Name: Localizzazione dellimmunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri la localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) per valutare la biodistribuzione di anticorpi terapeutici e diagnostici nei modelli murini di cancro. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale per migliorare l'efficacia delle terapie antitumorali.

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Ringraziamo il Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) per le discussioni e l'uso delle attrezzature. Ringraziamo il dottor Juergen K. Willmann per il suo mentore. Questo studio è stato sostenuto da NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) e NIH K99EB023279 (KEW). Lo Stanford Neuroscience Microscopy Service è stato supportato da NIH NS069375.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Administrative Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University.
1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno
<ol><li>Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite la palpazione o la misurazione della pinza prima di procedere. NOTA: Qui è stato utilizzato il modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Questi animali sviluppano spontaneamente carcinomi mammari invasivi tra 6 e 12 settimane di età in ogni ghiandola mammaria20. Le normali ghiandole mammarie sono state usate come controlli dai compagni di cucciolata transgenici-negativi e abbinati all'età.</li>
</ol>2. Iniezione endovenosa di agenti anticorpi specifici e non specifici
<ol><li>Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo antitomouse B7-H3 e coniglio IgG su una colonna di depurazione (ad esempio, PD-10) per rimuovere conservanti e buffer di stoccaggio seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: Alcuni anticorpi potrebbero aver bisogno di un'ulteriore purificazione con il protocollo21basato su perline di agarose proteiche-agarose.</li>
	<li>Dosaggi di aliquota di 33 g di ogni anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifuga. NOTA: Il dosaggio dell'agente somministrato può variare a seconda dell'applicazione e corrisponde ai dosaggi in cui viene utilizzato regolarmente il coniugato anticorpo. La concentrazione delle soluzioni anticorpali è necessaria se il volume è superiore a 100 -L per la sicurezza degli animali.</li>
	<li>Nel punto di tempo desiderato prima della raccolta dei tessuti, qui 96 h, anestesizzare l'animale che porta il tumore con 2% isoflurane che scorre in ossigeno a 2 L/min, e posto su uno stadio riscaldato 37 gradi centigradi. Fare un pizzico di dita dei dei impitori per assicurarsi che il livello corretto di anestesia è stato raggiunto prima della procedura.</li>
	<li>Per preparare l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali, disinfettare la coda dell'animale asciugandosi tre volte con una salvietta alcolica. Dilatare le vene della coda riscaldandosi con un pad termico per circa 30 s. Evitare di riscaldare l'intero animale. Pulire nuovamente la coda con una pulizia dell'alcool dopo aver rimosso il pad termico.</li>
	<li>Utilizzando un catetere della vena della coda 27G, inserire l'ago della farfalla in una delle due vene laterali della coda e fissare con attenzione la coda con l'ago inserito allo stage con un pezzo di nastro chirurgico. NOTA: il riflusso visibile del sangue nel catetere indica la corretta posizione dell'ago all'interno della vena posteriore.</li>
	<li>Sciacquare il catetere con 25 o più luna di salina tampinatato sterile di fosfato (PBS), quindi iniettare la soluzione anticorpale nel catetere utilizzando siringhe di insulina. Sciacquare ancora una volta il catetere con 25 gradi di PBS sterile.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dalla coda e applicare la pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.</li>
	<li>Spegnere l'anestesia e osservare l'animale fino a quando completamente sveglio per eventuali segni di angoscia.</li>
</ol>3. Raccolta e preparazione dei tessuti tumorali bersaglio
<ol><li>Nel momento desiderato, eutanasia umanamente l'animale secondo la procedura istituzionale accettabile, qui, per graduale inalazione di 100% CO2 da un serbatoio di gas compresso con una portata di spostamento camera del 10-30% volume / min. NOTA: Alcune applicazioni della tecnica IVIL richiedono eutanasia per perfusione cardiaca con PBS per rimuovere liberamente circolante anticorpo19,22.</li>
	<li>Dopo la conferma dell'eutanasia umana attraverso la cessazione del movimento respiratorio e cardiaco, la mancanza di risposta ai pizzicamenti dei dita dei formici e l'ingrigimento delle membrane mucose, le accise dei tessuti tumorali che utilizzano forbici chirurgiche e pinze come segue:<ol>
<li>Posare il topo in posizione supina e afferrando solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme di ghiandole mammarie più vicine alla coda (5th) con pinze, fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.</li>
		<li>Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare con attenzione la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante mantenendola intatta.</li>
		<li>Fare un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra le ghiandole mammarie 3rd e 4th, fare un taglio orizzontale attraverso l'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie. NOTA: Tumori mammari e ghiandole si trovano superficialmente sotto la pelle.</li>
		<li>Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con pinze, tagliare con cura la pelle attaccata utilizzando forbici chirurgiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i tessuti eccitati in stampi di base monouso dei tessuti, preetichettati e riempiti con una temperatura di taglio ottimale (OCT) incorporando il mezzo e congelare rapidamente gli stampi posizionandosi sul ghiaccio secco. Al fine di studiare la somministrazione off-target, accise altri tessuti o organi di interesse(adesempio, il fegato o i polmoni). NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare i blocchi di tessuto congelato a -80 gradi fino a quando non è pronto per procedere.</li>
	<li>Utilizzando un criostato, la sezione blocchi di tessuto congelato a 10 m di spessore e posizionare sezioni adiacenti su vetrini di vetro di adesione preetichettati. NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare le diapositive a -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.</li>
</ol>4. Protocollo di colorazione ex vivo
NOTA: Per il confronto quantitativo tra immagini di microscopia a fluorescenza, tutte le diapositive sono macchiate contemporaneamente con le stesse soluzioni preparate.
<ol><li>Sciacquare i vetrini con tissuma con temperatura ambiente PBS per 5 min per rimuovere lo OCT.</li>
	<li>Delimitare le sezioni del tessuto con una penna a barriera idrofobica per ridurre il volume delle soluzioni necessarie durante la colorazione. NOTA: Fare attenzione a non lasciare che la penna venga eseguita sui campioni di tessuto in quanto può rimuovere il tessuto dal vetrino o impedire una corretta colorazione sulla porzione di tessuto interessata. Non permettere alle sezioni del tessuto di disidratarsi in qualsiasi punto.</li>
	<li>Fissare le sezioni di tessuto con soluzione di paraformaldeide del 4% per 5 min.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.</li>
	<li>Permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0.5% Triton-X 100 in PBS per 15 min.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.</li>
	<li>Bloccare i tessuti con 3% w/v bovine serum albumin (BSA) e 5% v/v siero di capra, entrambi in PBS (soluzione di blocco) per 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Abbinare il siero della soluzione di blocco all'animale ospite dell'anticorpo secondario.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.</li>
	<li>Incubare sezioni con anticorpi primari di registrazione come desiderato, possibilmente un nucleare comune (ad esempio, DAPI), vascolare (ad esempio, CD31), o marcatore citoplasmico (ad esempio, actina). Qui, il ratto anti-topo CD31 (marcatore vascolare) a una diluizione 1:100 è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore nella soluzione di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi protetta dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento. NOTA: Non aggiungere ulteriori anticorpi primari o coniugati di anticorpi. Il coniugato che è stato iniettato e permesso di accumularsi nei tessuti in vivo agiscono come anticorpo primario.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.</li>
	<li>Incubare i vetrini con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare anticorpo anti-B7-H3 utilizzando AlexaFluor-546 vaccino anti-coniglio capra coniugato (1:200 diluizione, ottimizzato secondo le istruzioni del produttore) e CD31 con AlexaFluor-488 anti-ratto anti-ratto anti-ratto anticorpo (1:200 diluizione, ottimizzata secondo le istruzioni del produttore) nella soluzione di blocco, protetta dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento, per 1 h a temperatura ambiente. NOTA: gli anticorpi secondari provengono dallo stesso animale ospite, ma corrispondono all'affinità degli anticorpi secondari con le specie ospiti del rispettivo anticorpo primario. I vetrini sono protetti dalla luce da questo punto in poi.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.</li>
	<li>Applicare una goccia del supporto di montaggio al centro della fetta di tessuto e posizionare con attenzione un coverslip evitando l'intrappolamento di bolle d'aria.</li>
	<li>Sigillare i bordi della coverslip con smalto trasparente e lasciare asciugare. NOTA: Per sospendere il protocollo fino a una settimana a questo punto, conservare le diapositive a -20 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.</li>
</ol>5. Imaging di microscopia confocale e analisi quantitativa delle immagini
NOTA: la preparazione del microscopio confocale e dei parametri di imaging dipenderà dal sistema confocale utilizzato. Il microscopio utilizzato qui è stato acquistato commercialmente (ad esempio, il sistema Meta LSM 510) e il software di acquisizione associato è stato utilizzato (ad esempio, zen 2009). Tuttavia, molti di questi passaggi si applicheranno a qualsiasi microscopio confocale e assumeranno conoscenze di microscopia confocale di base.
<ol><li>Dopo che il sistema è stato acceso e riscaldato, selezionare l'obiettivo desiderato; qui è stato utilizzato un obiettivo 20x (apertura numerica - 0,8).</li>
	<li>Caricare una diapositiva di controllo positiva, coverslip verso il basso, per consentire l'impostazione dell'ottimizzazione per il segnale più luminoso. Imaging nel canale rosso, focalizzare il sistema sul campione in modalità Live imaging.</li>
	<li>Per ogni canale laser utilizzato, ottimizzare l'intensità del laser, il guadagno principale e la dimensione del foro stenopeico come segue:<ol>
<li>Passare alla modalità Continua per l'imaging.</li>
		<li>Ottimizzare l'intensità laser (che controlla la potenza laser) e guadagno (Master) (che controlla la tensione per tubo fotomoltiplicatore) barre di scorrimento durante il monitoraggio dell'istogramma look Up Table (LUT). Regolare queste due impostazioni fino a quando l'intervallo dinamico dell'istogramma non viene riempito senza saturare i pixel. NOTA: Se l'intensità del laser è troppo alta, si verificherà il fotosbleaching. Se il guadagno (Maestro) è troppo alto, l'immagine diventerà rumorosa. Idealmente, il guadagno (Maestro) sarà al centro della sua gamma.</li>
		<li>Impostare il foro stenopeico su 1 unità ariosa (AU), che dà la massima risoluzione e la più sottile z-slice.</li>
		<li>Far scorrere la barra Scostamento digitale per ridurre al minimo il rumore del rumore sull'istogramma LUT per un vero sfondo nero. NOTA: una volta che le impostazioni di microscopia sono ottimizzate per ogni canale laser e obiettivo, mantenerle costanti per tutta la sessione di imaging e per l'imaging di tutti i vetrini, per consentire il confronto quantitativo tra le diapositive.</li>
	</ol></li>
	<li>Nella scheda Modalità acquisizione, in Media,selezionare il numero e la profondità di bitdesiderati. Fare clic sul pulsante Ottimale per impostare le dimensioni ottimali in pixel.</li>
	<li>Utilizzare il pulsante di acquisizione Snap per raccogliere un'immagine di alta qualità. Qui, campi di vista casuali sono stati selezionati dall'interno del tumore, ma altre aree di interesse possono applicarsi per diverse applicazioni (vasi, margini tumorali, profondità di penetrazione, ecc.)</li>
	<li>Salvare i file di immagine nel formato utilizzato dal software confocal (qui, ".lsm") per l'elaborazione offline e la quantificazione. NOTA: se non tutte le diapositive vengono fotografate durante la stessa sessione, salvare le impostazioni e ricaricarle nelle visite successive, anche se non è consigliabile ricreare l'immagine della stessa diapositiva a causa del fotosbiancamento.</li>
	<li>Eseguire le misurazioni dell'intensità quantitativa di fluorescenza. Aprire Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 e caricare un file di immagine .lsm trascinando sulla barra di stato.</li>
	<li>Dividere i dati del canale a colori. Passare a Immagine > Pile > Dividi canali.</li>
	<li>Pre-elaborare le immagini a fluorescenza in base alle esigenze, ovvero sottrarre il segnale di sfondo (Processo > Sottrai sfondo) o ridurre il rumore tramite un metodo di filtraggio.</li>
	<li>Segmentare il canale di colore corrispondente alla proteina di riferimento (vascolare, nucleare, macchia cellulare) impostando una soglia sull'intensità del segnale (Immagine > Regola > Soglia). NOTA: la soglia manuale introduce la soggettività nell'analisi dell'immagine, pertanto, l'utilizzo di un algoritmo di soglia automatico o il riferimento agli istogrammi dell'immagine rende i risultati dell'analisi dell'immagine meno di parte.</li>
	<li>Utilizzare questa soglia per creare una maschera binaria (Processo > Binario > Converti in maschera).</li>
	<li>Misurare ed etichettare i ROI all'interno della maschera (Analizza > Analizza particelle > Controlla Aggiungi a gestore > OK).</li>
	<li>Applicare ROI al canale di colore corrispondente all'anticorpo di interesse (Clicca immagine canale, Analizza > Strumenti > Gestione ROI > Misura). Questo applicherà i ROI della maschera all'immagine dell'anticorpo e fornirà le misure dell'immagine per le sezioni delle etichette nella finestra Risultati. Finestra Salva risultati (File > Salva).</li>
	<li>Calcolare la statistica desiderata di interesse, come l'intensità media di fluorescenza come descritto qui24.</li>
	<li>Eseguire tutti i passaggi di elaborazione in modo identico a ogni immagine all'interno di un set di diapositive. Creare una macro per eseguire automaticamente questa operazione per i batch di immagini di grandi dimensioni23.</li>
	<li>Per la visualizzazione dell'immagine solo dopo misurazioni quantitative, applicare regolazioni qualitative dell'immagine per ottimizzare la visualizzazione dei modelli di biodistribuzione regolando il minimo, il massimo, la luminosità e il contrasto agli stessi livelli su tutte le diapositive(Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto).</li>
	<li>Convertire il tipo di immagine (Immagine > Tipo > Colore RGB) e salvare i file in un tipo di immagine senza perdita di dati, ad esempio .tiff ( File> Salva con nome > Tiff...) da utilizzare nelle presentazioni e nelle pubblicazioni.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell'iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all'applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l'anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell'anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tessu...

Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l'espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali1. Gli anticorpi possono avere un'affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina2. Con lo sviluppo della tecnologia dell'ibrido da parte di Milstein e del Kohler (premiato con il Premio Nobel nel 1984), la produzione di mAbs divenne possibile3 . Più tardi, mAbs umani sono stati generati utilizzando la tecnologia di visualizzazione fago o ceppi di topi transgenici e ha rivoluzionato il loro uso come nuovi strumenti di ricerca e terapie4,5.
Il cancro è un problema di salute mondiale e una delle principali cause di morte, creando la necessità di nuovi approcci per la prevenzione, la scoperta e la terapia6. Ad oggi, gli mAb hanno permesso l'estricazione del ruolo dei geni e delle loro proteine nella tumorigenesi e quando sono diretti contro i biomarcatori del cancro, possono consentire la rilevazione e la caratterizzazione del tumore per la stratificazione del paziente. Per la terapia del cancro, vengono sviluppati i coniugati bispecifici, i coniugati anticorpo-farmaco e i frammenti di anticorpi più piccoli come terapie, e per la somministrazione mirata di farmaci per migliorare l'efficacia terapeutica7. Inoltre, gli anticorpi servono per il biomarcatore mirato di agenti di contrasto per le modalità di imaging molecolare come la chirurgia a fluorescenza, l'imaging fotoacustico (PA), l'imaging molecolare degli ultrasuoni (US) e l'emissione di positroni clinicamente utilizzati tomografia (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singoli fotoni (SPECT)8. Infine, gli anticorpi possono essere utilizzati anche come agenti tenetici che consentono la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio della risposta per le terapie mirate9. Pertanto, nuovi mAbs stanno cominciando a svolgere un ruolo fondamentale nella diagnosi, diagnosi, e trattamento del cancro.
Nonostante i progressi critici nello sviluppo e nella produzione di mAb nuovi e altamente specifici, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere rese inefficaci a causa della complessità dell'ambiente tumorale. Le interazioni anticorpali dipendono dal tipo di epitopo, cioè,se è lineare o conformazionale10. Oltre al riconoscimento degli antigeni, gli anticorpi devono superare le barriere naturali come le pareti del vaso, le membrane basali e lo stroma tumorale per raggiungere le cellule bersaglio che esprimono l'antigene. Gli anticorpi interagiscono con il tessuto non solo attraverso il dominio di legame dell'antigene a frammento variabile (Fab), ma anche attraverso il costante frammento cristallino (Fc) che porta ulteriormente alle interazioni fuori sede11. Il targeting è complicato anche dall'espressione eterogenea dei marcatori tumorali in tutta la massa tumorale e l'eterogeneità nella vascolarizzazione tumorale e dal sistema linfatico12,13. Inoltre, il microambiente tumorale è composto da fibroblasti associati al cancro che supportano le cellule tumorali, le cellule immunitarie tumorali che sopprimono le reazioni immunitarie anti-tumorali e l'endotelio tumorale che supporta il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive, tutti che interferiscono con la penetrazione, la distribuzione e la disponibilità di terapie o diagnostica basate su anticorpi. Nel complesso, queste considerazioni possono limitare l'efficacia terapeutica o diagnostica, ridurre la risposta al trattamento, e può provocare resistenza al tumore.
Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi all'interno del microambiente tumorale. Attualmente, negli studi preclinici, l'espressione dei marcatori nei modelli di ricerca sul tumore viene analizzata ex vivo per colorazione immunofluorescenza (IF) delle sezioni tumorali14. La colorazione SE standard viene eseguita con anticorpi specifici del marcatore primario che vengono poi evidenziati da anticorpi secondari fluorescenti etichettati su fette di tessuto tumorale ex vivo che sono stati isolati dall'animale. Questa tecnica evidenzia la posizione statica del marcatore al momento della fissazione dei tessuti e non fornisce informazioni su come le terapie o la diagnostica basati su anticorpi potrebbero distribuire o interagire in condizioni fisiologiche. L'imaging molecolare di PET, SPECT, US e PA può fornire informazioni sulla distribuzione dell'agente di contrasto coniugato con anticorpi nei modelli preclinici viventi8,15. Poiché queste modalità di imaging non sono invasive, è possibile eseguire studi longitudinali e raccogliere dati sensibili al tempo con un numero minimo di animali per gruppo. Tuttavia, questi approcci di imaging molecolare non invasivo non sono abbastanza sensibili e non hanno una risoluzione sufficiente per la localizzazione della distribuzione degli anticorpi a livello cellulare. Inoltre, le caratteristiche fisiche e biologiche dell'anticorpo primario possono essere drasticamente modificate dalla coniugazione di un agente di contrasto16.
Al fine di prendere in considerazione le condizioni fisiologiche e patologiche in vivo di come le terapie e la diagnostica basate su anticorpi interagiscono all'interno dell'ambiente tumorale e per ottenere una distribuzione cellulare e persino subcellulare ad alta risoluzione profili di anticorpi non coniugati, proponiamo un approccio IF, ritenuto In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), in cui l'anticorpo specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo. La terapia o diagnostica basata su anticorpi, agendo come anticorpo primario, circola nei vasi sanguigni funzionali e si lega alla proteina bersaglio nell'ambiente tumorale vivo e altamente accurato. Dopo l'isolamento dei tumori in vivo con l'anticorpo primario, viene utilizzato un anticorpo secondario per localizzare i coniugati degli anticorpi accumulati e conservati. Questo approccio è simile a un approccio di istologia IF descritto in precedenza iniettando anticorpi fluorescenti17. Anche se qui, l'uso di anticorpi non coniugati evita un potenziale cambiamento nelle caratteristiche di biodistribuzione indotte dalla modifica dell'anticorpo. Inoltre, l'applicazione ex vivo dell'anticorpo secondario fluorescente evita una possibile perdita di segnale di fluorescenza durante la raccolta e l'elaborazione dei tessuti e fornisce amplificazione dell'intensità del segnale di fluorescenza. Il nostro approccio di etichettatura riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci basati su anticorpi e agenti mirati e può fornire importanti informazioni per lo sviluppo di nuovi agenti diagnostici e terapeutici.
In questo articolo, descriviamo due applicazioni del metodo IVIL applicate in studi precedenti che studiano la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per gli approcci di imaging molecolare per il rilevamento del cancro al seno. In primo luogo, la biodistribuzione di un controcorpo a raggi infrarossi vicino a un anticorpo (anticorpo anti-B7-H3 legato al colorante a fluorescenza infrarossa vicino, al verde indocianina, B7-H3-ICG) e all'agente di controllo isotipo (Iso-ICG) per la fluorescenza e la fotoacustica molecolare l'imaging è esplorato18. Il metodo di questa applicazione è descritto nel protocollo. Successivamente, i risultati della biodistribuzione di un anticorpo conformazionalmente sensibile al netrin-1, in genere non rilevabili con l'imaging TRADIZIONALE IF, utilizzato con imaging molecolare ad ultrasuoni, vengono quantificati e presentati nei risultati rappresentativi19. Al termine di questo documento di protocollo, i lettori dovrebbero sentirsi a proprio agio nell'adottare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

<table><tbody><tr><td>Animal Model</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>Il Jackson Laboratory</td><td>002374</td><td>Femmine, 4-6 settimane di età</td></tr><tr><td>Forniture per la manipolazione degli animali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G Catetere</td><td>VisualSonics</td><td>Si prega di chiamare per ordinare</td><td>Vevo MicroMarker Kit di incannulamento</td></tr> <tr><td>per l'accesso alla vena della codaSalviette imbevute di alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di garza (4 "x 4" 16 strati)</td><td>Cardinal Health</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>Lampada termica</td><td>Morganville Scientific</td><td>. HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampi base monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura di taglio ottimale (OCT) Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Pinza chirurgica London</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 capra anti-ratto IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 capra anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 capra anti-umano IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG umano</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo umanizzato anti-netrina-1</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Topo CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 Clone Rat</td></tr><tr><td>anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Clone</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polacco</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi farmacia locale</td></tr><tr><td>Verde Indocianina - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS estere</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato sterile Soluzione salina tamponata (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivi vetrini VWR</td><td></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica</td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per colorazione vetrini</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI, UW-Madison.</td><td>Versione 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l'antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall'eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l'imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

Il metodo IVIL è stato utilizzato qui per esaminare la biodistribuzione in vivo e l'interazione dei tessuti di B7-H3-ICG e Iso-ICG, consentendo agli agenti, dopo l'iniezione endovenosa in un animale vivente, di interagire con il tessuto bersaglio per 96 h, e poi una volta che i tessuti sono primario anticorpi durante l'immunostaining ex vivo. Il metodo IVIL è stato anche confrontato con la colorazione IF standard dei tessuti per il marcatore B7-H3. Le normali ghiandole mammarie murine non...

Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Questo protocollo per la localizzazione in vivo dell'immunofluorescenza, o IVIL, valuta la biodistribuzione in vivo di anticorpi diagnostici e terapeutici o agenti basati su anticorpi per la ricerca, il rilevamento e il trattamento del cancro. A differenza della colorazione immunofluorescente convenzionale in cui l'espressione cellulare degli antigeni si rivela ex vivo, il metodo IVIL chiarisce come gli anticorpi e gli agenti a base di anticorpi si distribuiscono nell'animale vivente. Questo video aivierà la comprensione del flusso di lavoro complessivo del metodo IVIL.Mostra dettagli importanti per una riproduzione riuscita del protocollo per altre applicazioni e anticorpi. Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite palpazione o misurazione della pinza prima di procedere. Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo IgG del coniglio B7-H3 e del coniglio su una colonna di dissalezione per rimuovere conservanti e tamponi di conservazione seguendo le istruzioni del produttore.Dosaggi aliquoti di 33 microgrammi di ciascun anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifugo. Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali. Disinfettare la coda dell'animale pulendo tre volte con una salvietta alcolica.Dilatare le vene della coda riscaldando con un riscaldatore per circa 30 secondi. Evitare di riscaldare l'intero animale. Utilizzando un catetere della vena di coda calibro 27, inserire l'ago farfalla in una delle due vene posteriori della coda.Visualizza il riflusso di sangue nel catetere per assicurarti che l'ago sia posizionato correttamente in modo che le soluzioni entrino completamente nell'animale rispetto a essere catturate nella coda. Utilizzare un pezzo di nastro chirurgico per fissare attentamente la coda con l'ago inserito sul palco. Lavare il catetere con 25 microlitri di soluzione salina sterile tamponata da fosfati.Quindi, iniettare la soluzione anticorpale nel catetere usando siringhe di insulina. Lavare nuovamente il catetere con 25 microlitri di PBS sterile. Rimuovere l'ago dalla coda e applicare pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.Eseguire l'eutanasia umana del mouse come descritto nel protocollo di testo e posare il mouse in posizione supina. Usa forbici chirurgiche e forcelle per asportare i tessuti tumorali. Usa le fasci per afferrare solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme delle ghiandole mammarie più vicine alla coda e fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare accuratamente la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante, mantenendola intatta. Fai un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra la terza e la quarta ghiandola mammaria, fai un taglio orizzontale sull'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie.Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con le forcep, tagliare con cura la pelle attaccata usando forbici chirurgiche. Posizionare i tessuti asportati negli stampi di base monouso dei tessuti che vengono preetichettati e riempiti con un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio. Congelare rapidamente gli stampi posizionamento sul ghiaccio secco.Al fine di studiare la consegna fuori bersaglio, asportare altri tessuti o organi di interesse. Utilizzando un criostato, se sezione blocchi di tessuto congelato con spessore di 10 micron e posizionare sezioni adiacenti su vetri di adesione preetichettati. Risciacquare i vetrini di tessuto congelato con PBS a temperatura ambiente per cinque minuti per rimuovere il mezzo di incorporamento.Demarcare le sezioni tissutali con una penna barriera idrofobica per ridurre il volume di soluzioni necessarie durante la colorazione. Fissare le sezioni tissutali con soluzione di paraformaldeide al 4% per cinque minuti. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0,5%Triton X-100 in PBS per 15 minuti.Risciacquare nuovamente le diapositive in PBS per cinque minuti. Bloccare i tessuti con PBS contenente il 3% di peso per volume di albumina di siero bovino e il 5% di volume per volume di siero di capra per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, incubare le sezioni con anticorpi primari da record come un marcatore nucleare, vascolare o citoplasmatico comune.Qui, il CD31 anti-mouse del ratto viene utilizzato con una diluizione uno-a-100 nella soluzione di blocco. Le diapositive con anticorpo primario vengono lasciate durante la notte a quattro gradi Celsius, protette dalla disidratazione su un vassoio scorrevole. Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in PBS per cinque minuti tre volte.Cambiare il PBS ogni volta. Incubare le diapositive con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare l'anticorpo anti-B7-H3 utilizzando l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato Alexa Fluor 546 e visualizzare CD31 con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra Alexa Fluor 488 in soluzione di blocco.Proteggere i vetrini dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio scorrevole per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS come prima, applicare una goccia del mezzo di montaggio al centro della fetta di tessuto. Posizionare con cura un coverslip, evitando l'intrappolamento delle bolle d'aria.Sigillare i bordi del coverslip con smalto chiaro e lasciare asciugare. Procedere con l'imaging confocale della microscopia e l'analisi quantitativa delle immagini come descritto nel protocollo di testo. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il confronto di specifici anticorpi B7-H3-ICG coniugati e anticorpi di controllo dell'isotipo non specifici-localizzazione coniugata ICG in ghiandole mammarie murine contenenti tessuti normali o carcinomi.Le ghiandole mammarie murine normali di un animale iniettato per via endovenosa con Iso-ICG o B7-H3-ICG e contrososteniate con CD31 non mostrano alcuna colorazione dei coniugati anticorpali. È stato dimostrato che i tessuti normali non hanno espressione di B7-H3 mediante colorazione standard ad immunofluorescenza ex vivo. Nei tumori mammari invasivi, il B7-H3-ICG si lega fortemente alla vascucolatura, il primo punto di contatto in vivo, e quindi è in grado di estrapolare dalla vascucolatura alla macchia eterogenea dell'epitelio tumorale.Iso-ICG mostra un accumulo non specifico all'interno dei tessuti tumorali. La colorazione immunofluorescente ex vivo standard mostra un'espressione uniforme del marcatore B7-H3 sulle cellule epiteliali ed endoteliali. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per rilevare l'espressione netrin-1 o l'espressione di controllo dell'isotipo nel carcinoma murino e nelle ghiandole mammarie normali.La localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo conferma il segnale epiteliale per netrin-1 nei tumori MMTV-PyMT ma non nelle normali ghiandole mammarie. Inoltre, c'è un forte segnale netrin-1 sulle cellule endoteliali nei tumori al seno, come indicato dal segnale giallo colocalizzato. Il segnale è significativamente più debole nelle ghiandole mammarie normali.Il metodo IVIL dovrà essere ottimizzato in termini di dosaggio degli anticorpi, tempi di raccolta dei tessuti e diluizione secondaria degli anticorpi per un'implementazione di successo. IVIL consente di mirare epitopi conformazionali che non possono essere rilevati utilizzando la colorazione immunofluorescenza standard, che richiede la lavorazione dei tessuti. Inoltre, gli organi sani dei topi portanti di tumore possono essere raccolti per valutare l'erogazione off-target di anticorpi terapeutici.Con l'aumento dell'uso di terapie a base di anticorpi e agenti di contrasto nella ricerca e nella gestione del cancro, il metodo IVIL è altamente applicabile alla ricerca e allo sviluppo farmaceutico. I ricercatori in terapie oncologiche, imaging molecolare, infiammazione e altre aree possono scoprire che il metodo IVIL fornisce informazioni utili.

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Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l'applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.

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Questo video dimostra una tecnica di localizzazione in immunofluorescenza (IVIL) in vivo per studiare la biodistribuzione di anticorpi mirati al tumore in un modello murino di cancro al seno. Dopo l'iniezione endovenosa di un anticorpo specifico per il tumore nel topo, il tumore viene isolato chirurgicamente e la localizzazione dell'anticorpo all'interno del tessuto tumorale viene confermata tramite immunocolorazione ex vivo.

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Il video dimostra un metodo di imaging a fluorescenza per la localizzazione di anticorpi in vivo in un modello di xenotrapianto tumorale di topo. Prevede l'iniezione di cellule tumorali in un topo per generare xenotrapianti solidi sotto la pelle. La successiva iniezione di anticorpi fluorescenti conferma la localizzazione specifica attraverso segnali di fluorescenza potenziati all'interno dello xenotrapianto tumorale.

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Una tecnica in vivo per tracciare il traffico di cellule T indotte da anticorpi bispecifici nei tumori

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per eseguire la convalida ex vivo di esperimenti di imaging di xenotrapianto a fluorescenza nel vicino infrarosso in vivo nei topi utilizzando nanocorpi marcati con fluorofori e anticorpi convenzionali.

Validazione di Nanobody e anticorpi Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Esperimenti tumore xenotrapianto NIRF imaging nei topi mediante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria di flusso e microscopia

Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.

Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Scopri la localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) per valutare la biodistribuzione di anticorpi terapeutici e diagnostici nei modelli murini di cancro. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale per migliorare l'efficacia delle terapie antitumorali.

Localizzazione dellimmunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro (Video) | JoVE Journal

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

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