Trascrizione Inizio mapping del sito utilizzando vettore-CAGE di input super-basso
26 giugno 2019
Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) è un metodo per la mappatura quantitativa a livello di genoma di mRNA 5'end per catturare i siti di inizio della trascrizione della polimerasi II dell'RNA a una risoluzione mononucleotide. Questo lavoro descrive un protocollo a basso input (SLIC-CAGE) per la generazione di librerie di alta qualità utilizzando quantità di nanogrammi di RNA totale.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica, in quanto consente la scoperta di promotori e potenziatori di base utilizzando basse quantità di materiale di partenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una mappatura imparziale della risoluzione mono nucleotidica a livello genomico dei siti di partenza trascrizionale RNA polimerasi II utilizzando solo 10 nanogrammi di RNA totale. CAGE si sta dimostrando prezioso per scoprire i siti di inizio della trascrizione associati alla malattia che possono essere utilizzati come marcatori diagnostici.
SLIC-CAGE estende queste scoperte per scalare campioni come le biopsie tissutali. SLIC-CAGE è ideale per l'analisi approfondita e ad alta risoluzione dei tipi di cellule fragili, compresi i primi stadi di sviluppo embrionale o il tessuto embrionale di una vasta gamma di organismi modello. Poiché ci sono numerosi passaggi in questo protocollo, è fondamentale ridurre al minimo la perdita di campioni in ogni passaggio facendo attenzione a recuperare il più materiale possibile durante il trasferimento tra tubi.
Iniziare preparando il mix PCR per ogni modello. Combina buffer, dNTP, primer forward unico, plasmide modello con il gene portante sintetico e polimerasi di fusione secondo le indicazioni manoscritte. Mescolare i reagenti con la pipettazione.
Aggiungere 90 microlitri del mix PCR a 10 microlitri di ogni primer inverso e mescolare. Fare riferimento al manoscritto per le condizioni di termociclismo. Eseguire la trascrizione inversa o RT sull'RNA di interesse.
Combina un microlitro di primer di trascrizione inversa, 10 nanogrammi di RNA e 4.990 nanogrammi di mix portante in un volume totale di 10 microlitri. Mescolare pipettando su e giù. Scaldare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti e quindi posizionarla immediatamente sul ghiaccio.
Preparare il mix RT secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere 28 microlitri del mix a 10 microlitri di RNA. Mescolare il contenuto del tubo con pipettando fino a omogeneo. Eseguire RT in un termociclo.
Una volta completata la trascrizione inversa, purificare il prodotto con perline magnetiche SPRI senza DNasi e RNasi. Aggiungere le perline alla miscela RT con un rapporto di volume di 1,8 a uno e mescolare bene con la pipettazione. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, posizionare le perline su un supporto magnetico e lasciarle separare per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato al 70% alle perline. Non mescolare le perline o toglierle dal supporto magnetico e rimuovere l'etanolo immediatamente dopo l'aggiunta.
Tenere il tubo sul supporto magnetico e rimuovere tutte le tracce di etanolo spingendo fuori le goccioline rimanenti con una pipetta P10. Aggiungere immediatamente 42 microlitri di acqua e pipettare su e giù 60 volte per elutare il campione, facendo attenzione a non causare schiuma. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per cinque minuti senza il coperchio e quindi separare le perline sul supporto magnetico.
Quindi, trasferisci il supernatante su un nuovo set di tubi, facendo attenzione a recuperare tutti i supernatanti ma evitare il riporto di perline. Dopo il trattamento con RNasi I, mescolare 45 microlitri di campione con 105 microlitri di perline di streptavidina preparate e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, pipettare il campione ogni 10 minuti per mescolare.
Quindi, separare le perline sul supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline con tamponi A, B e C.A partire dal tampone A, rimorsi le perline in 150 microlitri di tampone. Separare sul supporto magnetico per due o tre minuti, quindi rimuovere il supernatante.
Preriscaldare i tamponi B e C a 37 gradi Celsius e ripetere i passaggi di lavaggio. Per rimuovere completamente tutti gli RNA non limitati, è fondamentale lavare accuratamente le perline di streptavidina e le pareti del tubo e rimuovere completamente il tampone di lavaggio prima di aggiungere quello successivo. Per rilasciare il cDNA, rimescolare le perline in 35 microlitri di tampone 1X RNasi I e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente le perline sul ghiaccio per due minuti. Separare le perline su un supporto magnetico e trasferire il supernatante in un nuovo set di tubi. Rimescolare le perline in 30 microlitri di tampone 1X RNasi I e quindi separarsi su un supporto magnetico.
Combina il supernatante con il supernatante precedentemente raccolto per un volume totale di circa 65 microlitri. Eseguire qPCR per determinare il numero di cicli PCR per l'amplificazione della libreria di destinazione. Preparare i mix master qPCR per amplificare intere librerie di DNA dal vettore.
Impostare le condizioni di termociclismo in base alle indicazioni manoscritte e amplificare il campione preparato. Il protocollo SLIC-CAGE consente di ottenere librerie pronte per il sequenziamento da nanogrammi di materiale di RNA iniziale. La lunghezza del frammento nella libreria finale varia tra 200 e 2.000 coppie di basi.
Frammenti più brevi sono artefatti PCR e possono causare problemi di sequenziamento lungo la linea. È possibile eseguire ulteriori arrotondamenti di selezione delle dimensioni per rimuoverli. Rispetto a NanoCAGE, SLIC-CAGE mostra prestazioni significativamente migliori all'identificazione del sito di inizio trascrizione, che è evidente dalle curve caratteristiche operative del ricevitore delle due tecniche eseguite su varie quantità di RNA totale S.cerevisiae.
Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante tenere presente che la perdita di campioni può portare a librerie a bassa complessità. Per prevenirlo, è necessario utilizzare punte e tubi a pipetta a bassa legatura. Senza SLIC-CAGE, l'analisi dei promotori di vari tipi di cellule è stata finora inaccessibile.
Ciò include l'analisi degli stadi di sviluppo embrionale o del tessuto embrionale da una vasta gamma di organismi modello.
Panoramica
L'analisi del cap dell'espressione genica (CAGE) è una tecnica per mappare gli estremi 5’ dell'mRNA al fine di identificare i siti d'inizio della trascrizione con risoluzione di un singolo nucleotide. Questo articolo presenta il protocollo SLIC-CAGE, che consente la generazione di librerie di alta qualità a partire da piccole quantità di RNA totale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Regolazione genica
- Analisi trascrizionale
- Sequenziamento dell'RNA
Sfondo
- CAGE consente l'individuazione di promotori principali e potenziatori genici.
- È efficace con quantità minime di materiale iniziale, utilizzando soltanto 10 nanogrammi di RNA.
- La tecnica è utile per identificare siti di inizio della trascrizione associati a malattie.
- SLIC-CAGE è adatto per analizzare tipi cellulari fragili e tessuti embrionali.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo a basso input per l'analisi ad alta risoluzione dei promotori.
- Estendere le applicazioni della CAGE a campioni di piccole dimensioni, come biopsie tissutali.
- Migliorare l'identificazione dei siti di inizio della trascrizione in vari organismi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della miscela PCR e trascrizione inversa dell'RNA.
- Purificazione dei prodotti mediante perle magnetiche SPRI.
- qPCR per l'amplificazione della libreria e selezione per dimensione.
- Confronto delle prestazioni di SLIC-CAGE con NanoCAGE.
Risultati principali
- SLIC-CAGE produce librerie pronte per il sequenziamento a partire da quantità di RNA nell'ordine dei nanogrammi.
- La lunghezza finale dei frammenti della libreria varia da 200 a 2.000 paia di basi.
- Presenta prestazioni migliorate nell'identificazione del sito d'inizio della trascrizione rispetto a NanoCAGE.
- Un'accurata manipolazione riduce al minimo la perdita di campione, garantendo librerie di alta qualità.
Conclusioni
- SLIC-CAGE consente un'analisi dettagliata dei promotori in tipi cellulari precedentemente inaccessibili.
- Il protocollo è fondamentale per lo studio dello sviluppo embrionale precoce.
- Migliora la comprensione della regolazione genica in vari organismi modello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La mappatura accurata dei siti d'inizio della trascrizione permette l'identificazione precisa di promotori e enhancer principali, elemento fondamentale per la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta di farmaci. SLIC-CAGE estende questa capacità a campioni con basso input, come biopsie tissutali e tipi cellulari rari, ampliando la gamma di sistemi biologicamente rilevanti accessibili per la riduzione meccanicistica dei rischi. Ciò aumenta la sicurezza predittiva nella selezione degli obiettivi, collegando la regolazione trascrizionale a elementi genomici associati a malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi trascrizionali mediante la mappatura su scala genomica di promotori e potenziatori con risoluzione a singolo nucleotide.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità biologica collegando elementi regolatori all'espressione genica in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale delle target identificando siti di inizio della trascrizione associati alle malattie come potenziali biomarcatori o punti di ancoraggio meccanicistici.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi e riproducibili di TSS adatti alla standardizzazione di saggi in campagne di screening mirate ai promotori.
- Valore operativo: Consente la preparazione di librerie a partire da quantità di RNA nell'ordine dei nanogrammi, permettendo uno screening scalabile di campioni biologici limitati o preziosi.
- Valore scientifico: Produce librerie pronte per il sequenziamento con una distribuzione definita delle lunghezze dei frammenti (200–2.000 bp), riducendo gli artefatti e migliorando l'affidabilità dei dati per le analisi successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la scoperta traslazionale di biomarcatori mappando enhancer e promotori attivi in tipi cellulari rari e tessuti embrionali.
- Valore operativo: Consente un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo un profilo coerente dei siti di inizio della trascrizione (TSS) attraverso diversi sistemi modello e stadi di sviluppo.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, correlando la dinamica trascrizionale con gli esiti fenotipici nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
SLIC-CAGE si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando l'identificazione del bersaglio attraverso una comprensione meccanicistica della regolazione genica prima di passare all'identificazione del capostazione e alla validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi biologici mappando gli eventi di inizio della trascrizione su tutto il genoma.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative dei siti di inizio della trascrizione pronte per saggi, che supportano screening riproducibili di composti in formati a basso input.
- Analisi: Offre dati ad alta risoluzione sui siti di inizio della trascrizione a livello di singolo nucleotide e profili di lunghezza dei frammenti che consentono un confronto preciso degli stati trascrizionali tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici permettendo l'analisi di promotori e potenziatori in tessuti rilevanti per le malattie e in modelli di sviluppo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un metodo standardizzato e riutilizzabile per il profilo trascrizionale applicabile in diversi progetti e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'incertezza nell'annotazione di promotori e potenziatori.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie alla normalizzazione basata su vettori e a requisiti minimi di input.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo un rilevamento precoce dei rischi regolatori associati alla modulazione dell'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio collegando l'attività trascrizionale ai meccanismi della malattia e al potenziale dei biomarcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, manipolazione dell'RNA e preparazione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione.
- Dipende dall'accesso a termociclatori, supporti magnetici, perle SPRI e strumentazione per qPCR per la quantificazione delle librerie.
- Necessita di protocolli standardizzati tra i diversi gruppi di lavoro per garantire coerenza del vettore e ridurre al minimo gli effetti di lotto nel rilevamento dei siti di inizio della trascrizione (TSS).
- Deve tenere conto delle variazioni nell'integrità dell'RNA e nella qualità dell'input quando si adatta a diversi sistemi modello o campioni clinici.
- Limite pratico: la durata del protocollo, che si estende per più giorni, richiede una pianificazione accurata e personale qualificato per prevenire la perdita di campioni durante i trasferimenti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
Preparation of DNA Templates
1:38
Reverse Transcription
2:24
Purification of cDNA:RNA Hybrids Using Magnetic Beads
3:42
Cap-trapping
5:16
Control of Degradation Level and Determination of the Number of PCR Cycles
5:39
Results: DNA Quality and Validation of SLIC-CAGE Libraries
6:26
Conclusion
