Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

L'isolamento nell'analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall'intestino utilizzando questo protocollo si è dimostrato applicabile alla comprensione dei disturbi infiammatori ig e sistemici. Questo metodo isola un numero significativo di cellule mononucleari vitali riducendo al minimo i detriti contaminanti permettendo la successiva fenotipizzazione immunitaria da parte dell'atomistry di Fleur o di altri metodi. Poiché l'intestino è un importante sito bersaglio di infiammazione in molte malattie, questo protocollo può essere utile per lo studio delle popolazioni immunitarie intestinali nei modelli di topo di cancro, allergia, trapianto e autoimmunità.

Per ottimizzare la resa e l'efficienza di questo protocollo, si raccomanda di preparare in anticipo soluzioni e materiali chiave, come indicato. Dopo aver eutanasiato il topo e fatto un'incisione verticale della linea mediana, utilizzare forbici a dissezione fine per aprire il peritoneo. Usando le forcep, spostare il piccolo intestino su un lato ed esporre i due punti discendenti.

Tirare leggermente verso l'alto sul colon discendente per esporre al massimo la porzione rettale del colon. Quindi, tagliare il retto distale in profondità nel bacino e sezionare l'intero colon come un'unità dal retto distale al cappuccio cecale. In primo luogo, posizionare il colon su un tovagliolo di carta inumidito e utilizzare l'estremità smussata di un paio di forbici o forcep per applicare una leggera pressione sulla parete intestinale ed estrarre le feci solide.

Quindi, posizionare il colon in una piastra di Petri e utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago riempito smussato calibro 18 per sciacquare l'intestino con 10 millilitri di tampone del colon refrigerato. Posizionare il colon in una piastra di Petri riempita con 5-10 millilitri di tampone del colon refrigerato e agitare manualmente per lavare il contenuto di colon rimanente. Ripetere questo lavaggio 2-3 volte, utilizzando una nuova piastra di petri contenente tampone fresco per ogni lavaggio.

Successivamente, trasferire il colon in una nuova piastra di Petri contenente tampone di colon fresco refrigerato. Tagliare il colon longitudinalmente dalla sua estremità rettale più muscolosa al colon prossimale, per generare un singolo pezzo rettangolare del colon aperto. Scartare la mediana nel piatto e sostituirla con un tampone del colon refrigerato pulito.

Posizionare il tessuto rettangolare del colon su un tovagliolo di carta che viene inumidito con tampone del colon e tagliarlo tagliarlo orizzontalmente e quindi in piccoli frammenti. Utilizzare forcep fini per raccogliere i frammenti del colon in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri contenente 20 millilitri di tampone del colon refrigerato. Quindi, lavare i frammenti ruotando vigorosamente il tubo per 30 secondi.

Dopo il lavaggio, lasciare che i frammenti di tessuto si sistemino sul fondo del tubo prima di decantare o aspirare sottovuoto il supernatante, Assicurandosi di evitare di perdere frammenti di tessuto, ripetere l'intero processo di lavaggio 3 volte utilizzando il tampone del colon fresco per ogni lavaggio. Per iniziare, aggiungere 20 millilitri di tampone di digestione della collagenasi al tubo contenente i frammenti di colon lavati. Sigillare il tubo e posizionarlo in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius con una velocità di rotazione di 2 volte G per 60 minuti.

Assicurarsi che i frammenti di tessuto siano in costante movimento durante l'agitazione. In primo luogo, versare 5 millilitri di mezzi di separazione della densità a base di silice al 66% in ciascuno dei 3 tubi di polipropilene separati da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per raccogliere solo il supernatante dalla digestione della collagenasi 1.

Filtrare il supernatante attraverso un filtro cellulare in tessuto di filtrazione povero da 40 microlitri posto in un tubo conico in polipropilene pulito da 50 millilitri. Riempire completamente il tubo con tampone del colon refrigerato per spegnere il tampone di digestione della collagenasi. Quindi girare le cellule, aspirare il supernatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.

Continuare a eseguire collagenasi Digestione 2 come delineato nel protocollo di testo. Dopo aver completato la digestione della collagenasi 2, sciacquare vigorosamente i frammenti di tessuto avanti e indietro tra il tubo e una siringa da 10 millilitri attraverso un ago contundente calibro 18. Ripetere questo lavaggio per almeno 7-8 passaggi, continuando fino a quando non sono visibili frammenti di tessuto lordo o debri.

Successivamente, passare la sospensione di disaggregazione del tessuto attraverso un filtro cellulare in tessuto di filtrazione povero di 40 micrometri posto in un tubo di polipropilene pulito da 50 millilitri. Riempire il tubo sul bordo con tampone del colon refrigerato per spegnere la digestione e centrifugare a 800 volte G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Scartare il supernatante tramite aspirazione sottovuoto e estrarre il pellet sospeso dalla digestione della collagenasi 1 al suo tubo corrispondente.

Successivamente, sospendere ogni pellet in 24 millilitri di mezzi di separazione della densità a base di silice al 44% per colon. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per strato lento di 8 millilitri di questo supporto su ciascuno dei 3 tubi contenenti il 66% di mezzi di separazione della densità basati sulla silice. Bilanciare accuratamente i tubi all'interno di secchi di centrifuga utilizzando una bilancia di pesata o una bilancia.

Centrifuga a 859 volte G a 20 gradi Celsius per 20 minuti senza pausa. Lasciare riposare completamente le aste prima di rimuovere i tubi, facendo attenzione a non interrompere le celle all'interfaccia del gradiente. In primo luogo, visualizzare l'interfaccia sfumato vicino al segno di 5 millilitri, dove in genere è presente una banda bianca spessa 1-2 millilitri.

Aspirare e scartare i primi 7 millilitri della sfumatura per consentire un più facile accesso alla pipetta all'interfaccia. Utilizzando l'aspirazione manuale continua e il movimento costante del polso rotante, raccogliere lo strato di interfaccia delle cellule. Raccogliere fino a quando l'interfaccia tra le due sfumature è chiara e refrattaria e trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri.

Aggiungere quindi FACS Buffer a questa vasca fino a quando la sospensione totale raggiunge i 50 millilitri. Centrifuga a 800 volte G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi, aspirare il supernatante tramite aspirazione sottovuoto e sospendere il pellet in 1 millilitro di FACS Buffer.

La procedura descritta in questo video può essere utilizzata per isolare le cellule mononucleari dal colon o, con modifiche, dall'intestino tenue. Inoltre, la citometria e l'analisi dei dati vengono eseguite per confrontare le frazioni di linfociti apoptotici e necrotici / morti quando si utilizza collagenasi E o D per l'isolamento, con il nostro trattamento senza DNAse 1. In seguito all'allegato 5 e alla colorazione fissabile del colorante blu vivo vivo su sospensioni a singola cellula dopo ogni isolamento, la collagenasi E senza DNAsi ha mostrato una percentuale significativamente più elevata di cellule vive dopo l'isolamento rispetto alla collagenasi D senza DNAsi.

Anche se confrontato con entrambe le collagenasi con DNASI. Inoltre, abbiamo identificato le cellule necrotiche con una percentuale mediana del 41,0% nel gruppo Collagenasi E rispetto al 90,0% nel gruppo Collagenasi D. 75,9% nel gruppo Collagenasi E DNAse e 80,3% nel gruppo Collagenasi DNAsi.

La citometria a flusso multiperimetrico viene quindi applicata all'MNC isolato dai topi riceventi valvola-C CD45.2 il giorno 7 dopo aver ricevuto modelli BMT o BMT allogeneici o sigeneici. Vengono calcolati e confrontati i numeri assoluti medio delle cellule T positive del donatore CD4 e CD8 estratte dai due punti del ricevente BMT. Quindi può essere importante identificare e / o quantificare rare popolazioni di cellule immunitarie in tali modelli di topo.

Sottoinsiemi rari, comprese le cellule regolatorie T positive FOX-P3 derivate dal donatore sono valutati sia nei modelli sigeneici che in quelli allogeni BMT. Utilizzando questo metodo, possono essere analizzati anche sottoinsiemi rari, come i due punti del topo riceventi che si infiltrano nel colon del topo del colon ricevente derivato dal donatore T, dopo BMT. Va notato che la collagenasi E è attiva a 37 gradi Celsius.

Quindi tutte le soluzioni di collagenasi dovrebbero essere pre-riscaldate per un'adeguata attività della collagenasi e accuratamente tempre per terminare l'attività. Questo protocollo consente un gran numero di cellule mononucleari che possono essere utilizzate per la successiva caratterizzazione da parte di una citometria fleur, tecniche di biologia molecolare, microscopia, coltura e sito di, tra gli altri. Questo protocollo ha fornito una valutazione affidabile dell'infiammazione nel colon di topi sperimentali contro controllati in un modello di trapianto di midollo osseo.

Facilitando così la scoperta di nuovi meccanismi immunitari normativi di tolleranza ai trapianti. La collagenasi del Clostridium Istoliticum è un reagente che dovrebbe essere maneggiato con tecniche di sicurezza di laboratorio. Rappresenta un pericolo per la salute quando inalato e può causare irritazione della pelle e degli occhi.