Name: Purificazione delle piastrine dal sangue del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Impara a purificare le piastrine dal sangue del topo utilizzando centrifugazione a gradiente di iohexol. Questo metodo consente di ottenere piastrine vitali per analisi di citometria a flusso e studi di attivazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Start-up della Cincinnati Children ' s Research Foundation e da una sovvenzione traslazionale pilota dell'Università di Cincinnati a M.N. Vorremmo ringraziare il Cincinnati Children ' s Hospital Research Flow citometria core per i loro servizi.

La raccolta del sangue del topo deve essere condotta con un'adeguata assistenza istituzionale e l'approvazione del Comitato di uso.
Nota: Il protocollo di purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso in Figura 1.
1. raccolta di sangue
<ol><li>Aggiungere 25 μL di 3,2% citrato di sodio (pH 7,2) come un anticoagulante e 0,4 mM di Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in un tubo di polipropilene.</li>
	<li>
Raccogliere circa 200 μL di sangue dal mouse topi C57BL/6 usando un sanguinamento retro-orbitale. Nota: il sangue può essere raccolto da qualsiasi tipo di ceppo del topo indipendentemente dall'età o dal sesso.<ol>
<li>Utilizzare 2 mL di isoflurano in qualsiasi tipo di camera per anestetizzare il mouse. Nota: La profondità dell'anestesia è verificata da segni di aumento della respirazione e diminuzione del movimento. Il mouse non deve rispondere al movimento della camera di anestesia, o di essere manipolato. Se il mouse è reattivo al movimento o alla manipolazione, allora richiede più tempo per tenere nella camera di anestesia.</li>
		<li>1.2.2 aprire la palpebra destra o sinistra del mouse e inserire un tubo capillare di 7,5 cm (0,12 cm di diametro) nel plesso vascolare dell'occhio.</li>
		<li>Ruotare il tubo capillare di un mezzo giro mentre si applica la pressione al tubo capillare per rompere i vasi e avviare il flusso sanguigno. Tenere l'animale capovolto sopra il flaconcino di raccolta per essere riempito con l'azione capillare.</li>
		<li>Una volta che il volume appropriato di sangue viene raccolto, rimuovere il tubo capillare e chiudere l'occhio applicando una lieve pressione per 30 s sulla palpebra con garza. Una volta che il sanguinamento è fermato, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare il sanguinamento.</li>
		<li>Controllare gli occhi per trauma 1-2 giorni dopo il sanguinamento retro-orbitale. Rimuovere qualsiasi topo dallo studio mostrando segni di trauma significativo per l'occhio a seguito della procedura e eutanasia. Nota: Il topo non deve subire alcun tipo di trattamento che possa inibire le piastrine per almeno due settimane prima della raccolta del sangue. Il campione di sangue deve essere usato per la purificazione piastrinica entro un'ora dal sanguinamento del topo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificazione piastrinica
Nota: La purificazione piastrinica deve essere effettuata a temperatura ambiente per prevenirne la degradazione. Accertarsi che la temperatura dei reagenti e degli strumenti sia compresa tra 18 e 22 ° c. Per prevenire la degradazione piastrinica, il pipettaggio rapido e l'agitazione vigorosa devono essere evitati durante la procedura.
<ol><li>Aggiungere 600 μl di Ioexolo gradiente medio (12% polvere di Ioexolo in 0,85% cloruro di sodio, 5 mm tRiCiNa, pH 7,2)11 in un tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Aggiungere 200 μl di campione di sangue lentamente lungo il lato del tubo sopra il supporto del gradiente con una punta di pipetta di ampio diametro in modo che il sangue e il mezzo di Ioexolo non si miscelino (Figura 2a).</li>
	<li>Centrifugare il campione contenente il tubo a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c in un rotore a benna oscillante con accelerazione lenta e decelerazione.</li>
	<li>Raccogliere la maggior parte dello strato ricco di piastrine e una piccola frazione di strato povero di piastrine (Totale 300 a 400 μL) utilizzando una punta di pipetta largo foro senza disturbare gli strati di RBC e WBC (Figura 2B). Trasferire il campione di piastrine in un nuovo tubo. Nota: Se la conta piastrinica è meno nel sangue o si utilizza un volume più piccolo di sangue, lo strato ricco di piastrine e lo strato povero di piastrine possono essere visti come un singolo strato.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS al campione piastrinico, mescolare invertendo e centrifugare a 800 x g per 10 min a 20 ° c in un rotore a benna oscillante. Eliminare completamente la soluzione e aggiungere 200 μL di PBS per risospendere le piastrine con un pipettaggio delicato. Nota: Questo passaggio è facoltativo, in quanto rimuove il gradiente medio e le proteine plasmatiche e aumenta la sensibilità delle piastrine agli agonisti come la trombina. Poiché diverse centrifughe hanno programmi diversi, la lenta accelerazione/decelerazione può essere determinata leggendo il manuale d'uso della centrifuga.</li>
	<li>Trasferire 30 μL di questo campione in un nuovo tubo per contare le piastrine. Le piastrine rimanenti possono essere utilizzate per saggi biochimici e fisiologici come l'attivazione piastrinica, l'aggregazione, il rilascio di granulo, ecc.</li>
	<li>Per l'estrazione di RNA o proteine, centrifugare il campione piastrinico a 800 x g per 10 minuti per pellet le piastrine. Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume desiderato di RNA o tampone di lisi proteica per lizzare le piastrine.</li>
</ol>3. conteggio delle piastrine
<ol><li>Contare le cellule del sangue intere senza diluizione e piastrine purificate (diluito da 2 a 5 volte con PBS) utilizzando un analizzatore cellulare automatizzato. Utilizzare da 30 a 50 μL di campioni per il conteggio.</li>
	<li>Calcolare il numero totale di piastrine moltiplicando per il volume del campione.</li>
	<li>Calcolare la percentuale di rendimento/recupero delle piastrine depurata.</li>
	<li>Conta il RBC e il WBC nel campione piastrinico purificato (diluito 50 a 100 volte con PBS) con un emocytometro e un microscopio.</li>
</ol>4. attivazione piastrinica
<ol><li>In un tubo, aggiungere 1 a 2 milioni piastrine purificate in fino a 100 μL di tampone di colorazione (PBS con 2% siero bovino fetale, FBS).</li>
	<li>Per un numero multiplo di campioni, fare un Master mix di anticorpi con 1 μL (0,5 mg/mL) dei seguenti: PE-Cy7 Rat anti-topo TER 119, PE ratto anti-topo CD45, FITC Rat anti-topo CD41, e APC Rat anti-topo/CD62P umano (P-selectin) per rilevare RBC, WBC, piastrine, e piastrine attivate, rispettivamente. Aggiungere la miscela master ai tubi per la colorazione delle cellule. Non aggiungere trombina.</li>
	<li>In un altro tubo, aggiungere 1 a 2 milioni di piastrine purificate in fino a 100 μL di tampone di colorazione, e 0,4 mM GPRP peptide. Aggiungere la trombina per attivare le piastrine e macchiare le cellule dopo il passo 4,2. Nota: GPRP deve essere aggiunto al campione prima di aggiungere la trombina per prevenire l'aggregazione o la formazione di coaguli attraverso l'attivazione piastrinica. La concentrazione di trombina deve essere ottimizzata per ottenere una buona attivazione delle piastrine. Dopo l'attivazione piastrinica, i conteggi degli eventi sono diminuiti durante l'acquisizione di campioni mediante citometria a flusso.</li>
	<li>Come controllo positivo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un buffer di colorazione fino a 100 μL in un tubo e 0,4 mM di peptide GPRP. Aggiungere la trombina per attivare le piastrine. Come controllo negativo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un massimo di 100 μL di tampone di colorazione. Non aggiungere trombina nel campione di controllo negativo. Macchia le cellule seguendo il passo 4,2.</li>
	<li>Per il controllo degli isotipi di citometria a flusso, etichettare 5 provette con non macchiate, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Aggiungere 100 μL di tampone di colorazione, 1 μL di sangue e 1 μL del rispettivo anticorpo ai tubi etichettati per macchiare le cellule.</li>
	<li>Incubare i campioni per macchiare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare i campioni aggiungendo 1 mL di tampone di colorazione a ciascun tubo. Centrifugare a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare accuratamente il tampone di colorazione senza rimuovere il pellet.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di tampone di colorazione a ciascun tubo, mescolare lievemente e trasferirlo in un tubo FACS. Conservare i campioni macchiati al buio fino a quando analizzati con un citometro di flusso.</li>
</ol>5. analisi della citometria a flusso delle piastrine
<ol><li>
Creare un nuovo esperimento e generare log in avanti dispersione vs log scatter dot plot e assegnare cancelli per Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (piastrine), e CD62P APC (piastrine attivate) popolazioni secondo la strategia di gating scelto per il sperimentare nel software FACS DIVA.
	<ol>
<li>Aprire la gerarchia di popolazione scegliendo Mostra gerarchia di popolazione nella scheda popolazioni . modificare la gerarchia di popolazione controllando la strategia di gating e rinominando correttamente i cancelli.</li>
		<li>Aprire la visualizzazione delle statistiche scegliendo Crea vista statistiche. Modificare la visualizzazione delle statistiche in base alle preferenze dell'utente facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla visualizzazione statistiche e selezionando Modifica vista statistiche.</li>
		<li>Scegliere un colore per ogni cancello che migliora l'aspetto visivo del layout facendo doppio clic sulla casella corrispondente alla popolazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nella finestra del cytometer , fare clic sulla scheda parametri e regolare le tensioni per i parametri per visualizzare la popolazione di interesse sui grafici.</li>
	<li>Regolare le tensioni per ciascuno dei parametri in modo che la popolazione negativa possa essere distinta dalla popolazione positiva. Prima di registrare i campioni per il controllo della compensazione, verificare che i controlli positivi a singola macchiatura siano su scala (assicurarsi che i picchi positivi siano visibili e non troppo distanti a destra). Nota: Se i picchi positivi sono fuori scala, le tensioni devono essere regolate per vedere le popolazioni positive.</li>
	<li>Registrare le celle colorate monocolore per i controlli di compensazione (non macchiate, PE-Cy7, PE, FITC e APC).</li>
	<li>Se i cancelli di controllo positivi non sono impostati correttamente, regolarli cambiando le tensioni.</li>
	<li>Passare all' esperimento &Gt; impostazione della retribuzione &Gt; calcola retribuzione. Scegliere applica solo nella finestra risultante.</li>
	<li>Passare al foglio di lavoro globale facendo clic sul pulsante di attivazione/disattivazione nella parte superiore, a sinistra della finestra del foglio di lavoro.</li>
	<li>Caricare il campione di controllo positivo e acquisire abbastanza celle per regolare la compensazione e le porte.</li>
	<li>Caricare nuovamente il campione e verificare che ogni trama mostri la popolazione cellulare prevista in base all'anticorpo macchiato fluorocromo. Acquisisci e registra 100.000 eventi per campioni di sangue interi e 10.000 eventi per piastrine depurata. Caricare i campioni uno per uno fino al completamento dell'acquisizione.</li>
	<li>Analizzare i dati di citometria del flusso con il software con trame e cancelli appropriati (Figura 3)</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Comunemente, le piastrine sono isolate da centrifugazione a bassa velocità che produce plasma ricco di piastrine che contiene un numero significativo di cellule del sangue, detriti cellulari e proteine plasmatiche che possono interferire con i saggi biochimici e fisiologici e le esigenze ulteriore purificazione21. Pertanto, è importante utilizzare un metodo rapido e semplice che può produrre piastrine pure senza contaminanti principali. Il protocollo qui presentato descrive la purificazione delle ...

Le piastrine sono un componente di sangue che funge da iniziatore della coagulazione del sangue in risposta a danni nel vaso sanguigno. Si riuniscono nel sito di lesione per collegare la parete del vaso1. Le piastrine sono frammenti anucleati di citoplasma derivati dai megacariociti del midollo osseo sotto l'influenza della trombopoietina e entrano nella circolazione2. Sono considerati metabolicamente attivi e capaci di rilevare l'ambiente extracellulare attivando le cascate di segnalazione intracellulare che provocano la diffusione piastrinica, l'aggregazione e la formazione di spine emostatiche1,3. Oltre a emostasi/trombosi e guarigione delle ferite4, le piastrine svolgono un ruolo importante nelle risposte infiammatorie dell'ospite, nell'angiogenesi e metastatis3,5,6,7, 8. il
Le piastrine vengono purificate dal sangue per studiare le loro proprietà biochimiche e fisiologiche, che dovrebbero essere libere da altri componenti del sangue. Poiché i globuli rossi (RBC) e globuli bianchi (WBC) contengono significativamente più RNA e proteine rispetto alle piastrine9,10, la presenza di anche un piccolo numero di queste cellule può interferire con le analisi trascrittomiche e proteomica di RNA e proteine derivate dalle piastrine. Abbiamo scoperto che le piastrine purificate attivate con anticorpo trombina legano come anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e anti-P-selectin in modo più efficiente rispetto alle piastrine intere del sangue.
Poiché le piastrine sono fragili, è importante trattare i campioni nel modo più delicato possibile. Se le piastrine sono attivate, rilasciano il loro contenuto di granulo e infine degradano. Pertanto, per mantenere intatte le proprietà funzionali delle piastrine, è importante mantenere la quiescenza piastrinica durante l'isolamento. Diversi protocolli hanno descritto l'isolamento delle piastrine dal primate umano, cane, ratto e non umano con vari metodi1,10,11,12. Alcuni dei metodi richiedono più passaggi, come la raccolta di plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione, filtrazione per colonna di separazione, selezione negativa di piastrine con RBC-e anticorpo WBC-specifico coniugato a perle magnetiche, e così via, che sono che richiedono tempo e possono degradare le piastrine e il loro contenuto.
Ford e i suoi colleghi hanno descritto la purificazione piastrinica dal sangue umano usando Ioexolo medium11. Questo metodo utilizza un volume simile di campione di sangue e mezzo durante la purificazione. Poiché gli esseri umani producono un volume più elevato di sangue, è relativamente facile purificare le piastrine.
Iohexol è un mezzo inerti a gradiente universale che è liberamente solubile in acqua e utilizzato nel frazione di acidi nucleici, proteine, polisaccaridi e nucleoproteine13,14. Ha bassa osmolalità ed è atossico, rendendolo così un mezzo ideale per la purificazione delle cellule viventi intatte11. Si tratta di un mezzo non particolato; Pertanto, la distribuzione delle cellule in un gradiente può essere determinata utilizzando l'emocytometro, il citometro di flusso o lo spettrofotometro. Non interferisce con la maggior parte della reazione enzimatica o chimica delle cellule o frammenti cellulari dopo la diluizione.
Il topo funge da modello animale importante per molte malattie umane15,16,17,18. Ci sono alcuni articoli pubblicati che descrivono la purificazione delle piastrine del topo19,20. Tuttavia, il topo produce un volume relativamente più piccolo di sangue, il che rende difficile purificare le piastrine. Se si utilizza lo stesso piccolo volume di gradiente medio e campioni di sangue, lo strato piastrinico non può essere chiaramente separato dallo strato di RBC-WBC dopo la centrifugazione. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo rapido e semplice di purificazione piastrinica del topo con tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione a bassa velocità. Abbiamo anche attivato le piastrine purificate con trombina e indagato la loro qualità con citometria di flusso e microscopia.

<table><tbody><tr><td>APC ratto anti-topo/umano CD62P (P-selectina)</td><td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>Marcatore di attivazione piastrinica</td></tr><tr><td>Eppendorf tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Tubo per centifugo</td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>Articolo non di catalogo</td><td>Analisi di piastrine e sangue intero</td></tr><tr><td>tubo FACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Tubi per flusso citometria</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Ingrediente per la colorazione del tampone</td></tr><tr><td>FITC ratto anti-topo CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Marcatore piastrinico Citometro</td></tr><tr>a<td>flusso</td><td>BD Biosciences</td><td>Elemento non di catalogo</td><td>Analisi delle piastrine e del sangue intero</td></tr><tr><td>Software FlowJo FlowJo</td><td>, Inc.</td><td>Voce non di catalogo</td><td>Analisi delle piastrine e del sangue intero</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Prevenire la formazione di coaguli piastrinici</td></tr><tr><td>Ematocrito Tubo capillare</td><td>Fisher</td><td>Scientific 22-362566</td><td>Tubo capillare per la raccolta del sangue</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>Articolo non di catalogo</td><td>Analizzatore di cellule del sangue</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>Camera di conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Utilizzare per anestetizzare il topo</td></tr><tr><td>Microscopio (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Articolo non di catalogo</td><td>Monitoraggio e conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradient medium</td></tr><tr><td>PE ratto anti-topo CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>marcatore WBC</td></tr><tr><td>PE-Cy7 ratto anti-topo TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>marcatore RBC</td></tr><tr><td>Punte Pipet 200 &micro; L, a foro largo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Trasferimento di campioni di sangue e piastrine</td></tr><tr><td>Punte per pipette 1000 &; L, a foro largo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Trasferimento di campioni di sangue e piastrine</td></tr><tr><td>Soluzione salina potenziata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Tampone per lavaggio e diluizione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Soluzione fisiologica</td></tr><tr><td>Soluzione salina Citrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Anticoagulante</td></tr><tr><td>Tampone di colorazione</td><td>Articolo</td><td>non di catalogo Articolo non di catalogo</td><td>Acqua di lavaggio e diluizione</td></tr><tr><td></td><td>Articolo non di catalogo</td><td>Solvente</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Centrifuga a rotore a secchiello oscillante</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Laboratorio di ricerca sugli enzimi</td><td>HT 1002a</td><td>Agonista dell'attivazione piastrinica</td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Buffer per Nycodenz medium</td></tr></tbody></table>

purificazione delle piastrine dal sangue del topo

Purification of Platelets from Mouse Blood

Le piastrine vengono purificate dal sangue intero per studiare le loro proprietà funzionali, che dovrebbero essere prive di globuli rossi (RBC), globuli bianchi (WBC) e proteine plasmatiche. Descriviamo qui la purificazione delle piastrine dal sangue del topo utilizzando tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione in un rotore a benna oscillante a 400 x g per 20 min a 20 ° c. Il recupero/rendimento delle piastrine purificate era 18,2-38,5%, e le piastrine purificate erano in uno stato di riposo, che non conteneva alcun numero significativo di RBC e WBC. Le piastrine purificate trattate con trombina hanno mostrato fino al 93% di attivazione, indicando la loro vitalità. Abbiamo confermato che le piastrine purificate sono sufficientemente puri utilizzando la valutazione citometria a flusso e microscopica. Queste piastrine possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione, il rilascio del granulo, l'aggregazione e i saggi di adesione. Questo metodo può essere utilizzato per la purificazione delle piastrine dal sangue di altre specie pure.

Il riassunto della purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso (Figura 1). I passaggi includono la raccolta di sangue dal topo con sanguinamento retro-orbitale in presenza di un anticoagulante, aggiunta di campione di sangue sul mezzo di gradiente di ioexolo, centrifugazione in un rotore oscillante a benna a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c. La qualità delle piastrine purificate è stata valutata con microscopia e citometria a flusso dopo colorazione con anticorpo p...

Qui, il sangue del topo è stato raccolto in presenza di un anti-coagulante. Le piastrine sono state purificate dal mezzo gradiente di Ioexolo usando la centrifugazione a bassa velocità. Le piastrine sono state attivate con trombina per indagare se fossero vitali. La qualità delle piastrine purificate è stata analizzata mediante citometria a flusso e microscopia.

Purificazione delle piastrine dal sangue del topo

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Le piastrine dovrebbero essere libere da cellule del sangue e proteine quando studiano le loro proprietà biochimiche e fisiologiche. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le piastrine dal sangue del topo. Questa tecnica può purificare le piastrine usando la centrifugazione a media e bassa velocità del gradiente di ioesolo, con conseguente chiara separazione delle piastrine dagli altri componenti del sangue.Per purificare le piastrine, utilizzare una punta di pipetta a foro largo per strato 200 microlitri di sangue intero appena raccolto lentamente lungo il lato di un tubo da 1,5 millilitri su 600 microlitri di mezzo gradiente di ioesolo senza miscelazione. Dopo la centrifugazione in un rotore a secchio oscillante per isolare le piastrine, utilizzare una nuova punta di pipetta a foro largo per raccogliere la maggior parte dello strato ricco di piastrine e una piccola frazione dello strato povero di piastrine senza aspirare il globulo bianco o lo strato di globuli rossi. Aggiungere il campione piastrinica a un nuovo tubo e aggiungere un millilitro di PBS alle piastrine.Mescolare le piastrine per inversione prima di eseguire un'altra centrifugazione. Quindi rimospendare il pellet in 200 microlitri di PBS con pipettazione delicata. Per l'attivazione piastrinica, trasferire da uno a due volte 10 alle sei piastrine in un nuovo tubo contenente 100 microlitri di tampone di colorazione.Aggiungere da uno a due per 10 alle sei piastrine a un tubo diverso contenente 100 microlitri di tampone di colorazione integrati con peptide GPRP da 0,4 millimolare. Aggiungere la trombina al tubo con il peptide GPRP per attivare le piastrine e aggiungere il cocktail anticorpale di interesse per entrambi i tubi. Come controllo positivo, aggiungere un microlitro di sangue intero in un massimo di 100 microlitri di tampone di colorazione in un tubo contenente peptide GPRP da 0,4 millimolare e aggiungere trombina per attivare queste piastrine.Come controllo negativo, aggiungere un microlitro di sangue intero in un massimo di 100 microlitri di tampone di colorazione. Quindi macchia entrambi i tubi di controllo con il cocktail di anticorpi. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente al buio, lavare i campioni con un millilitro di tampone di colorazione fresco per tubo.Rimosogliere il pellet in 300 microlitri di tampone di colorazione fresco. Quindi trasferire i campioni di cellule in singoli tubi di analisi della citometria a flusso protetti dalla luce. Per analizzare le piastrine per citometria di flusso, create un nuovo esperimento e generate grafici a punti di dispersione laterale logaritmica in avanti rispetto ai grafici a punti di dispersione laterale logaritmica.Dopo aver regolato le tensioni in base alle esigenze, registrare le celle macchiate a colori singoli per i controlli di compensazione. Ora esegui il campione di controllo positivo per acquisire abbastanza celle per regolare la compensazione e i cancelli. Quindi acquisire e registrare 100.000 eventi per ogni campione di sangue intero e analizzare i dati della citometria del flusso utilizzando i grafici e i cancelli appropriati.Se il sangue viene aggiunto lentamente al mezzo, il mezzo gradiente di ioesolo e il campione di sangue formeranno due strati separati nel tubo. Dopo la centrifugazione, lo strato superiore color paglia contiene il plasma ma nessuna cellula sanguigna intatta. Il secondo strato, biancastro, ricco di piastrine contiene la maggior parte delle piastrine.Il terzo strato trasparente è lo strato povero di piastrine ed è direttamente sopra i globuli rossi e il pellet di globuli bianchi. Il sangue intero mostra popolazioni distinte di globuli rossi, globuli bianchi e piastrine su una trama di punti di dispersione logaritmica in avanti rispetto alla dispersione laterale. Le piastrine purificate, tuttavia, dimostrano una popolazione distinta con un numero trascurabile di globuli rossi o bianchi.Campioni di sangue intero contengono globuli rossi positivi a Ter119 e popolazioni di globuli bianchi positivi al CD45 che sono quasi assenti nei campioni di piastrine purificate. Le piastrine purificate non trattate non esprimono quasi nessun marcatore di attivazione che ne confermi lo stato di riposo, mentre le piastrine trattate con trombina purificata in genere dimostrano un'espressione di 71%P-selectin. La valutazione microscopica di campioni di piastrine purificate non trattate non rivela alcuna aggregazione piastrinica.Dopo l'attivazione con trombina, tuttavia, le piastrine dimostrano una robusta aggregazione, confermando ulteriormente la loro vitalità dopo la purificazione come dimostrato. Sovrapporre attentamente il campione di sangue sul mezzo di ioesolo e, quando si raccolgono le piastrine, assicurarsi di aspirare con attenzione per non raccogliere i globuli rossi e gli strati di globuli bianchi per una corretta purificazione piastrinica. Questo metodo può essere utilizzato anche per la purificazione piastrinica di altre specie.Le piastrine purificate possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione, l'aggregazione, il rilascio di granuli e gli studi di adesione.

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Questo video dimostra una tecnica per la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine. Le cellule progenitrici staminali ematopoietiche, isolate dal sangue del cordone ombelicale umano, si differenziano in megacariociti maturi in presenza di trombopoietina. I megacariociti maturi producono estensioni citoplasmatiche chiamate propiastrine, che danno origine a singole piastrine.

Un metodo in vitro per la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine

In questo video, descriviamo un protocollo per purificare le piastrine dal sangue intero murino e la loro successiva attivazione con l'agonista piastrinico trombina. Quando analizzate con citometria a flusso, le piastrine a riposo purificate sono caratterizzate in base all'espressione del loro marcatore di superficie cellulare CD41, mentre le piastrine attivate purificate co-esprimono entrambi i marcatori di superficie CD41 e CD62P.

Purificazione e attivazione delle piastrine da sangue intero murino

In questo video, dimostriamo l'isolamento di neutrofili citotossici ad alta densità e neutrofili a bassa densità dal sangue di un topo portatore di tumore mediante centrifugazione discontinua in gradiente di saccarosio.

Isolamento di neutrofili citotossici dal sangue di topo portatore di tumore

Leucociti e piastrine può essere utilizzato come marcatore bioenergetico di salute generale di un individuo e quindi hanno il potenziale per controllare i processi patologici e l'impatto dei trattamenti. Qui si descrive un metodo per isolare e misurare la funzione mitocondriale e il burst ossidativo in queste cellule.

Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l&#39;isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Una popolazione altamente pura dei megacariociti sono ottenibili dal midollo derivate dal sangue CD34+ cellule. Un metodo per CD34+ differenziazione megacariocita e isolamento delle cellule è descritto qui.

La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Presentato qui è un protocollo per l'aggiunta di peptide CD47 (pepCD47) a stent metallici usando la chimica del polibisfosfonato. La funzionalizzazione degli stent metallici utilizzando pepCD47 impedisce l'attacco e l'attivazione di cellule infiammatorie migliorando così la loro biocompatibilità.

Mitigazione dell'attaccamento delle cellule trasmesse dal sangue agli impianti metallici attraverso l'immobilizzazione peptidica derivata da CD47

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie per ottenere i progenitori ematopoietici CD34+ derivati dal leucofiltro e la loro differenziazione e maturazione in vitro in megacariociti portatori di proplatelet che sono in grado di rilasciare piastrine nel terreno di coltura. Questa procedura è utile per l'analisi approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari che controllano la megacariopoiesi.

Filtri leucodeplezione-Cellule CD34+ derivate come fonte cellulare per studiare la differenziazione dei megacariociti e la formazione piastrinica

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Il metabolismo piastrinico è di interesse, in particolare per quanto riguarda il ruolo dell'iper- e dell'ipoattività piastrinica nel sanguinamento e nei disturbi trombotici. L'isolamento delle piastrine dal plasma è necessario per alcuni saggi metabolici; Qui viene presentato un metodo per isolare i metaboliti intracellulari dalle piastrine lavate.

Preparazione di piastrine umane lavate per studi quantitativi sul flusso metabolico

Impara a purificare le piastrine dal sangue del topo utilizzando centrifugazione a gradiente di iohexol. Questo metodo consente di ottenere piastrine vitali per analisi di citometria a flusso e studi di attivazione.

Purificazione delle piastrine dal sangue del topo

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