Name: Punti salienti della collezione JoVE Methods: Interazioni proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Esplora le interazioni proteina-proteina con i metodi JoVE per studiare complessi cellulari e reti di segnalazione. Queste tecniche aiutano i ricercatori a comprendere i meccanismi molecolari fondamentali.

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Gli autori riconoscono le sovvenzioni NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute/Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) assegnate a M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la generazione di effetti biologici. Molti sono intimamente legati alla malattia e sono sempre più riconosciuti come bersagli importantiper l'azione dei farmaci. Sono disponibili numerose tecniche per studiare queste interazioni proteiche, alcune delle quali sono discusse in questa raccolta o in altri articoli di JoVE. Ogni tecnica ha i suoi pregi e i suoi limiti2; tuttavia, non esiste una tecnica perfetta per tutti i PPI a causa dell'enorme diversità di queste interazioni che si verificano in diversi compartimenti subcellulari, con un'ampia gamma di affinità (da picomolare a millimolare) e possono essere solo di natura transitoria.
I saggi in vitro delle chinasi sono un approccio indiretto per lo studio dei PPI che può essere utilizzato per analizzare come le chinasi svolgono il loro ruolo funzionale di trasferimento di un gruppo fosfato dall'ATP a un substrato. Cui et al.3 utilizzano questa tecnica, abbinata al digest triptico e alla spettrometria di massa, per identificare i siti di fosforilazione specifici della chinasi-1 ciclina-dipendente su un frammento della proteina f del centromero umano (CENP-F). Per la verifica funzionale di nuovi siti di fosforilazione, gli autori utilizzano un saggio di legame, combinando CENP-F contenente una mutazione fosfomimetica e la cariopherina α, un recettore di trasporto nucleare, fornendo così una convalida incrociata.
La coimmunoprecipitazione è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio dei PPI in cui un anticorpo viene utilizzato per catturare un bersaglio specifico insieme a qualsiasi altra molecola proteica ad esso associata. Zheng e colleghi4 applicano questa tecnica per studiare i fattori inducibili dall'ipossia (HIF) che funzionano come eterodimeri composti da una subunità α regolata dall'ossigeno e da una subunità β costitutivamente espressa nota anche come ARNT3. Una nota interessante sul loro protocollo è che le cellule vengono indotte e raccolte in condizioni di ipossia, e le proteine endogene delle frazioni nucleari vengono poi coimmunoprecipitate. Come notano gli autori, una limitazione del metodo è che non è in grado di determinare se i PPI sono diretti o indiretti.
Nolan et al.5 presentano un protocollo per la misura del numero di molecole e della loro luminosità in immagini di microscopia a fluorescenza 'Number and Brightness' (N&B), che può essere applicato per rilevare l'omo-oligomerizzazione delle proteine. La tecnica può essere utilizzata sia in vitro che in vivo ed è stata applicata per quantificare con precisione lo stato oligomerico del FKBP12F36V marcato con mVenus prima e dopo l'aggiunta di un farmaco dimerizzante. Gli autori discutono i meriti della tecnica rispetto alle tecnologie correlate e sottolineano l'importanza della correzione per lo sbiancamento e le fluttuazioni di intensità a lungo termine. I microscopi confocali dotati di rivelatori digitali facilitano la quantificazione, ma l'N&B è possibile anche con i rivelatori analogici.
La purificazione per affinità di complessi multiproteici, insieme all'identificazione dei loro componenti, è stata una tecnica ampiamente utilizzata per comprendere le funzioni di tali proteine complessate. Nel protocollo di Luzarowski et al.6, questa tecnica fa un ulteriore passo avanti caratterizzando contemporaneamente sia i PPI che le interazioni proteina-metabolita (PMI) nelle cellule vegetali transgeniche di Arabidopsis. Le chinasi nucleosidiche difosfato marcate sono purificate per affinità mediante la procedura di purificazione per affinità tandem (TAP) con proteine catturate e piccole molecole successivamente identificate mediante spettrometria di massa. L'unicità di questo protocollo è la capacità di identificare sia ligandi idrofobici che idrofili; si tratta di un protocollo di estrazione tre in uno che consente di studiare sia i PPI che i PMI e applica la purificazione di affinità all'impianto di cellule.
Il saggio di legatura di prossimità ha il vantaggio di essere utilizzato per rilevare le interazioni tra proteine endogene nelle cellule e nei tessuti. Karchugina e Chernoff7 usano la tecnica per mostrare la presenza di eterodimeri delle chinasi MST1 e MST2 nelle cellule di Schwann umane (HSC) e nelle cellule renali embrionali umane (HEK-293). Il loro articolo contiene diversi suggerimenti preziosi su come eseguire con successo la tecnica. Sono necessari anticorpi primari appropriati allevati in specie diverse contro ciascuna proteina interagente e, poiché la specificità e la sensibilità degli anticorpi sono fondamentali, le concentrazioni di anticorpi devono essere regolate con precisione. Gli autori hanno trovato i vetrini a camera utili per analizzare più linee cellulari e combinazioni di anticorpi, ma hanno notato che è imperativo rimuovere tutto l'inserto in silicone tra i pozzetti per evitare differenze nella distanza confocale durante la microscopia. Inoltre, vengono utilizzati vari controlli positivi e negativi per convalidare i risultati.
La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è un saggio sensibile che può essere utilizzato per fornire una risoluzione a livello atomico e informazioni quantitative sulle interazioni proteina e proteina-ligando. Winkelaar e colleghi8 usano la tecnica per studiare l'interazione di due proteine (vimentina ed envoplachina) presenti nei desmosomi, strutture cellulari coinvolte nell'adesione cellula-cellula che si trovano tipicamente nei tessuti che subiscono un intenso stress meccanico. Gli autori utilizzano un dominio vimentinico marcato con 15N e acquisiscono uno spettro 2D utilizzando la correlazione quantistica singola eteronucleare (HSQC). In presenza di un dominio da envoplakin, si osserva un esteso allargamento della linea e la scomparsa del picco, coerentemente con l'interazione proteica. Gli autori sondano ulteriormente le basi dell'interazione utilizzando la mutagenesi e la termoforesi su microscala (MST) per fornire informazioni quantitative.
La diffusione di raggi X a piccolo angolo (SAXS) è una tecnica che può essere utilizzata per fornire informazioni sulle dimensioni e le conformazioni di una macromolecola in soluzione e generare un involucro molecolare di complessi proteici di grandi dimensioni, multidominio o a bassa risoluzione. Nel protocollo di Mrozowich et al.9, la tecnica viene utilizzata per generare una struttura a bassa risoluzione di nidogen-1 e laminina γ-1 in complesso. La tecnica può essere di interesse per i ricercatori che studiano i PPI in proteine di grandi dimensioni con domini globulari multipli che sono troppo grandi per la spettroscopia NMR e sono difficili da cristallizzare per la cristallografia a raggi X.
È stato stimato che ci sono circa 650.000 interazioni nell'interattoma umano10, abbastanza per tenere occupati i ricercatori del settore per un po' di tempo a venire. Uno sviluppo recente, reso possibile dai progressi nella microscopia, nella spettrometria di massa e nell'apprendimento automatico, è la proteomica spaziale che potrebbe fornire grandi informazioni in questo settore in futuro11. Questa raccolta di metodi PPI aiuterà i ricercatori ad affrontare questa importante sfida evitando potenziali insidie.

punti salienti della collezione jove methods: interazioni proteina-proteina

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

Punti salienti della collezione JoVE Methods: Interazioni proteina-proteina

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Esplora le interazioni proteina-proteina con i metodi JoVE per studiare complessi cellulari e reti di segnalazione. Queste tecniche aiutano i ricercatori a comprendere i meccanismi molecolari fondamentali.

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