Name: Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo linfezione da Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri un metodo di imaging confocale per visualizzare in situ le cellule che producono interferon gamma nella milza del topo dopo infezione da Listeria monocytogenes. Questa tecnica preserva l'architettura tissutale e permette di caratterizzare il microambiente cellulare circostante.

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Ringraziamo il personale della Kennedy Institute Imaging Facility per l'assistenza tecnica con l'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Kennedy Trust (a.G.) e del Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R015651/1 a A.G.).

Tutti gli esperimenti riguardanti i topi erano in accordo con il UK Scientific Procedures Act del 1986.
1. Trasferimento adottivo di cellule CD8 specifiche per l'antigenico- T nei topi
<ol><li>Specifico di isolare l'ovalbumina (OVA) CD8- cellule T (OTI) che esprime proteine fluorescenti verdi (OTI-GFP) o proteine fluorescenti rosse (OTI-RFP) dalla sospensione dei linfonodi dei topi transgenici del recettore delle cellule T9,10 utilizzando un topo CD8- Kit di isolamento delle celle T come da istruzioni di fabbricazione. Preparare la sospensione cellulare fracassando i linfonodi utilizzando uno stantuffo di siringa, come descritto in precedenza11.</li>
	<li>Trasferire le cellule OTI-GFP o OTI-RFP (3 x 106 cellule) in C57BL/6 topi di tipo selvatico destinatari di iniezione endovenosa come descritto da Cahalan, et al.12. Utilizzare topi che sono in genere 6-12 settimana di età. NOT:</</c8> Questo passaggio è facoltativo e deve essere richiesto solo per tenere traccia delle cellule CD8- T specifiche dell'antigene.</li>
</ol>2. Infezione da Listeria monocytogenes
<ol><li>Espandere L. monocytogenes geneticamente modificato per esprimere OVA (LM-OVA)13 ad una fase esponenziale di crescita dell'infusione del cuore di brodo a 37 gradi centigradi in agitazione delicata fino a quando l'OD600 raggiunge 0,08–0,1, come descritto in precedenza in riferimento 14.</li>
	<li>Iniettare 100 L (volume massimo - 200 L) di 0,1–0,5 LD50 LM-OVA diluito in salina fosfati-buffered (PBS) per iniezione endovenosa utilizzando una siringa insulinica da 29 G, in capi di topi di tipo selvatico C57BL/6 che producono cellule OTI-GFP o OTI-RFP quando indicato. NOT:</</c5> Nelle nostre mani, 0,1 x LD50 LM-OVA corrisponde a 2 x 104 unità formanti colonia (CFU). L. monocytogenes geneticamente modificato per esprimere OVA viene utilizzato per attivare le cellule OTI CD8- T precedentemente trasferite, ma possono essere utilizzati altri ceppi di L. monocytogenes.</li>
</ol>3. Trattamento con Brefeldin A (BFA) per bloccare la secrezione Cytokine
<ol><li>Iniettare 250 g di BFA in 200 -L di PBS intraperitonealmente 6 h prima del sacrificio del topo utilizzando una siringa di insulina da 29 G. NOT:</</c0> La BFA liofilata viene prima sospesa nel solfuro dimetilo (DMSO) per preparare uno stock di concentrazione di 25 mg/mL. L'BFA viene quindi diluito in PBS a temperatura ambiente (RT) per evitare la cristallizzazione prima dell'iniezione. L'inibizione della secrezione di citochine induce l'accumulo di IFN nelle cellule. Questo è fondamentale per il rilevamento delle citochine.</li>
</ol>4. Raccogliere la milza
<ol><li>Eutanasia i topi utilizzando l'aumento della concentrazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. NOT:</</c1> Seguire le linee guida dell'istituzione locale per l'eutanasia umana dei topi.</li>
	<li>Pulire l'addome con il 70% di etanolo, fare un'incisione con le forbici per fare un 1-2 cm tagliato attraverso la pelle sul lato sinistro del mouse, dove si trova la milza. Fare con attenzione un'incisione nel peritoneo per esporre la milza e tirarla fuori con una pinzetta. Raccogliere la milza, facendo attenzione a non spremere con pinze o tagliarla per evitare di interrompere l'architettura della milza.</li>
</ol>5. Fissazione dello spleen con paraformaldeide (PFA)
<ol><li>Preparare la soluzione fissativa mescolando 3,75 mL di PBS e 3,75 mL di 0,2 M L-lysine. Aggiungere 21 mg di m-periodo di sodio e mescolare bene. Quindi aggiungere 2,5 mL di 4% PFA e 20 luna di 12 N NaOH. NOT:</</c0> Utilizzare la soluzione fissativa nello stesso giorno e scartare l'eccesso. Non conservarlo. Questa fase di fissazione è importante se il campione contiene proteine fluorescenti come GFP. Non utilizzare PFA contenente tracce di metanolo, in quanto denatura le proteine fluorescenti. ATTENZIONE: La PFA è tossica e deve essere maneggiata con cautela.</li>
	<li>Sommerse la milza nel fissativo e fissa per un minimo di 4 h, in genere 16-20 h a 4oC in agitazione delicata.</li>
	<li>Eliminare la soluzione fissativa e aggiungere 5 mL di PBS per 5 min a RT in leggera agitazione.</li>
	<li>Sostituire il PBS con 5 mL di incubazione PBS fresca per 1 h a 4 gradi centigradi in agitazione delicata.</li>
	<li>Sostituire il PBS con 5 mL del 30% di saccarosio, incubare per 12-24 h. NOT:</</c2> Questo metodo aiuta a mantenere la morfologia dei tessuti. Dopo l'incubazione con soluzione di saccarosio, l'organo dovrebbe affondare sul fondo del pozzo.</li>
</ol>6. Congelamento e sezionamento
<ol><li>Mettere il ghiaccio secco in un grande recipiente e mettere all'interno un recipiente più piccolo contenente circa 50 mL di metanolo puro e alcuni pezzi di ghiaccio secco.</li>
	<li>Asciugare delicatamente la milza su una salvietta senza laminetta.</li>
	<li>Posizionare la milza all'interno di uno stampo di base contenente una goccia di composto di temperatura di taglio ottimale (OCT) nella parte inferiore. Fare attenzione a non produrre bolle. Aggiungere OCT sulla milza.</li>
	<li>Con le pinze, depositare lo stampo di base sulla superficie del metanolo, assicurandosi che non tocchi lo strumento OCT. Congelare il tessuto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti.</li>
	<li>Quando è congelato, procedere con il sezionamento. NOT:</</c0> La milza congelata può essere conservata a -80 gradi centigradi per diversi mesi.</li>
	<li>
Sezionare il tessuto usando un criomicrotoma.
	<ol>
<li>Impostare la temperatura della camera sul criostato dovrebbe essere a -21 gradi centigradi. Tagliare le sezioni dello spessore desiderato (di solito intorno ai 10 m). Questo protocollo funziona con spessori fino a 30 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere le sezioni sui vetrini del microscopio in vetro (vedere la tabella deimateriali) e ispezionare visivamente. NOT:</</c4> Le sezioni possono essere conservate a -80 gradi centigradi per diversi mesi.</li>
</ol>7. Colorazione immunofluorescente
<ol><li>Lasciare che la sezione venga a RT.</li>
	<li>Disegnare un cerchio con un bloccante liquido (ad esempio, penna PAP) intorno alla sezione del tessuto. Disegnare all'esterno dello OCT o non si attaccherà.</li>
	<li>Una volta essiccato, reidratare il campione posizionando PBS sulla sezione del tessuto per 5 min. NOT:</</c0> Il volume inserito nella sezione dipende dalle dimensioni della sezione. In genere si usano 100-300 l. Non lasciare asciugare le sezioni una volta reidratate.</li>
	<li>Risciacquare con PBS almeno due volte per assicurarsi che la sezione sia ben aderito al vetrino.</li>
	<li>
Aggiungere la soluzione di blocco alla sezione per diminuire il legame non specifico degli anticorpi.
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di blocco come segue: PBS con 0,1% Triton X100, 2% siero di vitello fetale (FCS), 2,5 g/mL del recettore Fc (anti-mouse CD16/32). Quindi aggiungere il 2-5% del siero normale della specie di ogni anticorpo secondario del pannello di colorazione. NOT:</</c3> Se gli anticorpi sono direttamente coniugati/biotinylati, aggiungere il 5% del siero normale delle specie di ogni anticorpo primario. Se un anticorpo primario e uno degli anticorpi secondari provengono dalla stessa specie (ad esempio, anticorpi primari allevati nell'anti-ratto del coniglio e del coniglio secondario), non utilizzare la normale specie di siero in quanto aumenterà il segnale di fondo.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il PBS dalla sezione per aspirazione e aggiungere 100 l della soluzione di blocco per sezione campione. Incubare in una camera bagnata coperta per un minimo di 1 h a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchie con anticorpi primari.
	<ol>
<li>Diluire gli anticorpi primari alla concentrazione ottimale nella soluzione di blocco. La concentrazione generale di anticorpi del punto di partenza è di 5 g/mL, ma dovrebbe essere ottimizzata per ogni anticorpo e tessuto. NOT:</</c6> Se gli anticorpi sono coniugati direttamente, centrificare la miscela di anticorpi a 17,135 x g (13.500 giri/) per 15 min a 4 gradi centigradi prima di usarlo. I fluorofori possono precipitare. Questo passo avrà spinto i precipitati e quindi prevenire la deposizione non specifica degli anticorpi precipitati sul vetrino.</li>
		<li>Sostituire la soluzione di blocco con la combinazione di anticorpi primaria per ogni campione.</li>
		<li>Incubare per 4 ore a RT o durante la notte (OVN) a 4 gradi centigradi in una camera bagnata coperta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire il lavaggio.
	<ol>
<li>Preparare Wash Buffer aggiungendo 2% FCS a PBS.</li>
		<li>Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio: uno veloce (senza incubazione), uno per 10 min e due per 5 min. Quindi eseguire un lavaggio finale con PBS per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione con anticorpi secondari.
	<ol>
<li>Diluire gli anticorpi secondari di interesse alla concentrazione ottimale nella soluzione di blocco. Centrifugare il mix, come descritto per gli anticorpi primari.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio finale. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari sulla parte superiore della sezione e incubare per 1-4 h a RT in una camera bagnata coperta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio: uno veloce (senza incubazione), uno per 10 min e due per 5 min. Quindi eseguire un lavaggio finale con PBS per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio finale. Lasciare evaporare il PBS ma non asciugare eccessivamente la sezione. Posizionare una goccia del supporto di montaggio sopra il campione e posizionare con attenzione il vetro di copertura su di esso. Il supporto di montaggio deve recuperare l'intera sezione. Lasciate che polimerasi OVN a RT protetto dalla luce. NOT:</</c12> Disegnare un cerchio intorno alla sezione sul lato opposto della diapositiva prima di applicare il supporto di montaggio. Una volta applicato il supporto di montaggio, il tessuto potrebbe diventare difficile da vedere.</li>
	<li>Conservare le diapositive al buio a 4 gradi centigradi fino a quando non viene eseguito il tempo necessario per l'immagine.</li>
</ol>8. Imaging e analisi
<ol><li>Eseguire l'imaging della colorazione con un microscopio confocale. NOT:</</c0> In questo protocollo è stato utilizzato un microscopio a scansione laser invertito (vedere la Tabella dei Materiali), insieme agli obiettivi 10x/NA 0.40 o 60x/NA 1.4 (per l'analisi della localizzazione subcellulare citochina). Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono visualizzate per ogni proteina fluoroforo e fluorescente nella Tabella dei Materiali.</li>
	<li>Eseguire l'analisi e la quantificazione come richiesto utilizzando il software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Imaris o Fiji).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, presentiamo un metodo per visualizzare la produzione di IFN nella milza dopo l'infezione da L. monocytogenes nei topi. Questo protocollo è semplice e può essere adattato ad altri tessuti e trigger di citochina, ma i seguenti aspetti devono essere considerati. Le cellule spesso secernono rapidamente le citochine che producono, e le citochine vengono rapidamente captate dalle cellule vicine. È così difficile rilevare le citochine in situ. Un metodo comune per re-avviare rapidamente la produzione di citochine è quello di ri-stimolare le cellule ex vivo seguite dal rilevamento di citochine nei media da un saggio immunosorbente collegato agli enzimi. In questo contesto, tutte le informazioni sulla localizzazione spaziale delle cellule che producono citochine vengono perse. Inoltre, la produzione di citochine dopo la ri-stimolazione non riflette necessariamente se le citochine siano effettivamente prodotte e secrete in vivo, ma piuttosto indica la capacità di una determinata popolazione cellulare di produrre citochine. Pertanto, entrambi i metodi forniranno informazioni diverse e si dovrebbe considerare quali informazioni sono più preziose per il loro esperimento.
Al fine di rilevare le citochine intracellulari, il nostro metodo utilizza un inibitore del trasporto di proteine intracellulare per intrappolare le citochine all'interno delle cellule e aumentare il rilevamento del segnale. Tuttavia, è importante notare che questi inibitori influenzano il normale trasporto di proteine dal reticolo endoteliale (RE) all'apparato di Golgi e alla vescicola secretoria che ne altera il rilascio, che potrebbe causare tossicità. Di conseguenza, BFA, o altro inibitore, dovrebbe essere utilizzato per un breve periodo di tempo, in genere non più di un paio d'ore. Quindi, è importante trovare il giusto equilibrio tra la dose inibitore e il tempo di trattamento al fine di ottimizzare il livello di citochine intrappolate all'interno della cellula senza causare gravi effetti citotossici. Queste variabili possono differire tra le citochine e la via di somministrazione per il BFA. Nel nostro modello di infezione, il BFA è stato amministrato intraperitoneally al fine di fornire una rapida dispersione sistemica, ma può anche essere consegnato per via endovenosa.
Gli inibitori del trasporto di proteine intracellulari più comunemente utilizzati sono BFA, usato qui, e monensina (MN). Questi inibitori sono spesso usati indistintamente per accumulare e studiare la produzione di citochine, ma hanno lievi differenze nei loro meccanismi di azione. MN inibisce il trasporto di proteine all'interno dell'apparato Golgi accumulando così proteine nel Golgi17, mentre BFA impedisce il reclutamento di proteine coatomer complex-I, inibendo il movimento retrogrado delle proteine al reticolo endosmico (ER) promuovendo così l'accumulo di citochine nel ER18. Come tale, la scelta del miglior inibitore del trasporto proteico intracellulare dipenderà da diversi fattori, come la citochina da rilevare. Ad esempio, è stato dimostrato nella colorazione intracellulare indotta da lipopolisaccaride dei monociti che la BFA è più efficiente per misurare le citochine IL-1, IL-6 e TNF rispetto a MN19.
Questo protocollo prevede la visualizzazione della citochina in situ mediante microscopia confocale e quindi ci sono solo un numero limitato di marcatori che possono essere utilizzati per studiare le cellule che producono citochine e il loro microambiente. È inoltre necessario considerare che gli inibitori del trasporto proteico come la BFA o il MN disturbano la normale espressione di diverse proteine e quindi il loro utilizzo quando studiano l'espressione simultanea di alcuni marcatori di superficie delle cellule di attivazione deve essere affrontato Attentamente. Ad esempio, BFA ma non MN blocca l'espressione di CD69 nei linfociti murini20. Nonostante questa limitazione, l'imaging confocale consente la localizzazione subcellulare delle citochine, così come la direzione della secrezione di citochina all'interno della cellula. I dati generati utilizzando questo protocollo suggeriscono che le cellule NK tendono a secernere IFN-y in un modello diffuso, mentre le cellule CD8- T sembrano dirigere la secrezione IFN -ion verso altre cellule CD8- T che sono in interazione diretta con loro5.
Per concludere, questo protocollo è adatto per visualizzare una varietà di citochine in situ e identificare le cellule produttrici e il loro microambiente seguendo molti fattori scatenanti come l'infezione o l'autoimmunità. Le informazioni ottenute sono strumentali per comprendere l'importanza dell'orchestrazione spaziale in vivo di diversi tipi di cellule e della citochina che producono, necessaria per una risposta immunitaria efficiente.

Orchestrare una risposta immunitaria efficiente contro un agente patogeno richiede una complessa integrazione dei segnali visualizzati da una varietà di cellule immunitarie che sono spesso disperse tra l'organismo. Per comunicare, queste cellule producono piccole proteine solubili con molteplici funzioni biologiche che fungono da immunomodulatori chiamati citochine. Le citochine controllano il reclutamento, l'attivazione e la proliferazione delle cellule e quindi sono note per essere attori chiave nella promozione delle risposte immunitarie1. Risposte immunitarie efficaci richiedono il rilascio delle citochine in un modello patiotemporale molto organizzato che collega cellule specifiche per indurre segnali specifici. Pertanto, è fondamentale studiare la produzione di citochine e la sua segnalazione in situ, tenendo conto del microambiente in cui vengono prodotte le citochine.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) è un batterio intracellulare Gram-positivo utilizzato come modello primario per studiare le risposte immunitarie agli agenti patogeni intracellulari nei topi. Una citochina, IFN gamma (IFN) viene prodotta rapidamente, entro 24 h dopo l'infezione da L. monocytogenes. È necessario per lo sgombero degli agenti patogeni, in quanto i topi eliminati per IFN sono altamente sensibili all'infezione da L. monocytogenes 2. L'IFN è pleiotropico e prodotto da più cellule a seguito dell'infezione3. Mentre l'IFN, prodotto da cellule natural killer (NK), è necessario per l'attività antibatterica diretta4, è stato dimostrato che l'IFN, proveniente da altre fonti, ha dimostrato di avere altre funzioni. Infatti, noi e altri recentemente abbiamo scoperto che IFNs prodotto da cellule T CD8, ha una funzione specifica nella regolazione diretta della differenziazione delle cellule T5,6,7. In quanto tale, comprendere quali cellule producono IFN (e in quale microambiente) è fondamentale per sezionarne la funzione.
La tecnica più comune per studiare la produzione di citochine si basa sulla colorazione intracellulare delle citochine analizzate dalla citometria di flusso. Questo metodo consente il rilevamento simultaneo di più citochine combinate con marcatori di superficie cellulare all'interno di un singolo campione, fornendo uno strumento estremamente utile per studiare la produzione di citochine. Tuttavia, l'utilizzo della tecnica di cui sopra implica la perdita di qualsiasi informazione spaziale. Inoltre, il rilevamento delle citochine spesso si basa sulla ristimolazione in vitro per consentire il rilevamento delle citochine. Come tale, viene analizzata la capacità di una determinata cellula di produrre una citochina e non è necessariamente correlata alla secrezione di citochina effettiva in situ. Altri metodi utilizzano topi reporter per i quali l'espressione proteica fluorescente è correlata alla trascrizione della citochina e consente la visualizzazione a livello una singola cellula8. Anche se questo metodo può tenere traccia della trascrizione della citochina in situ, ci sono un numero limitato di topi citochine-reporter disponibili. Inoltre, la trascrizione, la traduzione e la secrezione a volte possono essere scollegate, e le proteine fluorescenti hanno un'emivita diversa rispetto alla citochina che riportano, rendendo questo metodo a volte non adeguato per la visualizzazione in situ cytokine.
Qui, descriviamo un metodo per visualizzare la produzione di citochine in situ mediante microscopia confocale a risoluzione a cella singola. Questa tecnica consente la visualizzazione della sorgente cellulare e della nicchia circostante all'interno del tessuto. Questo protocollo descrive in particolare la visualizzazione della produzione di IFN z nella milza di topi infetti da L. monocytogenes, concentrandosi qui sulla produzione IFN, da parte delle cellule NK e delle cellule T specifiche dell'antigene. Tuttavia, può essere esteso e adattato alla caratterizzazione di qualsiasi produzione di citochine nel contesto di altre situazioni in cui vengono prodotte citochine come infezioni, infiammazioni o malattie autoimmuni, a condizione che la citochina mirata possa essere conservata nelle cellule dall'inibitore del trasporto di proteine intracellulari.

<table><tbody><tr><td>Brefeldin A</td><td>Cambridge bioscience</td><td>CAY11861</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Agar scientifico</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina dicloridrato</td><td>Sigma lifescience</td><td>L5751</td><td></td></tr><tr><td>Sodio meta-periodato</td><td>Thermo Scientific</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-saccarosio</td><td>VWR Chemicals</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Precisione salviette di carta Kimtech science</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>75512</td><td></td></tr><tr><td>Composto O.C.T., terreno di montaggio per criotomia</td><td>VWR Chemicals</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc, anti-topo purificato CD16/32, clone 93</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td>Clone di anticorpi e concentrazione utilizzata:</forte> 2,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio - Superfrost Plus</td><td>VWR Chemicals</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169 - AF647</td><td>Biolegend</td><td>142407</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: clone 3D6.112 1,6 mg/ml Lunghezza d'onda di eccitazione: 650 Lunghezza d'onda di emissione: 65</td></tr><tr><td>anti-F4/80 - APC</td><td>Biolegend</td><td>123115</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: clone BM8 2,5 mg/ml Lunghezza d'onda di eccitazione: 650 Lunghezza d'onda di emissione: 660</td></tr><tr><td>anti-B220 - PB</td><td>Biolegend</td><td>103230</td><td>Clone di anticorpi e concentrazione utilizzata: clone RA3-6B2 1,6 mg/mL Lunghezza d'onda di eccitazione: 410 Lunghezza d'onda di emissione: 455</td></tr><tr><td>anti-IFNg - biotina</td><td>Biolegend</td><td>505804</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: clone XMG1.2 5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-IFNg - BV421</td><td>Biolegend</td><td>505829</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: clone XMG1.2 5 mg/mL Lunghezza d'onda di eccitazione: 405 Lunghezza d'onda di emissione: 436</td></tr><tr><td>anti-Nkp46/NCRI</td><td>R& D Systems</td><td>AF2225</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: capra 2,5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-capra IgG-FITC</td><td>Novusbio</td><td>NPp 1-74814</td><td>Clone di anticorpi e Concentrazione utilizzata: 1 mg/mL Lunghezza d'onda di eccitazione: 490 Lunghezza d'onda di emissione: 525</td></tr><tr><td>Streptavidin - PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td>Clone di anticorpi e concentrazione utilizzata: 2,5 mg/mL Lunghezza d'onda di eccitazione: 565 Lunghezza d'onda di emissione: 578</td></tr><tr><td>Streptavidin - FITC</td><td>Biolegend</td><td>405201</td><td>Clone dell'anticorpo e concentrazione utilizzata: 2,5 mg/mlL Lunghezza d'onda di eccitazione: 490 Lunghezza d'onda di emissione: 525</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura 22 mm x 40 mm</td><td>Menzel-Glazer</td><td>12352128</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker super PAP PEN mini</td><td>Axxora</td><td>CAC-DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Imaris - Software per l'analisi delle immagini al microscopio</td><td>Microscopio</td> confocale Bitplane <td></td><td></td></tr><tr><td>- Microscopio a scansione laser Olympus FV1200</td><td>Criostato Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- CM 1900 UV</td><td>Stampo base</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica monouso</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>11670990</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Life Technologies Ltd</td><td>20012068</td><td></td></tr><tr><td>BHI Brodo</td><td>VWR Marca</td><td>303415ZA</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td></td><td></td><td> Lunghezza d'onda di eccitazione: 484 Lunghezza d'onda di emissione: 507</td></tr><tr><td>RFP</td><td></td><td></td><td> Lunghezza d'onda di eccitazione: 558 Lunghezza d'onda di emissione: 583</td></tr><tr><td>Siringa da insulina, con ago, 29 G</td><td>VWR International</td><td>BDAM324824</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi wild type</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging di in situ interferon gamma production nella spleen del topo dopo l'infezione da listeria monocytogenes

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Le citochine sono piccole proteine secrete dalle cellule, che mediano le comunicazioni cellulari che sono cruciali per risposte immunitarie efficaci. Una caratteristica delle citochine è il loro pleiotropismo, in quanto sono prodotti da e possono influenzare una moltitudine di tipi di cellule. Come tale, è importante capire non solo quali cellule producono citochine, ma anche in quale ambiente lo fanno, al fine di definire terapie più specifiche. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare la produzione di citochine in situ a seguito di infezione batterica. Questa tecnica si basa sull'imaging di cellule che producono citochine nel loro ambiente nativo mediante microscopia confocale. Per farlo, le sezioni di tessuto sono colorate per marcatori di più tipi di cellule insieme a una macchia di citochina. Chiave di questo metodo, la secrezione di citochine è bloccata direttamente in vivo prima di raccogliere il tessuto di interesse, consentendo il rilevamento della citochina che si accumulava all'interno delle cellule produttrici. I vantaggi di questo metodo sono molteplici. In primo luogo, viene conservato il microambiente in cui vengono prodotte le citochine, che potrebbe in ultima analisi informare sui segnali necessari per la produzione di citochine e sulle cellule colpite da tali citochine. Inoltre, questo metodo fornisce un'indicazione della posizione della produzione di citochine in vivo, in quanto non si basa sulla ristimolazione artificiale in vitro delle cellule produttrici. Tuttavia, non è possibile analizzare contemporaneamente la segnalazione a valle della citochina nelle celle che ricevono la citochina. Allo stesso modo, i segnali di citochina osservati corrispondono solo alla finestra temporale durante la quale è stata bloccata la secrezione della citochina. Mentre descriviamo la visualizzazione della gamma dell'interferone citochina (IFN) nella milza in seguito all'infezione da topo da parte dei batteri intracellulari Listeria monocytogenes, questo metodo potrebbe essere potenzialmente adattato alla visualizzazione di qualsiasi citochina in la maggior parte degli organi.

L'IFN- prodotto entro le prime 24 h dopo l'infezione da Listeria monocytogenes è fondamentale per controllare la diffusione di questo agente patogeno. Utilizzando questo protocollo, possiamo visualizzare non solo quali cellule producono IFN, ma anche se si trovano in un microambiente specifico. Per aiutarci a delineare l'architettura della milza, abbiamo etichettato le cellule note per avere una posizione particolare all'interno della milza. Il marcatore F4/80 etichetta tutti i macrofagi e mette in evidenza la polpa rossa. Il marcatore B220 etichetta le cellule B ed evidenzia i follicoli cellulari B che circondano la zona delle cellule T. Il marcatore CD169 etichetta i macrofagi di zona marginale, che circondano la polpa bianca (Figura1). La maggior parte delle cellule OTI, che esprimano o meno, sono presenti nella polpa bianca e come tali, tutte le immagini sono quelle della polpa bianca, a meno che non siano indicate.
Un passo critico in questo protocollo è l'uso di BFA per inibire la secrezione di citochina. In effetti, l'individuazione delle cellule IFN da parte delle cellule NK è stata notevolmente compromessa quando i topi non venivano trattati con BFA (Figura2). Utilizzando il nostro protocollo, potremmo scoprire che almeno due tipi di cellule producono IFN , 24 h dopo l'infezione - cellule NK e antigene specifico CD8- cellule T (Figura3) - in modo simile a quanto è stato trovato in precedenza dalla citometria di flusso3.
L'imaging in situ delle cellule che producono IFN z ha rivelato che la produzione di IFN non è diffusa in tutta la milza, ma concentrata in aree discrete (Figura4). Infatti, abbiamo scoperto che le cellule T sono state attivate in tutta la milza (evidenziata dal clustering di cellule T), e questo non era necessariamente correlato con la produzione di IFN. Una spiegazione probabile è che la produzione di IFN è limitata all'ubicazione delle cellule infette15,16e l'attivazione delle cellule T, rappresentate dal clustering, possono essere supportate sia da infette (IFN - positivo) che non infette (IFN negativo) cellule che presentano l'antigene. Altre macchie saranno necessarie per individuare l'esatta posizione e ottenere un'indicazione del meccanismo che limita la produzione di IFN a quest'area e il suo rapporto con il trasferimento dell'antigene. È interessante notare che abbiamo scoperto che le cellule T attivate, raggruppate e specifiche dell'antigene si trovano in tutta la polpa bianca della milza, ma producono IFN, solo nelle regioni in cui le cellule NK sono coesistenti con loro (Figura 5). Come tale, la presenza di cellule NK delinea un microambiente specifico nella polpa bianca, in cui le cellule T raggruppate producono IFN, in contrasto con le cellule T raggruppate nell'altra parte della polpa bianca. Ciò suggerisce che l'attivazione delle cellule T non è sufficiente per dettare la produzione di IFN , a questo punto.
Un'altra caratteristica interessante evidenziata dal nostro protocollo è la diversa localizzazione subcellulare di IFN , in NK rispetto a CD8, cellule T5. Come mostrato nella Figura 6, mentre la localizzazione dell'IFN z nelle cellule NK è diffusa nel citosol, le cellule T CD8- T spesso reclutano IFN , verso un'altra cellula T.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig01.jpg"> Figura 1: Marcatori che evidenziano l'architettura della milza. I topi sono stati infettati con 2 x 104 CFU LM-OVA e eutanasia 24 h post infezione. Spleen è stato espiantato ed elaborato come descritto nel protocollo. (A) Le sezioni sono state macchiate per le cellule NK (anti-NCR1 seguite da IgG-FITC anti-capra; verde), cellule OTI-RFP (rosse) e macrofagi (anti-F4/80-APC; magenta). RP - Polpa Rossa; WP - Polpa Bianca. Barra di scala - 200 m.(B) Le sezioni sono state macchiate per le cellule B (anti-B220-Pacific Blue; Blu), cellule OTI-GFP (segnale GFP mostrato in rosso) e macrofagi di zona marginale (anti-CD169-Alexa647; magenta). RP - Polpa Rossa; BF - follicolo a cellule B; T - zona di cella T. Barra della scala: 50 m. Si tratta di un'immagine rappresentativa di 3 esperimenti indipendenti (N ) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig02.jpg"> Figura 2: Il trattamento BFA consente l'individuazione di IFN intracellulare in situ. La produzione è limitata a specifiche aree della spleria I topi sono stati infettati con 2 x 104 CFU LM-OVA e trattati con BFA (A) o lasciati non trattati (B) dopo 18 h. I topi sono stati eutanasia 24 h dopo l'infezione. Spleen è stato espiantato ed elaborato come descritto nel protocollo. Le sezioni sono state macchiate per le cellule NK (anti-NCR1 seguite da Anti-goat IgG-FITC; verde), le celle OTI-RFP (rosso) e IFN (anti-IFN -BV421; ciano). Barra della scala: 5 m. Si tratta di un'immagine rappresentativa delle aree ricche di cellule NK provenienti da 3 esperimenti indipendenti (N - 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig03.jpg"> Figura 3: Cellule produttrici di IFN nella milza. I topi sono stati infettati con 2 x 104 CFU LM-OVA quando indicato e trattato con BFA dopo 18 h. I topi sono stati eutanasia 24 h dopo l'infezione. Spleen è stato espiantato ed elaborato come descritto nel protocollo. Le sezioni sono state macchiate per le cellule NK (anti-NCR1 seguite da Anti-goat IgG-FITC; verde), le celle OTI-RFP (rosso) e IFN (anti-IFN -BV421; ciano). (A) Immagine rappresentativa di una milza proveniente da un topo ingenuo non infetto per dimostrare l'assenza di colorazione non specifica dell'IFN. Linee bianche delineano la polpa bianca. WP - Polpa bianca; RP - Polpa rossa. (B) Immagine rappresentativa della polpa bianca dalla milza di un topo infettato da LM-OVA, che mostra l'invasione delle cellule NK nella polpa bianca e la produzione di IFN - da cellule NK, cellule OTI e cellule non etichettate. Le immagini sono rappresentative di 4 esperimenti indipendenti (N ) . Barre della scala: 70 m (A); e 20 m (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig04.jpg"> Figura 4: La produzione di IFN è limitata ad aree specifiche della milza in seguito all'infezione da LM-OVA. I topi sono stati infettati da 2 x 104 CFU LM-OVA e trattati con BFA dopo 18 h. I topi sono stati eutanasia 24 h post infezione. Spleen è stato espiantato ed elaborato come descritto nel protocollo. Tutte le sezioni sono state macchiate per le cellule B (B220-Pacific Blue Ab, Blue) e IFNs (anti-IFN-biotina seguita da streptavidin-PE; ciano). Celle OTI-GFP (segnale GFP mostrato in rosso). Le linee ciano corrispondono ad aree di alta produzione di IFN. Si tratta di immagini rappresentative di 4 esperimenti indipendenti (N . 4). (A) Le sezioni sono state macchiate per i macrofagi delle zone marginali (anti-CD169-Alexa 647, magenta). La barra di scala èstata macchiata per tutte le macrofagi (F4/80). Barra di scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig05.jpg"> Figura 5: La produzione di IFN e cellule OTI attivate avviene in un microambiente specifico. I topi sono stati infettati da 2 x 104 CFU LM-OVA e trattati con BFA dopo 18 h. I topi sono stati eutanasia 24 h post infezione. Le spleens sono state espiantate ed elaborate come descritto nel protocollo. Le sezioni sono state macchiate per le cellule NK (anti-NCR1 seguite da Anti-goat IgG-FITC; verde), le celle OTI-RFP (rosso) e IFN (anti-IFN -BV421; ciano). Le linee verdi e rosse evidenziano rispettivamente le zone delle celle NK e OTI. La freccia bianca indica esempi di cluster di celle T che non producono IFN. Frecce verdi esempi di gruppi di cellule T che producono IFN. Barra della scala: 100 m. Si tratta di un'immagine rappresentativa di quattro esperimenti indipendenti (N ) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig06.jpg"> Figura 6: Localizzazione subcellulare di IFN, nelle cellule NK e T. I topi sono stati infettati da 2 x 104 CFU LM-OVA e trattati con BFA dopo 18 h. I topi sono stati eutanasia 24 h post infezione. Spleen è stato espiantato ed elaborato come descritto nel protocollo. Tutte le sezioni sono state macchiate per ifNs (anti-IFN - BV421; ciano). Le linee bianche delineano i bordi delle celle e le frecce bianche mostrano la direzionalità della secrezione. Si tratta di un'immagine rappresentativa di due esperimenti indipendenti (N . 5). (A)- Le celle OTI-RFP sono visualizzate in rosso. Barra di scala - 5 m. (B) Le sezioni sono state macchiate per le cellule NK (anti-NCR1 seguite da IgG-FITC anti-capra; verde. Barra di scala : 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging confocale per visualizzare la localizzazione in situ delle cellule che secernono la gamma di interferone citochina negli organi linfoidi secondari murini. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di altre citochine in tessuti diversi.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Questo protocollo è significativo perché ci permette di visualizzare il microambiente in cui le cellule producono una data citochina, qui, gamma di interferone. È ammesso che la gamma di azione delle citochine è limitata perché i tessuti sono così complessi. È importante caratterizzare le cellule che circondano le cellule produttrici di gamma di interferone per individuare quali cellule lo riprenderanno.Il principale vantaggio della tecnica è che non interrompe il microambiente presente nel tessuto di interesse. Inoltre, poiché non restimoliamo artificialmente le cellule per costringerle a produrre gamma di interferone, ci dà una migliore caratterizzazione se le cellule stanno effettivamente producendo attivamente gamma di interferone in situ. Questo protocollo potrebbe essere potenzialmente adattato ad altri organi e per la visualizzazione di altre citochine.La maggior parte dei passaggi di questo protocollo sono semplici, ma la manipolazione del tessuto, il congelamento e la sessatura, devono essere eseguiti con cura per preservare l'integrità del tessuto. Per iniziare, trasferire 300 microlitri di LM coltivati geneticamente modificati in OAV espressi in un'infusione di cuore di brodo a 37 gradi Celsius in un pallone. Posizionare il pallone su uno shaker per un'agitazione delicata per far crescere l'LM in una fase esponenziale fino a quando l'OD600 raggiunge da 0,08 a 0,1.Dopo aver diluito la coltura di OAV LM in PBS a una concentrazione di 0,1 volte la dose letale, il 50% utilizza una siringa per insulina calibro 29 per iniettare per via endovenosa 100 microlitri in C57 neri 6 destinatari di topi selvatici con cellule OT1 GFP o OT1 RFP. Per bloccare la secrezione di citochina 6 ore prima del sacrificio del topo, iniettare 250 microgrammi di BFA e 200 microlitri di PBS intraperitonealmente con la siringa per insulina calibro 29. Dopo l'eutanasia dei topi con anidride carbonica e la successiva lussazione cervicale, pulire l'addome con il 70% di etanolo.Sul fianco sinistro del topo dove si trova la milza, tagliare la pelle con le forbici per fare un'incisione da uno a due centimetri. Quindi, fare con cura un'incisione nel peritoneo per esporre la milza e eserla con una pinzetta. Fare attenzione a non spremere con le forcette o tagliarlo per evitare di interrompere l'architettura della milza.Ora, preparare la soluzione fissante mescolando 3,75 millilitri di PBS e 3,75 millilitri di L-lisina molare 0,2. Aggiungere 21 milligrammi di m-periodato di sodio e mescolare bene. Aggiungere quindi 2,5 millilitri di 4%PFA e 20 microlitri di 12 idrossido di sodio normale.Tagliare la milza in tre parti. Immergere la milza nel fissatore in una piastra a sei porri e fissare per un minimo di quattro ore. Un tipico periodo di fissazione è da 16 a 20 ore a quattro gradi Celsius sotto delicata agitazione.Successivamente, scartare la soluzione fissante e aggiungere cinque millilitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente sotto delicata agitazione. Quindi, sostituire il PBS con cinque millilitri del 30% di saccarosio e incubare per 12-24 ore per mantenere la morfologia dei tessuti. Ora, l'organo affonda nella parte inferiore del piatto.Per congelare il campione, mettere il ghiaccio secco in un grande contenitore e posizionare un recipiente più piccolo all'interno contenente circa 50 millilitri di metanolo puro e alcuni pezzi di ghiaccio secco. Asciugare delicatamente la milza su una salvietta priva di pelucchi. Gocciolare una goccia di composto oct nella parte inferiore dello stampo di base e posizionare la milza all'interno dello stampo.Fare attenzione a non produrre bolle. Aggiungere circa un millilitro di OCT sulla milza. Con le forcep, depositare lo stampo di base sulla superficie del metanolo nel bagno di ghiaccio secco, assicurandosi che il metanolo non tocchi l'OCT.Lo Strumento di personalizzazione di Office si addensa e diventa bianco quando viene congelato. Ricorda di congelare il tessuto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti. Su un crio-microtomo, impostato sulla temperatura di meno 20 gradi Celsius.Sessare il tessuto allo spessore desiderato, circa 10 micrometri. Utilizzare un pennello per raccogliere sezioni su vetrini al microscopio e ispezionare visivamente. Lasciare che le sezioni si aumentare a temperatura ambiente.Disegnare un cerchio con blocco liquido, ad esempio una penna PAP, intorno alla sezione del tessuto all'esterno dello Strumento di personalizzazione di Office. Una volta che il tessuto si è asciugato, reidratare il campione gocciolando 100 microlitri di PBS sulla sezione tissutale per cinque minuti. Quindi, rimuovere il PBS dalla sezione per aspirazione e aggiungere 100 microlitri di soluzione di blocco per sezione del campione.Incubare in una camera bagnata coperta per un minimo di un'ora a temperatura ambiente. Per macchiare con anticorpi primari, sostituire la soluzione di blocco con la miscela di anticorpi primari preparata per ogni campione. Incubare per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera bagnata coperta prima di lavarsi secondo il manoscritto.Ora, diluire gli anticorpi secondari di interesse per una concentrazione ottimale, di solito 2,5 microgrammi per millilitro, nella soluzione di blocco. Rimuovere la soluzione di lavaggio finale dalla sezione e aggiungere la miscela di anticorpi secondari preparata sopra la sezione e incubare per una o quattro ore a temperatura ambiente in una camera umida coperta. Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio secondo il manoscritto, rimuovere la soluzione di lavaggio ed eseguire un lavaggio finale con PBS.Aspirare la salina tamponata dal fosfato e lasciare evaporare il PBS rimanente senza che la sezione si asciughi completamente. Disegnare un cerchio intorno alla sezione sul retro della diapositiva. Quindi, posizionare una goccia del supporto di montaggio sopra il campione, assicurandosi che il mezzo copra l'intera sezione e posizionare con cura un vetro di copertura sopra.Lasciare che il campione polimerasi durante la notte a temperatura ambiente al buio. Al mattino, posizionare lo scivolo sotto un microscopio a scansione laser spettrale invertito. Regolare l'obiettivo a 10x NA 0.40 o 60x NA 1.4 per l'analisi della localizzazione subcellulare della citochina.In questo protocollo, le cellule che producono gamma di interferone vengono visualizzate e localizzate. Il marcatore F4/80 etichetta tutti i macrofagi ed evidenzia la polpa rossa. Il marcatore B220 etichetta le cellule B ed evidenzia i follicoli cellulari B che circondano la zona delle cellule T.Il marcatore CD169 etichetta i macrofagi delle zone marginali che circondano la polpa bianca. 24 ore dopo l'infezione, l'interferone gamma è prodotto da più cellule, incluse le cellule T OT1 CD8 specifiche dell'antigene attivato e le cellule NK. Senza l'uso del BFA per inibire la secrezione di citochine, il rilevamento della gamma di interferone da parte delle cellule NK è stato notevolmente compromesso.Le cellule B, i macrofagi delle zone marginali e tutti i macrofagi sono stati macchiati per delineare la posizione delle cellule produttrici di gamma di interferone a seguito dell'infezione da OAV LM. È interessante notare che sono state trovate cellule T specifiche dell'antigene raggruppato situate in tutta la polpa bianca della milza, ma producono gamma di interferone solo nelle regioni in cui le cellule NK coesistevano con loro. È stata mostrata una diversa localizzazione subcellulare di gamma di interferone e NK rispetto alle cellule T positive cd8.Mentre la localizzazione gamma dell'interferone nelle cellule NK era diffusa nel citosolo, le cellule T positive del CD8 spesso reclutavano gamma di interferone verso un'altra cellula T. L'iniezione di brefeldina A è fondamentale per rilevare la citochina in situ. Le cellule spesso secernono rapidamente e assevano le citochine e dobbiamo inibire la secrezione di citochina per lasciarla accumulare nelle cellule.Questo metodo è uno strumento di scoperta che riporta le cellule produttrici di citochine nel loro ambiente nativo. Decifrare la composizione di questo ambiente ci permette di concentrarci sulle cellule giuste o mediatori immunitari presenti in questa posizione che possono avere un impatto o essere influenzati dalla gamma dell'interferone. C'è una crescente comprensione che la localizzazione precisa di una cellula in un tessuto è cruciale per la sua funzione.Il nostro protocollo ci permette di identificare la localizzazione delle cellule produttrici di citochine e quindi, caratterizzarne ulteriormente la funzione.

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Mostriamo il metodo per l'esecuzione di microscopia intravitale della milza con GFP parassiti della malaria transgenici e la quantificazione della mobilità parassita e del flusso sanguigno all'interno di questo organo.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l'invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Questo video mostra un metodo di imaging per visualizzare la secrezione di interferone-gamma in situ (IFN-γ) nella milza del topo. In seguito all'infezione batterica e all'induzione dell'accumulo di IFN-γ all'interno delle cellule T e delle cellule natural killer, la milza viene prelevata dal topo. Dopo aver ottenuto sezioni di tessuto, viene eseguita l'immunocolorazione per visualizzare l'IFN-γ all'interno delle cellule.

Saggio per l'identificazione della secrezione di interferone-gamma negli organi linfoidi murini

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione...

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

Scopri un metodo di imaging confocale per visualizzare in situ le cellule che producono interferon gamma nella milza del topo dopo infezione da Listeria monocytogenes. Questa tecnica preserva l'architettura tissutale e permette di caratterizzare il microambiente cellulare circostante.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

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