Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione
6 agosto 2019
La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.
Qui abbiamo applicato la microiniezione di RNA etichettati fluorescentmente per rilevare sequenze di RNA che sono essenziali per la localizzazione di brevi RNA nucleari in strutture nucleari chiamate corpi di Cajal. Questa tecnica ha due vantaggi principali. In primo luogo, può essere applicato per gli RNA brevi che sono altrimenti difficili da etichettare e tracciare.
E in secondo luogo, permette uno screening rapido di diverse sequenze e testa il loro ruolo nella localizzazione dell'RNA. Un giorno prima della microiniezione, seminare HeLa o altre cellule aderenti su coverlips da 12 millimetri per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione. Per iniziare, posizionare un coverslip preparato al centro di una piastra di Petri, aggiungere celle e due millimetri di mezzi di coltura.
Il giorno seguente, posizionare la piastra di Petri riempita di cella su uno stadio di microscopio. Utilizzando un microloader, caricare tre microlitri della miscela di snRNA nell'ago e installare l'ago nel supporto del microiniettore con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie della piastra di Petri. Usa un obiettivo a lunga distanza 10 volte per trovare l'ago.
In primo luogo, impostare la velocità grossolana sull'iniettore e abbassare l'ago fino a tocchi il mezzo di coltura. Usando il binocolo del microscopio, trova il punto luminoso che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura. Cambiare la velocità per multare e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non si osserva la punta dell'ago.
Spostare l'ago al centro del campo visivo e passare a un obiettivo a lunga distanza 40X. Successivamente, selezionare la cella e spostare l'ago sopra la cella. Impostare la pressione e il tempo per il contatto cellulare.
Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore del micromanipolatore. L'impostazione del limite inferiore è la parte più critica del protocollo. Poiché la superficie del coverslip non è perfetta e poiché ogni cella è diversa, dovrai impostare il limite inferiore più volte durante la sessione di iniezione.
Quindi, spostare l'ago sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muoverà automaticamente all'interno della cella nel punto in cui è impostato il limite per iniettare la miscela di RNA. Per finire, premere il pulsante del menu sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto.
Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore. Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un incubatore di anidride carbonica e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente.
Fissare le celle per 20 minuti con paraformaldeide al 4% in 0,1 tubi molari a pH 6,9. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montarlo in un mezzo di montaggio con DAPI.
In caso di localizzazione proteica aggiuntiva, permeabilizzare le cellule con 0,5%Triton X-100 in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e macchiarle con gli anticorpi primari e secondari appropriati come delineato nel protocollo di testo. Quindi risciacquare tre volte con PBS e risciacquare una volta in acqua.
Successivamente, montare le celle in un supporto di montaggio con DAPI. Quando sei pronto per l'immagine, utilizza un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione per acquisire le immagini. Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di sezioni 20 Z con passaggi Z di 200 nanometri per campione e soggette a deconvoluzione matematica.
Per quantificare il segnale fluorescente, aprire prima l'immagine della microscopia in ImageJ e dividere i canali in finestre. Sincronizzare le finestre con lo strumento sincronizza finestra. Successivamente, disegna la regione di interesse attorno a un corpo di Cajal identificato dall'immunosocienza della coilina.
Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla coilina. Determinare l'intensità della fluorescenza dello snRNA nel ROI posta casualmente nel nucleoplasma. Salvare i valori misurati e calcolare il rapporto tra il segnale di RNA nel corpo di Cajal e il nucleoplasma.
In questo studio, gli snRNA etichettati fluorescentmente vengono microiniettati per monitorarne il trasporto all'interno della cellula. Per verificare se il sito SM è importante per l'accumulo del corpo di Cajal, lo snRNA privo del sito SM viene microiniettato direttamente nel nucleo. L'iniezione nel citoplasma funge da controllo mentre lo snRNA a tutta lunghezza viene microiniettato per servire come controllo positivo.
Dopo l'incubazione, le cellule microiniettate vengono fissate e la coilina del marcatore corporeo cajal viene visualizzato dall'immunofluorescenza indiretta. Lo snRNA a tutta lunghezza si è accumulato nei corpi di Cajal dopo iniezioni nucleari e citoplasmatici. Al contrario, lo snRNA privo del sito SM è rimasto nel citoplasma dopo la microiniezione in questo compartimento mentre la microiniezione nucleare di snRNA senza il sito SM rivela che la sequenza di legame SM è importante per la localizzazione del corpo di Cajal in quanto questo snRNA rimane nel nucleo ma non si accumula nei corpi di Cajal.
A volte la microiniezione in un solo compartimento cellulare fallisce e il Dextran 70 kilodalton ingannato può essere trovato sia nel nucleo che nel citoplasma. Queste cellule vengono scartate da ulteriori analisi. Nonostante il fatto che gli snRNA etichettati fluorescentmente siano conservati a -80 gradi Celsius prima dell'iniezione, può verificarsi la degradazione dell'RNA.
Lo snRNA degradato iniettato nel citoplasma non viene trasportato nel nucleo e rimane localizzato nel citoplasma. Tale snRNA deve essere scartato e il nuovo snRNA deve essere sintetizzato. È importante regolare correttamente le pressioni di iniezione e compensazione per il tipo di cella.
E come detto prima, impostare il limite inferiore corretto per l'iniezione cellulare è essenziale per una buona microiniezione. Si prega di ricordare che il fenolo-cloroformio utilizzato durante l'isolamento dell'RNA è pericoloso e che l'ago di microiniezione è un oggetto appuntito. Fare attenzione quando si maneggiano questi materiali.
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Panoramica
Questo studio analizza la biogenesi degli snRNA dello spliceosoma e il loro trasporto all'interno delle cellule, utilizzando la microiniezione di snRNA marcati con fluorocromo. La domanda biologica principale riguarda la localizzazione di questi snRNA in strutture nucleari note come corpi di Cajal, fornendo informazioni sulle sequenze essenziali per una corretta localizzazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
- Localizzazione dell'RNA
Sfondo
- Le snRNA svolgono ruoli fondamentali nello splicing e nella maturazione dell'RNA.
- Comprendere la loro localizzazione può chiarire i meccanismi cellulari coinvolti nella funzionalità dell'RNA.
- I corpi di Cajal sono strutture subnucleari associate alla maturazione delle snRNA.
- La microiniezione consente la manipolazione diretta e l'osservazione di molecole di RNA all'interno di cellule vive.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi di trasporto e localizzazione degli snRNA del spliceosoma.
- Valutare l'importanza di specifiche sequenze di RNA nella determinazione della localizzazione degli snRNA.
- Sviluppare un metodo affidabile per tracciare le molecole di snRNA all'interno delle cellule.
Metodi Utilizzati
- È stata impiegata la tecnica di microiniezione utilizzando snRNA marcati con fluorescenza.
- Le cellule HeLa sono state utilizzate come modello biologico per lo studio della localizzazione delle snRNA.
- Sono stati effettuati vari controlli e aggiustamenti durante il processo di iniezione per garantire accuratezza e affidabilità.
- Le cellule sono state fissate e sottoposte a immunofluorescenza per visualizzare i marcatori del corpo di Cajal.
- La quantificazione dei segnali di fluorescenza è stata eseguita mediante ImageJ per un'analisi dettagliata.
Risultati principali
- snRNA a lunghezza intera localizzata con successo nei corpi di Cajal, confermando la necessità del sito SM per un corretto accumulo.
- snRNA privato del sito SM ha mostrato una localizzazione difettosa nei corpi di Cajal, rimanendo nel citoplasma.
- Le iniezioni di controllo hanno dimostrato schemi di traffico previsti, contribuendo alla validazione dei risultati.
- L'incubazione e l'accurato aggiustamento del metodo di microiniezione sono stati fondamentali per esiti riusciti.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'analisi del trasporto e della localizzazione di snRNA in cellule vive.
- Comprendere i meccanismi di localizzazione dell'RNA aiuta a rivelare potenziali vie di regolazione associate all'attività dell'RNA.
- Le informazioni ottenute da questa ricerca potrebbero contribuire a studi più ampi di biologia molecolare relativi alla funzione dell'RNA e all'organizzazione cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la localizzazione delle snRNA del spliceosoma nei corpi di Cajal fornisce un'analisi meccanicistica dei percorsi di processamento dell'RNA rilevanti per la validazione degli obiettivi nelle terapie a base di acidi nucleici. Il saggio di localizzazione basato sulla microiniezione consente un'analisi rapida dei determinanti di sequenza che regolano il traffico subcellulare, supportando la riduzione precoce dei rischi associati a modalità terapeutiche mirate all'RNA. Questo approccio contribuisce a una maggiore affidabilità predittiva nell'identificazione di elementi funzionali dell'RNA essenziali per l'efficacia terapeutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Analizza gli elementi della sequenza RNA che regolano la localizzazione subcellulare, consentendo la verifica di ipotesi sui domini funzionali nell'RNA snRNA.
- Valore operativo: Permette uno screening rapido di costrutti mutanti per identificare le sequenze essenziali per l'accumulo nei corpi nucleari.
- Valore predittivo: Supporta l'affidabilità del bersaglio collegando specifici motivi RNA a schemi di localizzazione subcellulare validati.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente la valutazione quantitativa del traffico dell'RNA mediante rapporti di intensità di fluorescenza in compartimenti subcellulari definiti.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma riutilizzabile per testare varianti di RNA con letture standardizzate dell'efficienza di localizzazione.
- Prontezza del saggio: Genera output quantitativi basati sull'imaging, adatti alla conferma di risultati positivi in campagne di screening mirate all'RNA.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Stabilisce la compatibilità con sistemi rilevanti per le malattie utilizzando cellule umane HeLa per modellare i meccanismi di localizzazione degli snRNA.
- Valore operativo: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori definendo le relazioni tra sequenza e funzione nel traffico nucleare dell'RNA.
- De-risking predittivo: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella progettazione di terapie a base di RNA mediante la validazione della funzionalità dipendente dalla localizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, consentendo un'analisi sequenza-funzione prima delle fasi di identificazione del capostazione e della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui determinanti di sequenza dell'RNA nella localizzazione subcellulare e la chiarificazione dei percorsi.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante letture quantitative della fluorescenza e metriche di localizzazione riproducibili.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (rapporti di fluorescenza tra corpo di Cajal e nucleoplasma) che consentono l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'uso di modelli cellulari umani e punti finali di localizzazione definiti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità standardizzata per il test della localizzazione dell'RNA applicabile a più programmi bersaglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica delle terapie a base di RNA mediante la validazione della localizzazione sequenza-specifica in compartimenti nucleari funzionali.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità grazie a protocolli controllati di microiniezione, fissazione e analisi quantitativa mediante imaging.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto correlando le caratteristiche della sequenza dell'RNA al traffico subcellulare validato, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli di RNA in base alla competenza dimostrata nella localizzazione, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ambito della microiniezione, della microscopia a fluorescenza e della quantificazione basata su ImageJ.
- È dipendente da sistemi microfluidici di iniezione, microscopi a fluorescenza con capacità di sezione Z e software di deconvoluzione.
- Necessita di standardizzazione della pressione di iniezione, del tempo di incubazione e dei protocolli di fissazione tra diversi operatori e linee cellulari.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si estenda a modelli cellulari non aderenti o primari.
- I limiti pratici includono il rischio di degradazione dell'RNA e l'efficacia variabile delle iniezioni, richiedendo controlli di qualità sull'integrità dell'RNA marcato.
