Name: Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri la microiniezione di snRNA fluorescenti per studiare la localizzazione negli organelli nucleari dei corpi di Cajal nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di identificare le sequenze essenziali per il trasporto corretto degli RNA nucleari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (18-10035S), dal National Sustainability Program I (LO1419), dal sostegno istituzionale (RVO68378050), dal Fondo europeo di sviluppo regionale (C..02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e dall'Agenzia Università Charles (GAUK 134516). Riconosciamo inoltre lo strumento Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportato da sovvenzioni (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Preparazione di snRNA per microiniezione
<ol><li>Preparare un modello di DNA contenente la versione a lunghezza intera o troncata/mutata di snRNA da PCR utilizzando una seguente configurazione PCR: 98 C per 60 s, 98 s per 15 s, 68 gradi C per 30 s, 72 s per 1 min, 98 S per 15 s per 35x e 72 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Il primer in avanti deve contenere una sequenza promotore per la trascrizione in vitro appena a monte del primo nucleotide trascritto. Amplifica la sequenza di snRNA U2 usando il primer in avanti contenente il promotore T7 e il primer inverso, che termina con l'ultimo nucleotide trascritto (vedi Tabella dei materiali per i dettagli).</li>
	<li>Sintetizzare snRNA utilizzando un kit per breve sintesi dell'RNA (vedere Tabella dei materiali per i dettagli) contenente la polimerasi dell'RNA T7. Aggiungere 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analogico (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL di un inibitore dell'RNA e 500-700 ng del modello di DNA per la miscela di reazione e incubazione a 37 C.</li>
	<li>Aggiungere 1 L (2U) di DNase nella reazione e incubare per ulteriori 15 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Isolare lo snRNA mediante estrazione di fenolo acido/cloroformio. Rimuovere la fase superiore dell'acqua e aggiungere 1/10 del volume originale di acetato di sodio da 3 M (pH - 5,2), 3 litri di glicogeno per una migliore visualizzazione del pellet e 2,5 volumi di 100% di etanolo. Incubare per 1 h a -80 gradi centigradi, centrifugare per 10 min a 14.000 x g e 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare il pellet con il 70% di etanolo e sciogliere in 12 gradi di acqua priva di nuclea. La solita resa dell'RNA era di circa 600 ng/mL. Conservare a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Monitorare l'integrità delle snRNA trascritte in vitro da elettrofori gel agarose.</li>
	<li>Prima della microiniezione, diluire l'RNA alla concentrazione finale 200 ng/mL in acqua contenente 10 g/L dextran-TRITC 70 kDa.</li>
</ol>2. Celle
<ol><li>Prima dell'uso, trattare i copricopro con 1 M HCl per 1 h, lavare accuratamente in acqua distillata e conservare in 100% etanolo. Il trattamento acido promuove l'adesione delle cellule per prevenire il peeling cellulare durante o dopo l'iniezione. Per facilitare l'identificazione delle cellule iniettate, utilizzare un coverslip con una griglia.</li>
	<li>Seme HeLa o altre cellule aderenti 1 giorno prima della microiniezione su copricapelli 12 mm (n. 1 o 1,5) per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione.</li>
</ol>3. Iniezione
 NOT:</</c0> Le cellule di HeLa sono state microiniettate nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, 4,5 g/L D-glucosio contenente fenolo rosso e antibiotici). L'iniezione è stata effettuata utilizzando un iniettore e un micromanipolatore dotato dell'ago sterile (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). L'intero sistema microscopico/micromanipolatore è stato preriscaldato a 37 gradi per almeno 4 h per prevenire la fluttuazione di singole parti del microscopio e del microiniettore.
<ol><li>Mettere il piatto Petri (30 mm) contenente 2 mL di supporti di coltura con la coverslip al centro nel supporto del microscopio. Caricare 3 -L l di miscela di snRNA nell'ago utilizzando un microloader. Installare l'ago nel supporto del microiniettore in 45 gradi rispetto alla superficie della parabola Petri.</li>
	<li>Per trovare l'ago, utilizzare un obiettivo a lunga distanza 10x. In primo luogo, impostare la velocità COARSE sull'iniettore e abbassare l'ago fino a toccare il mezzo di coltura. Utilizzando il binocolo al microscopio, trovare il punto luminoso, che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura.</li>
	<li>Modificare la velocità in FINE e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non viene osservata la punta dell'ago. Spostare l'ago nel mezzo del campo visivo e passare a un obiettivo di 40 volte a lunga distanza.</li>
	<li>Dopo aver modificato l'obiettivo, selezionare la cella e spostare l'ago sopra questa cella. Impostare le pressioni e il tempo per il contatto cellulare (vedere Suggerimenti e risoluzione dei problemi nella discussione).</li>
	<li>Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore sul micromanipolatore. Fare attenzione a non spostare l'ago sotto la cella.</li>
	<li>Dopo aver impostato il limite inferiore, spostare l'ago indietro sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muove automaticamente all'interno della cellula nel punto in cui è impostato il limite e inietta la miscela di RNA.</li>
	<li>Per finire, premere il pulsante MENU sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto. Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore.</li>
</ol>4. Fissazione e colorazione delle cellule
<ol><li>Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un'incubatrice di CO2 e incubare a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, sciacquare le cellule tre volte con soluzione salina tampolata di fosfato (PBS) a temperatura ambiente, fissare per 20 min con 4% paraformaldeide in 0,1 M PIPES pH 6,9, e lavare tre volte con temperatura ambiente PBS. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montare in un supporto di montaggio con DAPI.</li>
	<li>In caso di ulteriore localizzazione delle proteine, permeabilizzare le cellule con 0,5% Triton-X100 in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Dopo tre risciacqui con PBS, incubare le cellule con anticorpi primari e secondari e dopo i lavamenti finali in PBS e un breve risciacquo in acqua, montare in un supporto di montaggio con DAPI.</li>
</ol>5. Microscopia
<ol><li>Se non viene immagine subito dopo il montaggio, conservare i vetrini a 4 gradi centigradi fino all'imaging.</li>
	<li>Acquisire immagini utilizzando un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione (60X o 100x/1.4NA).</li>
	<li>Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di 20 z-sezioni con passaggi da 200 nm z per campione e soggetti a deconvoluzione matematica. Sono state poi presentate proiezioni massime o singole pile di z.</li>
	<li>Per quantificare il segnale fluorescente, disegnare Regione di Interesse (ROI) intorno a un corpo cajal identificato dall'immunostaining a bobina. Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla bobina. Successivamente determinare l'intensità della fluorescenza snRNA nel ROI collocato in modo casuale nel nucleoclasmo e calcolare il rapporto del segnale di RNA nel corpo di Cajal e nucleoclasmo.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per determinare sequenze importanti per la localizzazione del snRNA nei corpi nucleari di Cajal. Grazie alla rapida e piuttosto semplice preparazione degli RNA etichettati (preparazione del modello di DNA da PCR seguita dalla trascrizione in vitro) il metodo offre un'analisi efficace di come le varie sequenze contribuiscono alla localizzazione dell'RNA. In tempi relativamente brevi, siamo stati in grado di analizzare dieci diverse eliminazioni o sostituzioni dello...

Lo splicing dell'RNA è uno dei passi cruciali nell'espressione genica, catalizzata da un grande complesso di ribonucleoproteina chiamato slicsome. In totale, più di 150 proteine e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) sono integrati nello spliceosome nelle diverse fasi del percorso di giunzione. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA stanno partecipando alla giunzione dei principali introni GU-AG. Questi snRNA si uniscono allo spliceo come piccole particelle di ribonucleoproteina nucleare preformate (snRNP) che contengono snRNA, sette proteine Sm associate allo snRNA (o alle proteine Like-Sm, che si associano allo snRNA U6) e 1-12 proteine specifiche per ogni snRNP.
L'assemblaggio di snRNP comporta stadi citoplasmatici e nucleari. Lo snRNA appena trascritto viene esportato nel citoplasma dove acquisisce un anello assemblato da sette proteine Sm. L'anello Sm successivamente funge da segnale per la reimportazione dello snRNA nel nucleo. Gli snRNA difettosi che non riescono ad associarsi alle proteine Sm vengono conservati nel citoplasma1. Gli snRNP appena importati appaiono per la prima volta nel corpo di Cajal dove incontrano proteine specifiche snRNP e terminano la loro maturazione (rivisto nel riferimento2,3). Recentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione delle fasi di maturazione finale si traduce nel sequestro di snRNP immaturi nei corpi di Cajal4,5. Abbiamo proposto un modello in cui la maturazione finale dello snRNP è sotto controllo di qualità che monitora l'aggiunta di proteine specifiche snRNP e la formazione di snRNP attivi. Tuttavia, i dettagli molecolari di come le cellule distinguono tra particelle immature mature e aberranti correttamente assemblate rimangono sfuggenti.
Per determinare le sequenze di snRNA che sono essenziali per il targeting e l'accumulo di snRNA nei corpi nucleari di Cajal, abbiamo deciso di impiegare la microiniezione di snRNA fluorescentmente etichettati. La microiniezione è stato un metodo di scelta perché: 1) non richiede un tag di sequenza aggiuntivo per distinguere gli snRNA sintetici che formano le loro controparti endogene, il che è particolarmente importante per gli RNA brevi con poco spazio per l'inserimento di sequenze di tag extra; 2) permette l'analisi di sequenze che sono importanti per la biogenesi. Ad esempio, la sequenza Sm è essenziale per l'assemblaggio dell'anello Sm e reimportata nel nucleo6. Quando i snRNA sono espressi nella cellula, i snRNA privi della sequenza Sm sono degradati nel citoplasma e non raggiungono il nucleo e i corpi Cajal7. Tuttavia, gli snRNA senza la sequenza Sm possono essere microiniettati direttamente nel nucleo e quindi un potenziale ruolo della sequenza Sm nella localizzazione del corpo di Cajal analizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un metodo di microiniezione che abbiamo applicato per determinare le sequenze snRNA necessarie per indirizzare gli snRNA nel corpo di Cajal5. Abbiamo dimostrato che i siti di legame Sm e SMN sono insieme necessari e sufficienti per localizzare non solo snRNA ma vari RNA brevi non codificanti nel corpo di Cajal. Sulla base di microiniezione e di altre prove, abbiamo proposto che l'anello Sm assemblato sul sito di rilegatura Sm è il segnale di localizzazione del corpo Cajal.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Concentrazione di riserva 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio - alto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Contenente 4,5 g&frasl; L D-glucosio, fenolo rosso e antibiotici</td></tr><tr><td>FemtoJet express Iniettore</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Ago per microiniezione da 0,5 &; m interno e 0,7 &micro; m diametro esterno</td></tr><tr><td>Fluoromont G con DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Concentrazione di riserva 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro grigliato</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Vetrini coprioggetti con griglia, nessuna esperienza diretta con loro</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Micromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G analogo del cappuccio trimetilato</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Concentrazione di riserva 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Kit di trascrizione</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio 12 mm, n. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Per lavori di routine</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio 12 mm, n. 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Per alte immagini di risoluzione</td></tr><tr><td>Microscopio DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Per l'acquisizione</td></tr><tr><td>delle immagini Microscopio DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 32% Grado EM</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>Disciolto in TUBI alla concentrazione finale 4%</td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Primer per l'amplificazione U2: Avanti: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Inverso: 5&acuto; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 sequenza promotore in corsivo</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Concentrazione madre 40 mM</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina isotiocianato destrano 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Disciolto in acqua, concentrazione madre 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Disciolto in acqua, concentrazione madre 10%</td></tr></tbody></table>

analisi della localizzazione snrna spliceosomic nelle cellule umane di hela utilizzando la microiniezione

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l'ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l'accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all'interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell'RNA all'interno delle cellule. Qui, mostriamo l'importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.

Per monitorare la localizzazione dello snRNA e il ruolo del sito di legame Sm nel targeting del corpo di Cajal, abbiamo preparato un modello di DNA contenente il promotore T7 e il snRNA U2 o U2 a piena lunghezza che mancano i sette nucleotidi (AUUUUUGUG) che formano il sito di legame Sm. gli snRNA sono stati trascritti in vitro, isolati e mescolati con dextran-70kDa accoppiato a TRITC. Abbiamo microiniettato la miscela contenente snRNA trascritto in vitro nel nucleo o il citoplasma delle cellule HeLa.
<p class="jove_...

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Qui abbiamo applicato la microiniezione di RNA etichettati fluorescentmente per rilevare sequenze di RNA che sono essenziali per la localizzazione di brevi RNA nucleari in strutture nucleari chiamate corpi di Cajal. Questa tecnica ha due vantaggi principali. In primo luogo, può essere applicato per gli RNA brevi che sono altrimenti difficili da etichettare e tracciare.E in secondo luogo, permette uno screening rapido di diverse sequenze e testa il loro ruolo nella localizzazione dell'RNA. Un giorno prima della microiniezione, seminare HeLa o altre cellule aderenti su coverlips da 12 millimetri per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione. Per iniziare, posizionare un coverslip preparato al centro di una piastra di Petri, aggiungere celle e due millimetri di mezzi di coltura.Il giorno seguente, posizionare la piastra di Petri riempita di cella su uno stadio di microscopio. Utilizzando un microloader, caricare tre microlitri della miscela di snRNA nell'ago e installare l'ago nel supporto del microiniettore con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie della piastra di Petri. Usa un obiettivo a lunga distanza 10 volte per trovare l'ago.In primo luogo, impostare la velocità grossolana sull'iniettore e abbassare l'ago fino a tocchi il mezzo di coltura. Usando il binocolo del microscopio, trova il punto luminoso che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura. Cambiare la velocità per multare e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non si osserva la punta dell'ago.Spostare l'ago al centro del campo visivo e passare a un obiettivo a lunga distanza 40X. Successivamente, selezionare la cella e spostare l'ago sopra la cella. Impostare la pressione e il tempo per il contatto cellulare.Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore del micromanipolatore. L'impostazione del limite inferiore è la parte più critica del protocollo. Poiché la superficie del coverslip non è perfetta e poiché ogni cella è diversa, dovrai impostare il limite inferiore più volte durante la sessione di iniezione.Quindi, spostare l'ago sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muoverà automaticamente all'interno della cella nel punto in cui è impostato il limite per iniettare la miscela di RNA. Per finire, premere il pulsante del menu sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto.Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore. Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un incubatore di anidride carbonica e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente.Fissare le celle per 20 minuti con paraformaldeide al 4% in 0,1 tubi molari a pH 6,9. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montarlo in un mezzo di montaggio con DAPI.In caso di localizzazione proteica aggiuntiva, permeabilizzare le cellule con 0,5%Triton X-100 in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e macchiarle con gli anticorpi primari e secondari appropriati come delineato nel protocollo di testo. Quindi risciacquare tre volte con PBS e risciacquare una volta in acqua.Successivamente, montare le celle in un supporto di montaggio con DAPI. Quando sei pronto per l'immagine, utilizza un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione per acquisire le immagini. Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di sezioni 20 Z con passaggi Z di 200 nanometri per campione e soggette a deconvoluzione matematica.Per quantificare il segnale fluorescente, aprire prima l'immagine della microscopia in ImageJ e dividere i canali in finestre. Sincronizzare le finestre con lo strumento sincronizza finestra. Successivamente, disegna la regione di interesse attorno a un corpo di Cajal identificato dall'immunosocienza della coilina.Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla coilina. Determinare l'intensità della fluorescenza dello snRNA nel ROI posta casualmente nel nucleoplasma. Salvare i valori misurati e calcolare il rapporto tra il segnale di RNA nel corpo di Cajal e il nucleoplasma.In questo studio, gli snRNA etichettati fluorescentmente vengono microiniettati per monitorarne il trasporto all'interno della cellula. Per verificare se il sito SM è importante per l'accumulo del corpo di Cajal, lo snRNA privo del sito SM viene microiniettato direttamente nel nucleo. L'iniezione nel citoplasma funge da controllo mentre lo snRNA a tutta lunghezza viene microiniettato per servire come controllo positivo.Dopo l'incubazione, le cellule microiniettate vengono fissate e la coilina del marcatore corporeo cajal viene visualizzato dall'immunofluorescenza indiretta. Lo snRNA a tutta lunghezza si è accumulato nei corpi di Cajal dopo iniezioni nucleari e citoplasmatici. Al contrario, lo snRNA privo del sito SM è rimasto nel citoplasma dopo la microiniezione in questo compartimento mentre la microiniezione nucleare di snRNA senza il sito SM rivela che la sequenza di legame SM è importante per la localizzazione del corpo di Cajal in quanto questo snRNA rimane nel nucleo ma non si accumula nei corpi di Cajal.A volte la microiniezione in un solo compartimento cellulare fallisce e il Dextran 70 kilodalton ingannato può essere trovato sia nel nucleo che nel citoplasma. Queste cellule vengono scartate da ulteriori analisi. Nonostante il fatto che gli snRNA etichettati fluorescentmente siano conservati a -80 gradi Celsius prima dell'iniezione, può verificarsi la degradazione dell'RNA.Lo snRNA degradato iniettato nel citoplasma non viene trasportato nel nucleo e rimane localizzato nel citoplasma. Tale snRNA deve essere scartato e il nuovo snRNA deve essere sintetizzato. È importante regolare correttamente le pressioni di iniezione e compensazione per il tipo di cella.E come detto prima, impostare il limite inferiore corretto per l'iniezione cellulare è essenziale per una buona microiniezione. Si prega di ricordare che il fenolo-cloroformio utilizzato durante l'isolamento dell'RNA è pericoloso e che l'ago di microiniezione è un oggetto appuntito. Fare attenzione quando si maneggiano questi materiali.

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L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Qui, descriviamo un in situ di ibridazione test che consente la rivelazione sensibile e specifica delle sequenze più breve 50 nucleotidi con risoluzione del singolo-nucleotide a livello di singola cellula. L'analisi, che possono essere eseguita manualmente o automaticamente, può abilitare la visualizzazione delle varianti di splicing, brevi sequenze e mutazioni all'interno del contesto del tessuto.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.

Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione

Questo protocollo descrive la preparazione dettagliata e a basso input del campione per il sequenziamento a nucleo singolo, compresa la dissezione dei gangli cervicali e stellati superiori del topo, la dissociazione cellulare, la crioconservazione, l'isolamento del nucleo e il codice a barre hashtag.

Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

Scopri la microiniezione di snRNA fluorescenti per studiare la localizzazione negli organelli nucleari dei corpi di Cajal nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di identificare le sequenze essenziali per il trasporto corretto degli RNA nucleari.

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

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