenzoico per l'epossidica ha molti inconvenienti, in particolare la mancanza di selettività dell'epossidazione, che richiede una purificazione costosa e scrupolosa di singoli regiosori e enantiomeri. La sintesi totale dei metaboliti DHA ed EPA è possibile, ma soffre anche di inconvenienti che lo rendono poco pratico per la sintesi su larga scala come i costi elevati e le basse rese12,13. Una produzione complessiva efficiente può essere realizzata con sintesi enzimatica, poiché le reazioni enzimatiche sono regio- e stereoselettive14. Gli studi dimostrano che l'epossidizzazione epossimatica epossimatica di AA ed EPA (con BM3) è sia regiosesesese che enantiosese15,16,17,18, ma questa procedura non è stata testata con DHA, o su un grande scala. L'obiettivo generale del nostro metodo era quello di scalare e ottimizzare questa epossidazione chemiozimatica per produrre rapidamente quantità significative di acidi grassi epossidici puri come loro antiantiomeri individuali. Utilizzando il metodo qui presentato, i ricercatori hanno accesso a una strategia semplice ed economica per la sintesi di EDP e altri metaboliti epossidici PUFA.

<table><tbody><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>Metanolo anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Solfato di sodio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anidro toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acido arachidonico (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Sensibile all'aria.</td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (grado di biologia molecolare)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acido docosaesaenoico (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>Sensibile all'aria.</td></tr><tr><td>EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acido eicosapentaenoico (EPA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>Sensibile all'aria.</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cartucce per colonne Flash da 25, 40, 4, 12 g Fisher</td><td>Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>In alternativa, è possibile utilizzare la cromatografia convenzionale su colonna</td></tr><tr><td>Acido formico (grado HPLC)</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Esani</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Idrossido di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Metanolo (grado HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Sale tetrasodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>sensibile all'aria.</td></tr><tr><td>Acido ossalico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 trasfettato DH5&alfa; E. coli</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>PMSF (fenilmetanosulfonilfluoruro)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Tossico!</td></tr><tr><td>Permanganato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>per la colorazione TLC.</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA Q</td></tr><tr><td>Sepharose Resina a flusso rapido (GE Healthcare life sciences)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Per la purificazione a scambio anionico dell'enzima</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazometano (2,0 M in esani)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Molto tossico.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><tr><td>Necessario anche:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione flash automatico (abbiamo usato un Buchi Reveleris X2)&nbsp;</td>Colonna HPLC <td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td>Centrifuga Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capace di 10.000 x g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna HPLC chirale (Lux cellulosa-3), 250 x 4,6 mm, 5 &; M, 1000 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forniture per la chimica generale: un imbuto separatore da 2 L, becher e palloni di Erlenmeyer con capacità di 1000-2000 L, fiale da 20 mL, fiale HPLC, piccoli palloni a fondo tondo e ancorette.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (utilizziamo una pompa analitica Shimadzu Prominence LC-20AT e un rivelatore UV-vis SPD-20A</td><td>Spettrofotometro Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000...</td><td>Thermo-Fisher Scientific NMR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NMR: Spettrometro Agilent DD2 (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dismembratore sonico o omogeneizzatore ad ultrasuoni</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c'è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D'altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un'efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all'epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l'acido aracidonico (AA) e l'acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l'analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.

Il cromatogramma della colonna flash (eseguito utilizzando un sistema di purificazione flash automatizzato come descritto di seguito) ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidiva esossimatica ezimatica è mostrato nella Figura 1. Dopo l'esterificazione e la separazione dei regioisori, sono stati ottenuti i puri 16(S),17(R)-EDP e 19(S),20(R)-EDP esters metil. In genere, sono presenti in un rapporto appr...

Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l'uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).

Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Quindi il nostro protocollo ci permette di preparare acidi grassi epossidici enantiopure, e questo metodo potrebbe aiutare a far progredire la ricerca sui meccanismi con cui questi metaboliti agiscono nel corpo. Storicamente, gli acidi grassi epossidici puri sono molto difficili da ottenere. Quindi il nostro protocollo è semplice, rapido, conveniente, e ci permette di preparare quantità significative di questi metaboliti.Sì, abbiamo sviluppato un protocollo per il DHA, ma funziona molto bene anche per l'EPA e l'acido arachidonico. Lavora rapidamente, poiché alcuni dei reagenti sono sensibili all'aria, in particolare DHA e NADPH, e assicurati di abbinare tutto in anticipo in modo che la configurazione sia semplice. Inoltre, essere consapevoli dei pericoli.Il nostro protocollo utilizza tecniche sia di chimica della ossigenazione che di chimica organica. La visualizzazione è fondamentale per aiutare i lettori e gli spettatori che non hanno familiarità con le tecniche specializzate in questi campi. Per inoculare, utilizzare un anello sterile o pipetta immerso in brodo di glicerolo di pBS-BM3 trasfetto DH5-alfa E.coli in cinque millilitri di brodo LB sterile integrato con 0,5 milligrammi di ampicillina.Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore a 200 giri/min. Quindi, aggiungere la coltura iniziale di cinque millilitri e 100 milligrammi di ampicillina a un litro di brodo LB sterile in un pallone Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi Celsius per sei ore a 200 giri/min, quindi a 30 gradi Celsius per 18 ore a 200 giri/min.Successivamente, raccogliere la coltura cellulare in tubi di centrifuga e centrifugare la coltura cellulare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.000 volte g. Versare il supernatante in un altro pallone. Decontaminare con candeggina o usando l'autoclave e conservare il pellet cellulare a meno 78 gradi Celsius fino alla purificazione enzimatica.Per eseguire la lisi cellulare, scongelare prima il pellet cellulare sul ghiaccio e rimescolare in 40 millilitri di tampone di solubilizzazione ghiacciato contenente Tris, PMSF ed EDTA. Mentre sei sul ghiaccio, sonicare le cellule per un minuto con un omogeneizzatore ad ultrasuoni, con un'impostazione di potenza in uscita di 10 e un dovere di 100, seguita da una pausa di un minuto sul ghiaccio per liscire le cellule. Ripetere questa procedura sei volte.Centrifugare la cellula lysate a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 11.000 volte g per pellettare i detriti cellulari. Per eseguire la cromatografia di affinità, in una cella frigoriferi o in frigorifero con porta scorrevole, a quattro gradi Celsius, preparare prima una forte colonna di cromatografia a scambio di anione lavando la resina con cinque volumi di colonna di tampone A di Tris da 10 millimolare a pH 7,8. Successivamente, aggiungere il supernatante dei liscivi cellulari alla colonna equilibrata e lavare la colonna con tre volumi di colonna di tampone freddo A.Quindi, elutare il BM3 lavando la colonna con sei volumi di colonna di tampone freddo B di Tris da 10 millimolare e cloruro di sodio 600 millimolare.Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastra. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a meno 78 gradi Celsius.Per eseguire l'epossidazione del DHA, determinare prima la concentrazione dell'enzima BM3 scongelato, secondo il metodo di dosaggio spettrale del monossido di carbonio ditionite. Quindi, in un bicchiere contenente due litri di tampone di reazione che viene mescolato su una piastra di agitazione magnetica, aggiungere 0,94 millimoli di DHA diluiti in 18,8 millilitri di DMSO e l'enzima BM3 diluito a 20 nanomolari. Mentre la soluzione si muove, iniziare la reazione di epossidazione aggiungendo 8,7 millilitri di tampone di reazione contenenti 0,94 millimoli di NADPH.Mescolare la reazione per 30 minuti mentre si gorgoglia aria nella miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e un ago attaccato all'interno del becher. Successivamente, disegnare un microlitro della miscela di reazione e metterlo in uno spettrofotometro NanoDrop per misurare l'assorbanza a 340 nanometri. Usa l'acqua come vuoto.Se non c'è ancora assorbanza, il che indica che il NADPH è stato consumato, la reazione è completa. Dissetare la miscela di reazione aggiungendo lentamente acido ossalico un molare dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge circa quattro. Ora, estrarre la soluzione tampone temprata con due litri di etere dietile anidro e privo di perossido.Utilizzare un imbuto separatore per scuotere e separare gli strati e raccogliere l'etere in un pallone Erlenmeyer. Ripetere altre due volte e aggiungere circa 50 grammi di solfato di magnesio anidro per asciugare l'etere. Su un imbuto filtrante sottovuoto, versare l'etere essiccato per filtrare il solfato di magnesio e trasferire lo strato di etere filtrato in un pallone a fondo rotondo dell'evaporatore rotante.Regolare la velocità di rotazione su media e avviare il vuoto per concentrare il liquido per produrre residui EDP grezzi. Caricare il residuo in una cartuccia di silice da 40 grammi per eseguire la cromatografia a colonna flash utilizzando una macchina automatica per la purificazione del flash. Inizia dal 10% di acetato di etile negli esaani e aumenta fino al 60% di acetato di etile in esani per 22 minuti.Le frazioni vengono raccolte automaticamente in tubi. Quindi, unire le frazioni di ogni picco in un pallone a fondo rotondo, indossare l'evaporatore rotante e iniziare l'evaporazione. Si ottengono tre frazioni, DHA, isomeri EDP e diepossido.Per esterificare gli 0,151 grammi di epossido ottenuti, in un pallone a fondo tondo o in una piccola fiala, aggiungere due millilitri di metanolo anidro e tre millilitri di toluene anidro e aggiungere una barra di agitazione. Collegare il pallone con un palloncino riempito con argon attraverso un setto di gomma e un ago e aggiungere 0,26 millilitri di TMS-diazometano bimolare attraverso una siringa durante l'agitazione. Attendere 10 minuti e aggiungere altri 05 millilitri di TMS-diazometano fino a quando non appare un colore giallo pallido.Dopo 30 minuti, concentrare accuratamente la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e utilizzare una cartuccia a colonna di gel di silice da 40 grammi sulla macchina per la cromatografia flash per purificare il residuo. Eluto con una concentrazione isocratica di acetato di etile al 4% in esani per 22 minuti. Raccogliere prima le frazioni contenenti gli eluati di estere metile purificato 19S, 20R-EDP, seguiti da 16S, 17R-EDP estere metile.Ora, valuta le frazioni per cromatografia a strato sottile in una miscela da otto a uno da esano a etil-acetato. Macchia con permanganato di potassio per verificare la presenza di eventuali frazioni miste contenenti entrambi gli isomeri. Concentrare le frazioni corrispondenti a ciascun picco su un evaporatore rotante, quindi pesare su un bilanciere per determinare la quantità di esteri EDP ottenuti.Se rimangono frazioni miste, ricromatografarle con lo stesso sistema di solventi utilizzato in precedenza. Concentrare ogni frazione contenente il singolo regioisomero su un evaporatore rotante. Per convertire i singoli regioisomeri di estere metile EDP nelle loro forme acide, diluire l'estere EDP in una piccola fiala con circa 0,7 millilitri di THF per 0,1 millimoli di estere, insieme a 0,175 millilitri di acqua.Raffreddare la fiala a zero gradi Celsius in un bagno di ghiaccio, aggiungere tre equivalenti di soluzione di idrossido di litio e mescolare su una piastra di agitazione sotto argon durante la notte mentre si riscalda a temperatura ambiente. Al mattino, dissetare la reazione aggiungendo lentamente acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge i tre o quattro. Quindi, aggiungere acqua e due millilitri di acetato di etile per separare gli strati.Estrarre lo strato d'acqua con 10 millilitri di acetato di etile tre volte, lavare con 20 millilitri di soluzione di salamoia satura e aggiungere diversi grammi di solfato di sodio anidro nella soluzione per asciugare lo strato di acetato di etile. Concentrare la soluzione di acetato di etile utilizzando l'evaporatore rotante, aggiungere 10 millilitri di esaani e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per rimuovere azeotropicamente l'acido formico residuo.Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash, eluificando con acetato di etile dal 10 al 30% per 15 minuti. Concentrare le frazioni desiderate nell'evaporatore rotante e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato. Il cromatogramma a colonna flash ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidazione enzimatica è mostrato qui.Sono stati ottenuti tre picchi principali, che eluivano nell'ordine di, da un primo, DHA non reatto, secondo, miscela di isomeri EDP e, terzo, diepossido, che sono normali prodotti di sovraossidazione. A seguito dell'esterificazione e della separazione dei regioisomeri, gli spettri nmr protonici indicano che sono stati ottenuti esteri metilici ad alta purezza 16S, 17R-EDP e 19S, 20R-EDP. L'HPLC chirale ha confermato la purezza enantiomerica delle forme acide dei GEPD.Assicurarsi di mantenere sterile il brodo durante la manipolazione e l'inoculazione per evitare la contaminazione. L'epossidazione può essere utilizzata per altri acidi grassi. Quindi l'abbiamo provato anche con acidi arachidonico ed eicosapentaenoico, e abbiamo ottenuto buone rese di quegli epossidi di enantiopure, quindi 14, 15-EET e 17, 18-EEQ.Quindi un protocollo che consenta ai ricercatori di accedere agli acidi grassi epossidici potrebbe aiutare nella ricerca sulle funzioni biologiche di questi composti, che potrebbe portare al loro uso come porta farmaci. Le sostanze chimiche pericolose sono il PMSF, pericoloso per contatto, e il TMS-diazometano, che è molto tossico per contatto e inalazione. Quindi quest'ultimo dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante e con adeguati dispositivi di protezione individuale.

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