Name: Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Scopri il trasferimento adottivo di neutrofili associati al tumore trattati con inibitore NAMPT in modelli murini di melanoma B16F10. Questo metodo permette di valutare il potenziale anti-angiogenico e terapeutico delle immunoterapie basate sui neutrofili in vivo.

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Il nostro lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dalle autorità di regolamentazione: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) e Regierungspr-sidium Tubingen, Germania. Tutte le manipolazioni devono essere eseguite in condizioni sterili (sotto cofano di flusso laminare) utilizzando reagenti e strumenti sterili (siringhe, forbici, pinze, bisturi usa e getta, piatti Petri).
NOTA: lo schema generale del protocollo è illustrato nella figura 1.
1. Preparazione della linea cellulare del melanoma B16F10
<ol><li>Preparare le cellule micoplasma-negative cresciute fino a raggiungere il 90% di un monostrato confluente del 90% (circa 10 x 106 cellule/t75) in un flask completo di Iscove's Modified Dulbecco (IMDMc: IMDM - 10% Fetal Bovine Serum (FBS) - 1% di penicillina-streptomicina).</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con salina tampina buffer di fosfato (PBS). Applicare 6 mL di una soluzione di distacco cellulare contenente enzimi proteolitici e collagenolitici (vedi tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 2 min.</li>
	<li>Knock la fiaschetta delicatamente per mobilitare le cellule rimanenti aderenti dal fondo. Raccogliere la sospensione cellulare in tubi da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 7 min e 20 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere bene il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 14 mL di PBS e centrifuga (300 x g e 20 gradi centigradi per 7 min).</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 1 mL di PBS.</li>
	<li>Contare le cellule e sospenderle nuovamente alla concentrazione di 3 x 106/mL PBS (per il passaggio 2) o 6 x 106/mL PBS (per il passaggio 6) per l'iniezione. Tenere le cellule sul ghiaccio per un massimo di 30 min.</li>
</ol>2. Modello tumorale allogenico nei topi
<ol><li>Utilizzare 10 femmine Ifnar1-/- topi di 8-12 settimane che sono tenuti in condizioni specifiche-senza patogeni (SPF). NOTA: I topi femminili sono preferibili in un modello sottocutaneo di crescita tumorale, poiché i maschi sono più aggressivi e quindi inclini a infrazioni del sito tumorale, che influenza la crescita del tumore.</li>
	<li>Rasare la pelle del topo sul fianco con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con tessuto bagnato con 70% di etanolo.</li>
	<li>Raccogliere le cellule melanoma B16F10 preparate ad una concentrazione di 3 x 106/mL PBS (vedere il passaggio 1) in una siringa da 1 mL e un ago da 0,4 x 19 mm. Iniettare 100 mL della sospensione sottocutaneamente.<ol>
<li>Mescolare le cellule ben prima di ogni iniezione. Utilizzare aghi di diametro non inferiore a 0,4 mm per non disturbare le cellule tumorali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettere fino a 5 topi in una gabbia e controllare la dimensione del tumore (lunghezza, larghezza e profondità) con una pinza per 14 giorni. NOTA: Secondo le normative sugli animali, la dimensione del tumore non deve superare i 15 mm di diametro, i topi con tumori più grandi o necrotici/aperti devono essere sacrificati in anticipo.</li>
	<li>Al giorno 14, sacrificare i topi nella camera CO 2.</li>
	<li>Disinfettare la pelle con il 70% di etanolo e rimuovere i tumori con le forbici e le pinze in una parabola Petri sterile. Tenere i tumori in un tubo da 50 mL in completo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM - 10% FBS - 1% penicillina-streptomycin) sul ghiaccio.</li>
</ol>3. Isolamento TAN
<ol><li>Mettere i tumori in piastre sterili a 6 pozzi, 5 tumori per pozzo. Tagliare i tumori in pezzi da 2-3 mm con forbici sterili.<ol>
<li>Digest con 1 mL di dispase/collagenase D/DNase I soluzione (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 mL di DMEMc) per tumore. Incubare a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida, e mescolare con una siringa da 10 mL senza ago ogni 15 min 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per rimuovere le fibre non digerite, le celle mesh attraverso filtri da 100 m in tubi da 15 mL (un pozzo per tubo). Aggiungere PBS a 15 mL, centrifugare i tubi a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Eritrociti di lisse con un buffer di lisi (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 gradi centigradi) aggiungendo 1 mL in ogni tubo. Mescolare bene, e combinare la soluzione da tutti i tubi in uno. Interrompere la reazione dopo 2 minuti con 11 mL di DMEMc ghiacciato.</li>
	<li>Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere il pellet con 15 mL di PBS freddo. Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 3 mL di anticorpi Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL) e incubare sul ghiaccio per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere anticorpi: 10 mL di Ly6G-PE (stock 0,2 mg/mL) e 10 mL di CD11b-APC (stock 0,2 mg/mL). Aggiungere 20 mL di 6-Diamidin-2-fenilindol viability dye (DAPI, stock 5 mg/mL) e incubare sul ghiaccio nel buio per 30 min. NOTA: È possibile utilizzare un'altra combinazione di coloranti di vitalità e coniugati fluorescenti di anticorpi.</li>
	<li>Aggiungere PBS fino a 15 mL, centrifugare a 460 x g, 4 gradi C per 5 min, e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in DMEMc alla concentrazione di circa 10 x 106/mL, e mantenere il ghiaccio.</li>
	<li>Ordinare i neutrofili CD11b- Ly6Ghi alive (DAPI-negative) con una selezionatrice cellulare attivata dalla fluorescenza (strategia di gating vedere Figura 2). NOTA: Tenere il tubo con la sospensione cellulare e il tubo con DMEMc per le celle ordinate a 4 gradi centigradi. Utilizzare le seguenti impostazioni di ordinamento ottimali: un ugello di 70 mm, una soglia di massimo 22.000 eventi al secondo e una portata di 1-3.</li>
	<li>Controllare la purezza dei neutrofili ordinati utilizzando un citometro per una purezza raccomandata di >95%.</li>
	<li>Centrifuga neutrofili ordinati a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatore. Sospendere le celle ordinate in DMEMc alla concentrazione di 1 x 106/mL. NOTA: Il numero previsto di neutrofili in un tumore B16F10 di 14 giorni (diametro 10 mm) è di circa 3 x 104 cellule.</li>
</ol>4. Inibizione NAMPT nei TAN in vitro
<ol><li>Preparare lo stock di FK866 (inibitore NAMPT) in dimeillfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 100 mM.</li>
	<li>Neutrofili smistati di semi (passaggio 3.11) in 2 pozze di una piastra u-inferiore di 96 pozze (1,5 x 105 neutrofili/pozzo). Aggiungere FK866 nel pozzo di intervento (concentrazione finale di 100 nM) e una quantità uguale di DMEMc con DMSO nel pozzo di controllo. Incubare per 2 h a 37 , 5% DI CO2 in un'incubatrice umida.</li>
	<li>Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere in 200 mL di PBS in ogni pozzo. Ripetere 2 volte.</li>
	<li>Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali commerciali (completato con 4 integratori di crescita delle cellule endoteliali l/mL, 0,1 ng/mL recombinante fattore di crescita eepidermica umana, 1 fattore di crescita del fibroblasto di base umano ricombinante di 1 ng/mL, 90 g/mL di eparina e 1 g/mL hydrocortisone) ad una concentrazione finale di 0,2 x 106 cellule/mL (in 0,75 mL) (per il passaggio 5) o in PBS alla concentrazione finale di 0,6 x 106 cellule/mL (in 0,25 mL) (per il passaggio 6).</li>
</ol>5. Stima delle proprietà angiogeniche delle TAN utilizzando il saggio dell'anello aortico
<ol><li>Dissezionare l'aorta toracica da un topo maschio C57BL/6J (WT). Pulire e tagliare in anelli di 0,5 mm di larghezza. Mettere tutti gli anelli in un pozzo di una piastra di 24 pozze con 1 mL di mezzo di crescita cellulare endoteliale integrato. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida. NOTA: L'uso di topi maschi giovani (di meno di 8 settimane) per la dissezione dell'aorta è preferibile, poiché danno una risposta angiogenica più robusta15.</li>
	<li>Riempire i pozze della piastra piatta da 96 pozzecon 50, con 50 gradi di matrice di membrana sotterranea solubile, lasciare che il gel sia impostato per 30 min in un'incubatrice umida di 37 gradi, 5% di CO2 per consentire alla matrice di polimerizzare. Preparare almeno 3 pozzi per condizione.</li>
	<li>Incorporare gli anelli in matrice di membrana seminterrato solubile posizionando un anello aortico sulla parte superiore dello strato di matrice solida, 1 anello al centro di ogni pozzo. Aggiungere altri 50 - L di matrice di membrana seminterrato solubile per coprire ogni anello.<ol>
<li>Collocare la piastra in un'incubatrice umida di 37 gradi centigradi per altri 30 min per consentire la polimerizzazione del secondo strato di matrice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 150 mL/podi di media di crescita delle cellule endoteliali integrate e 2x104Ifnar1-/- TAN (controllo e Trattato FK866) (passaggio 4.4).</li>
	<li>Incubare la piastra per 14 giorni a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida.</li>
	<li>Immagine con un microscopio a contrasto di fase standard e stimare la ramificazione endoteliale. La valutazione quantitativa dei parametri morfometrici e spaziali della nave, incluso l'indice di diramazione, può essere eseguita automaticamente utilizzando il programma di elaborazione delle immagini progettato per le immagini scientifiche. NOTA: i risultati rappresentativi sono illustrati nella figura 3.</li>
</ol>6. Trasferimento adottivo di neutrofili trattati nel modello tumorale allogenico
<ol><li>Preparare le cellule di melanoma B16F10 (passaggio 1,6) in PBS a una concentrazione di 6 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Preparare 2 tipi di neutrofili: neutrofili trattati da FK866 e controllano i neutrofili non trattati (passaggio 4.4) in PBS ad una concentrazione di 6 x 105 cellule/mL. Mescolare i neutrofili con le cellule del melanoma B16F10 (il rapporto tra neutrofili e cellule tumorali finali 1:10) per avere 2 tipi di miscele cellulari.</li>
	<li>Prendere 10 topi WT femminili 8-12 settimane di età, 5 in ogni gruppo. Rasare la pelle sul fianco con un rasoio elettrico e disinfettare con 70% etanolo.</li>
	<li>Iniettare 100 l della sospensione cellulare (passaggio 6.2) sottocutaneamente con una siringa di insulina e un ago di 0,4 mm di diametro, a entrambi i gruppi di topi. Mettere 1-5 topi dello stesso gruppo in una gabbia.</li>
	<li>Al giorno 2, preparare 2 tipi di neutrofili: neutrofili trattati da FK866 e controllare i neutrofili non trattati (passaggio 4.4) in PBS ad una concentrazione di 6 x 105 cellule/mL. Iniettare 100 l di sospensione cellulare (passaggio 6.4) i.v. nella vena posteriore con una siringa di insulina e un ago di 0,4 mm di diametro, a entrambi i gruppi di topi. Rimettere i topi nella gabbia.</li>
</ol>7. Misurazione della crescita tumorale, esame istologico
<ol><li>Monitorare la crescita del tumore a giorni alterni. Valutare la dimensione del tumore con le pinze e calcolare il volume del tumore con la formula V , 4 /3 , ( h , w2)/ 8 (h - altezza, w - larghezza, profondità " larghezza).</li>
	<li>Sacrificare i topi al giorno 14 nella camera CO 2. Rimuovere i tumori e misurare i pesi del tumore.</li>
	<li>Congelare i tumori in una temperatura di taglio ottimale composto in azoto liquido, e conservare a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Scongelare i campioni fino a -20 gradi centigradi e preparare sezioni da 5 mm con un criotome. Lasciare asciugare i criocuts per 30 min a 20 gradi centigradi. Fissare le sezioni in acetone freddo -20 gradi per 2 min e lasciarle asciugare per 30 min a 20 gradi centigradi.</li>
	<li>Blocco con anticorpi Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL 1:500) in PBS per 1 h a 20 gradi centigradi.</li>
	<li>Macchie con anticorpo gamma Laminin (1:1500 in PBS, 200 l) per 1 h a 20 gradi centigradi. Lavare con PBS tre volte.</li>
	<li>Macchia con anticorpo secondario anti-coniglio di capra (stock 0,5 mg/mL, 1:400 in PBS,), anti-topo sMA (1:500 in PBS) e 2 L di DAPI (stock 5 mg/mL, 1:100 in PBS) in un volume finale di 200 l di soluzione anticorpale. Incubare per 1 h a 20 gradi centigradi al buio. Lavare con PBS tre volte.</li>
	<li>Scivoli asciutti per 20 minuti a 20 gradi centigradi al buio. Montare con anidroso supporto di montaggio per microscopia e coprire con un coperchio. Lasciare asciugare 1 h in 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Eseguire un esame microscopico. Quantificare la vascolarizzazione contando il numero totale (opzionalmente area) dei vasi Laminin e il numero (area) di SMA- vasi sviluppati. NOTA: per eseguire l'analisi delle immagini, scattare tutte le immagini nelle stesse condizioni (luce, contrasto, ingrandimento). In questo caso, i parametri di elaborazione sono fissi e l'elaborazione delle immagini diventa completamente automatica. I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 4 e nella Figura 5.</li>
</ol>

<ol><li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li>
<li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li>
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<li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD%28%2B%29-sirtuin-1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li>
<li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622(2018).</li>
<li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+%28NAMPT%29+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li>
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<li>Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li>
<li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li>
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<li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacokinetics%2C+toxicities%2C+and+biologic+effects+of+FK866%2C+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Investigational+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li>
<li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs%3A+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li>
<li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li>
<li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante i progressi nel trattamento chirurgico e farmacologico del cancro, la terapia di successo rimane una sfida. Poiché le cellule immunitarie sono noti per svolgere un ruolo importante nella regolazione della crescita del tumore, dovrebbero essere stabiliti nuovi metodi che inibiscono la tumorigenicità di tali cellule. Qui dimostriamo un nuovo approccio per sopprimere la crescita tumorale attraverso il trasferimento adottivo di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore. Il targeting selettivo della segnalazi...

Gli interferoni di tipo I (IFN) svolgono un ruolo importante nella stimolazione delle risposte dell'ospite alle neoplasie, poiché la mancanza di segnalazione IFN di tipo I si traduce in una crescita tumorale significativamente elevata1. Uno dei meccanismi coinvolti in questo processo è la regolazione dell'attività tumorale dei neutrofili associati al tumore, che è controllata dalla segnalazione a valle del fattore di stimolazione della colonia 3 (CSF3R). Il fattore stimolante della colonia 3 (CSF3), o fattore di stimolazione della colonia di granulociti, ha dimostrato di attivare la segnalazione che coinvolge la tosfororibosyltransferae alla nicotinamina (NAMPT)3,4. NAMPT è un enzima che limita il tasso per la sintesi di dinucleotide dell'adenina nicotinamide, che migliora la glicolisi e regola la riparazione del DNA, l'espressione genica e la risposta allo stress promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali5 . NAMPT è sovraespresso in più tipi di cancro, tra cui colorettale, ovarico, seno, gastrico, cancro alla prostata e glioma6 . NAMPT è essenziale non solo per le cellule tumorali, ma anche per una grande varietà di altri tipi di cellule presenti nei tumori, come le cellule mieloidi - guida la loro differenziazione4, inibisce l'apoptosi e stimola l'espressione di citochine multiple o enzimi degradanti in macrofagi7.
I neutrofili associati al tumore rappresentano importanti modulatori della crescita tumorale. Le funzioni TAN dipendono fortemente dalla disponibilità IFN di tipo I, in quanto queste citochine primo attività anti-tumorale dei neutrofili. Al contrario, l'assenza di IFN supporta l'attivazione cancerogena di queste cellule, in particolare le loro proprietà pro-angiogeniche. In accordo con questo, i topi carenti in IFN sviluppano tumori vascolarizzati significativamente più grandi e migliori, che sono fortemente infiltrati con neutrofili pro-tumorale / pro-angiogenico1,2,8, 9,10. È importante sottolineare che tali TAN pro-angiogenici mostrano un'elevata attività di NAMPT, suggerendo il suo ruolo essenziale nella polarizzazione pro-tumorale dei neutrofili.
L'esaurimento dei neutrofili usando anticorpo Ly6G o inibizione della loro migrazione (anticorpo CXCR2) provoca una diminuzione dell'angiogenesi tumorale, crescita, e metastasi1,8. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali generati sono immunogenici e la loro somministrazione è associata a una serie di effetti collaterali pericolosi per la vita11. Il trattamento con piccole molecole, come l'inibitore NAMPT FK866, che modula la tumoriogenicità dei neutrofi, potrebbe aiutare a evitare tali complicazioni. Sfortunatamente, l'inibizione sistemica farmacologica di NAMPT, accanto al suo effetto terapeutico sulla crescita del tumore, porta a gravi effetti collaterali tra cui tossicità gastrointestinale e trombocitopenia. Pertanto, l'applicazione sistemica degli inibitori NAMPT non è fattibile12,13,14.
Per questo motivo, è possibile suggerire un protocollo in cui l'attività NAMPT viene bloccata direttamente in TAN isolati. Tali neutrofili anti-tumorale vengono poi trasferiti adottivamente in un ospite portatore di tumori. Questo protocollo aiuterà a evitare gli effetti collaterali tossici sistemici dei composti, mentre il suo effetto sulle cellule bersaglio sarà sostenuto.

<table><tbody><tr><td>Tubi da 15 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>provette da 50 ml</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>punte sterili da 5 ml / 10 ml / 25 ml per la pipetta automatica</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td>6006180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a fondo piatto a 6 pozzetti</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>833.920</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti con fondo a U</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td>65018</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito digitale AMG EVOS fl</td><td>AMG, Bothel, U.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-topo CD11b</td><td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td>553312</td><td>clone M1/70, coniugato con APC, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-topo Ly6G</td><td>BioLegend, California, Stati Uniti</td><td>127608</td><td>clone 1A8, coniugato con PE, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS AriaII</td><td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td></td><td>selezionatrice cellulare</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule Casy</td><td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 50&micro; m / 100 &micro; m filtri sterili</td><td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germania</td><td>04-004-2327 / 04-004-2328</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germania</td><td>4706</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dilattato)</td><td>BioLegend, California, Stati Uniti</td><td>422801</td><td>Stock: 5mg/ml</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania</td><td>D4818-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>41966-029</td><td>DMEM completo: DMEM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsufossido)</td><td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germania</td><td>WAK-DMSO-10</td><td>CryoSure-DMSO</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali</td><td>PromoCell, Heidelberg, Germania</td><td>c-22010</td><td></td></tr><tr><td>FBS (siero fetale bovino)</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (Anti-topo CD16/32)</td><td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td>553142</td><td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td></tr><tr><td>FK 866 cloridrato</td><td>Axon Medchem, Groningen, Paesi Bassi</td><td>Axon 1546</td><td>Stock: 100 mM</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio H& L</td><td>Abcam, Cambridge, Regno Unito</td><td>ab97075</td><td>Cy3-coniugato, Stock: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 Incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td><td></td><td></td>51026334</tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>12440-053</td><td>IMDM completo: IMDM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina</td></tr><tr><td>Rasoio Isis GT420</td><td>B. Braun Asculap, Suhl, Germania</td><td>90200714</td><td></td></tr><tr><td>Membrana basale Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Paesi Bassi</td><td>7205011</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo Cryostat Microm HM 505 N</td><td>Microm International GmbH, Walldorf, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, & alfa;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania</td><td>F3777</td><td>Coniugato FITC, nessuna informazione sulla concentrazione di magazzino</td></tr><tr><td>Aghi 0,4 mm x 16 mm</td><td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Neomount</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>HX67590916</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Stati Uniti</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta automatica Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te, Eberstadt, Germania</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti topo Laminin gamma 1 catena</td><td>Immundiagnostik, Bensheim, Germania</td><td>AP1001.1</td><td>Nessuna informazione sulla concentrazione di stock</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td><td>A1105-01</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterile per lo smaltimento (n. 15)</td><td>MedWare, Napoli, Stati Uniti</td><td>120920</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 1 ml</td><td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td></td><td></td>303172</tr><tr><td>Siringhe 10 ml</td><td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Palloni sterili per colture cellulari T75</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>833.911.302</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Torrance, Stati Uniti</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1 Microscopio invertito con sezionamento ottico ApoTome</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico in vivo

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Il contributo dei neutrofili alla regolazione della tumorigenesi sta ricevendo una maggiore attenzione. Queste cellule sono eterogenee, e a seconda dell'ambiente tumorale può possedere capacità pro o anti-tumorale. Una delle citochine importanti che regolano le funzioni neutrofili in un contesto tumorale sono gli interferoni di tipo I. In presenza di interferoni, i neutrofili ottengono proprietà antitumorali, tra cui citotossicità o stimolazione del sistema immunitario. Al contrario, l'assenza di un segnale di interferone si traduce in un'attività pro-tumorale prominente, caratterizzata da una forte stimolazione dell'angiogenesi tumorale. Recentemente, potremmo dimostrare che le proprietà pro-angiogeniche dei neutrofili dipendono dall'attivazione del percorso di segnalazione del fosfororiboyltransferae nicotina (NAMPT) in queste cellule. L'inibizione di questa via nei neutrofili associati al tumore porta al loro potente fenotipo anti-angiogenico. Qui, dimostriamo il nostro modello appena stabilito che consente la valutazione in vivo del potenziale tumorale dei neutrofili associati al tumore manipolati (TAN). A breve, i neutrofili pro-angiogenici associati al tumore possono essere isolati da topi carenti di interferonzi otumorali e ripolarti in fenotipi anti-angiogenici bloccando la segnalazione NAMPT. L'attività angiogenica di queste cellule può essere successivamente valutata utilizzando un saggio ad anello aortico. I TAN anti-angiogenici possono essere trasferiti in destinatari di tipo selvaggio portatori di tumore e la crescita del tumore deve essere monitorata per 14 giorni. Al giorno 14 topi vengono sacrificati, tumori rimossi e tagliati con la loro vascolarizzazione valutata. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare la capacità angiogenica delle cellule primarie, come i neutrofili associati al tumore, senza la necessità di utilizzare modelli di linee cellulari artificiali di neutrofili. Vc

Utilizzando la procedura descritta qui, i neutrofili Ifnar1-/- sono stati isolati dai tumori e trattati con l'inibitore NAMPT FK866 per 2 h. I neutrofili non trattati -/- sono stati usati come controllo. L'effettività del trattamento è stata valutata utilizzando il saggio dell'anello aortico, che riflette i passaggi chiave coinvolti nell'angiogenesi (degradazione della matrice, migrazione, proliferazione, riorganizzazione). Potremmo dimostrare che...

Qui, mostriamo il potenziale terapeutico dei neutrofili anti-angiogenici associati al tumore dopo il loro trasferimento in topi portatori di tumore. Questo protocollo può essere utilizzato per manipolare l'attività dei neutrofili ex vivo e successivamente valutare la loro funzionalità in vivo nello sviluppo di tumori. È un modello appropriato per studiare potenziali immunoterapie a base di neutrofili.

Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare il potenziale angiogenico dei neutrofili primari associati al tumore in vivo senza la necessità di utilizzare modelli di linea cellulare neutrofili artificiali. L'inibizione diretta della nicotinammide fosforibosiltransferasi, a breve NAMPT, nei neutrofili associati al tumore con il loro successivo trasferimento adottivo in animali portanti di tumore consente la manipolazione di neutrofili senza effetti collaterali tossici sistemici. Dimostreremo il potenziale terapeutico dei neutrofili manipolati anti-angiogenici associati al tumore dopo il trasferimento in ospiti portanti di tumore per lo studio di potenziali immunoterapie a base di neutrofili in diversi modelli di cancro.Per impostare un modello di topo tumorale allogenico, radere la pelle da 10 a 12 settimane femmina interferone alfa e beta-recettore subunità 1 topo knockout con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con 70%etanolo, quindi caricare tre volte 10 alle sei cellule di melanoma B16F10 per millilitro di PBS in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 0,4 per 19 millimetri e iniettare 100 microlitri della sospensione per via sottocutanea su un

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Questo video dimostra un test per generare neutrofili associati al tumore (TAN) anti-angiogenici. Dopo l'assunzione di un tumore di melanoma murino contenente TAN pro-angiogenici, le singole cellule vengono isolate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e trattate con un inibitore della nicotinammide fosforibosiltransferasi (NAMPT) per ridurre la capacità di stimolare l'angiogenesi.

Generazione di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Un modello di tumore primario del cancro al seno ortotopica e la rimozione chirurgica del tumore primario di estendere la vita del mouse per generare metastasi spontanee sono descritti. La crescita del tumore e la progressione sono monitorati e quantificati mediante imaging di fluorescenza luciferasi.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Questo protocollo descrive l'imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all'intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l'iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l'imaging intravitale in animali vivi e l'analisi dei tessuti fissi utilizzando l'immunofluorescenza.

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

Questo articolo descrive un flusso di lavoro di tecniche impiegate per testare nuovi potenziali mediatori di metastasi del melanoma e i loro meccanismi d'azione.

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri il trasferimento adottivo di neutrofili associati al tumore trattati con inibitore NAMPT in modelli murini di melanoma B16F10. Questo metodo permette di valutare il potenziale anti-angiogenico e terapeutico delle immunoterapie basate sui neutrofili in vivo.

Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo (Video) | JoVE Journal

Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo

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