Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

L'immunoprecipitazione è una tecnica molto potente per isolare e purificare una proteina bersaglio. In condizioni lisce, proteine, regolatori o substrati possono essere co-immunoprecipitati. È quindi possibile scoprire una nuova rete di interazione.

Può anche essere valutata l'attività della proteina immunoprecipitata. In particolare, l'attività di una chinasi può essere testata su diversi substrati mediante etichettatura P32-ATP. Tuttavia, può essere valutata l'attività degli inibitori che prendono di mira una chinasi coinvolta in una malattia.

Possono costituire composti di piombo per sviluppare nuovi farmaci. Questo metodo può essere esteso dai mammiferi al lievito o ai batteri. Questa tecnica non è così difficile.

Ai punti chiave: assicurarsi di avere un controllo negativo per assicurarsi che l'interazione rilevata sia specifica e scegliere attentamente le condizioni di lysis per mantenere interazioni e attività. Piccoli dettagli e gesti sono importanti per garantire il successo di questa tecnica e non sono mai descritti nei materiali e nei metodi degli articoli. A dimostrare la procedura sarà Fabienne Godin, tecnico del nostro laboratorio.

Dopo che le cellule sono state preparate nella stanza di coltura cellulare all'interno dell'armadio di biosicurezza, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per rimuovere il supporto dalle piastre e scartarlo in una bottiglia di rifiuti dedicata con candeggina. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DMEM fresco integrato e rimettere le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Per preparare la miscela di trasfezione, in un tubo da 15 millilitri, aggiungere 450 microlitri di soluzione di cloridrato di Tris 10 millimolare a pH 7,5, integrato con un EDTA millimolare e 50 microlitri di soluzione di cloruro di calcio molare da 2,5.

Mescolare per inversione. Nel tubo, aggiungere un volume corrispondente a 10 microgrammi di DNA plasmatico, amplificato da un kit midiprep di DNA e diluito con il tampone di eluizione di questo kit, e la cui concentrazione è stata determinata. Invertire il tubo per mescolare.

Quindi, con agitazione liscia su un miscelatore a vortice, aggiungere lentamente 500 microlitri di concentrato 2X salino tamponato BES, goccia a goccia nel tubo. Spostalo con molta attenzione, per non disturbare la complessa formazione tra DNA e fosfato di calcio. Incubare per almeno 15 minuti, o fino a 45 minuti, a temperatura ambiente.

Ora, trasferire la piastra per trasfettare dall'incubatore all'armadio di sicurezza. Aggiungere i complessi di DNA preparati cadere a goccia sulle cellule su tutta la superficie della piastra. Incubare per 24-72 ore nell'incubatore a 37 gradi Celsius.

Per prevenire la degradazione delle proteine, preparare il tampone di lisi sul ghiaccio, prendendo in considerazione quattro millilitri di tampone di lisi per ogni piastra trasfettata. Prendi il piatto con le cellule trasfette dall'incubatrice. Rimuovere il supporto e scartarlo in una bottiglia di rifiuti di candeggina dedicata.

Per lavare le cellule, aggiungere tre millilitri di PBS freddo sul lato della piastra goccia a goccia, per evitare di staccare le cellule trasfette. E ruotare delicatamente la piastra per stendere il tampone su tutta la superficie. Inclinare la piastra per rimuovere il PBS e scartarlo nella bottiglia di scarto.

Ripetere ancora una volta il lavaggio. Metti il piatto sul ghiaccio. Alla fine, rimuovere con cura il resto del PBS.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi fredda alle cellule lavate trasfette. Stenderlo su tutta la superficie del piatto. Incubare per 10 minuti sul ghiaccio.

Di tanto in tanto, stendere nuovamente il buffer su tutta la superficie della piastra. Successivamente, utilizzare una spatola cellulare per raschiare le cellule dalla superficie e raccoglierle in un tubo di microcentrifugo. Centrifuga per 10 minuti a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius.

Raccogliere il lisciviato supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo e raccogliere un'aliquota di 50 microliter di questa frazione in un altro nuovo tubo di microcentrifugo. Questa aliquota sarà utilizzata per verificare se le proteine trasfette sono ben espresse. Scartare il pellet nella spazzatura.

In primo luogo, rimorsi delicatamente la soluzione stock di perline di agarosio accoppiata con l'anticorpo appropriato. Tagliare l'estremità di una punta da 200 microlitri per fare un'apertura da uno a due millimetri. Attaccare la punta a una micropipetta e disegnare 40 microlitri della soluzione, consentendo alle perline di entrare nella punta.

Pipettare le perline su e giù più volte per saturare la punta per garantire il corretto volume di perline e trasferire le perline in un tubo di microcentrifugo. Aggiungere 500 microlitri di tampone TNET, mescolare per inversione e centrifugare per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 500 microlitri di tampone TNET.

Incubare su una ruota rotante per almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il tubo per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius e lavare le perline due volte con 500 microlitri di tampone di lisi invertendo e centrifugando. Dopo il lavaggio, trasferire il lisato di frazione totale precedentemente raccolto nel tubo e incubare su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per due o quattro ore.

Ora, centrifuga il tubo contenente le perline immunoprecipitate per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Lavare le perline cinque volte con 500 microlitri di tampone di lysis invertendo e centrifugando. Quando si lavano le perline, fare attenzione a non andare troppo vicino dalle perline mentre si rimuove il supernatante.

Altrimenti, le perline saranno aspirate e alla fine dell'esperimento non saranno più lasciate perline. Per l'eluizione, prima centrifuga per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Utilizzare una micropipetta millilitro per rimuovere con cura il supernatante.

Quindi, con una siringa Hamilton dotata di ago cementato, rimuovere le ultime gocce del supernatante per evitare l'aspirazione delle perline. Aggiungere quindi 40 microlitri di tampone Laemmli 4X. Omogeneizzare toccando delicatamente il tubo.

Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare per cinque minuti a 10.000 volte G e temperatura ambiente. Con una siringa Hamilton, trasferire l'eluato supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo.

Conservare a meno 80 gradi Celsius. Le cellule HEK-293 sono state trasfette con LIMK 2-1 senza tag o una delle isoforme taggate HA di LIMK 2. LIMK 2-1 è ben espresso nelle diverse condizioni.

L'anticorpo Anti LIMK 2-1 non riconosce le isoforme LIMK 2a e LIMK 2b, ed è specifico, poiché il suo segnale diminuisce quando le cellule vengono trasfette con un piccolo RNA interferente LIMK2, rispetto al controllo di piccoli RNA interferenti. In varie linee cellulari umane, LIMK 2-1 sembrava essere espresso in HEK-293 e HeLa, ma non in C6. Esperimenti di coimmunoprecipitazione sono stati utilizzati per valutare l'interazione di LIMK2-1 con la chinasi a monte ROCK. Ognuna delle diverse proteine codificate dai vettori trasfettati era ben espressa.

Le tre isoforme di LIMK2, così come la larp6, sono state immunoprecipitate in modo efficiente. Negli eluati, ROCK è stato rilevato e quindi coimmunoprecipitato con le tre isoforme di LIMK2, ma non con larp6. L'interazione rilevata è quindi specifica.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 è stato testato per la sua attività chinasi tramite l'etichettatura gamma P32 ATP. LIMK 2-1 non fosforilato cofilina, mentre faceva fosforilato mielina proteina di base, o MBP. LIMK 2-1 è efficacemente immunoprecipitato in questo test.

È fondamentale avere un controllo negativo durante l'esecuzione dell'immunoprecipitazione per essere sicuri che l'interazione sia specifica. La composizione di un tampone dilisi deve essere accuratamente impostata per preservare l'interazione e l'attività. Al momento dell'immunoprecipitazione, l'attività della chinasi può essere valutata per contare diversi substrati.

La mutazione può essere facilmente introdotta e può dipanare il ruolo di residui specifici. Possono anche essere eseguiti studi funzionali per comprendere il ruolo fisiologico delle nuove interazioni evidenziate. Le cellule devono essere coltivate in una stanza di coltura dedicata all'interno di un armadietto di biosicurezza.

P32 ATP deve essere gestito con particolare cautela. Scudo per proteggere dalle radiazioni, contatore Geiger, raccolta di rifiuti specifici, badge personali per seno e dita per rilevare l'esposizione radioattiva e le punte dei filtri.