Name: Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Scopri la microscopia a cellule vive per studiare la dinamica nucleare del lievito di fissione Schizosaccharomyces pombe durante mitosi e meiosi. Questo metodo non tossico consente l'osservazione in tempo reale dei processi cellulari.

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Gli autori desiderano ringraziare Natalia La Fourcade e Mon LaFerte per aver reso la preparazione di questo manoscritto uno sforzo più piacevole. Grazie ai membri del Forsburg Lab che hanno contribuito al completamento di questo lavoro con la loro comprensione, idee di sperimentazione e sostegno morale. Questo progetto è stato sostenuto da NIGMS R35 GM118109 a SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
<li>Diffraction PSF 3D. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm">http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Convolve ED. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm">http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm">http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging a cellule vive durante la mitosi e la meiosi offre l'opportunità di esaminare le dinamiche nucleari senza interrompere sostanzialmente la fisiologia del lievito di fissione durante l'acquisizione dei dati. Tuttavia, occorre prestare attenzione per garantire che le cellule crescano fino alle densità desiderate senza stress ambientali; e per la meiosi, che le cellule sono immagine durante il tempo di differenziazione terminale e non troppo presto o tardi. L'eccesso di affollamento cellulare, la fame e le temperature di crescita inappropriate sono fattori comuni che contribuiscono alle osservazioni irriproducibili. Inoltre, durante la costruzione del ceppo, è fondamentale verificare che i tag fluorescenti non interferiscano con le funzioni dei geni bersaglio né influiscano sulla forma fisica complessiva delle cellule. Il mancato ispezione approfondita dei fenotipi di ceppi che trasportano marcatori fluorescenti può portare a risultati incoerenti e incomparabili in genotipi simili.
Anche se le pastiglie di agarose al microscopio sono semplici da montare, possono anche rappresentare un ostacolo nell'ottenere dati di imaging preziosi. Creare cuscinetti agarose è semplice come posizionare tre vetrini del microscopio paralleli l'uno all'altro, erogare agarose fuso sul vetrino centrale e mettere una diapositiva che trasversa la parte superiore degli altri vetrini. È utile, tuttavia, assemblare un apparato slide-maker che consente modifiche di larghezza per produrre pastiglie agarose resistenti, specifiche della situazione. Un semplice slide-maker che dà flessibilità di larghezza pad è costituito da una piattaforma (porta punte pipette o la panca), due vetrini al microscopio, e nastro lab che agisce come il meccanismo di regolazione della larghezza pad (Figura 1A). Lo spessore esatto del pad dipenderà dai requisiti di tempo di imaging, dalla marca di agarose, dalla temperatura, dal sigillante coverslip, dal tasso di evaporazione, ecc. Pertanto, è importante calibrare il sistema di imaging prima dell'acquisizione dei dati per aumentare la riproducibilità tecnica e migliorare la qualità dell'imaging live-cell1,2,3. La superficie del pad, la rigidità e la composizione sono essenziali durante l'acquisizione prolungata dell'immagine. Agarose ha bassa fluorescenza di fondo, può essere facilmente modellato, e alla concentrazione appropriata, resiste alla deformazione strutturale a causa dell'evaporazione. Inoltre, la combinazione di supporti di lievito di fissione con agarose non compromette la qualità dell'immagine e consente un'osservazione estesa di mitosi multipli e cicli di meiosi. Inoltre, è importante evitare eventuali bolle d'aria per la microscopia time-lapse. All'interno dei cuscinetti agarose e all'interno del campione, le sacche d'aria si espandono nel tempo, causando lo spostamento delle cellule e l'interruzione dei piani focali. A condizione che le cellule siano diseguate in modo efficiente dalla rotazione dei coverslip, i ricercatori possono seguire i processi mitotici di diverse generazioni e gli eventi meiotici dalla fusione nucleare alla sporulation. Fare e scegliere il pad giusto per gli esperimenti di imaging richiede tempo per padroneggiare, ma una volta raggiunto, può contribuire a osservazioni al microscopio altamente informative.
Come per altri metodi, la microscopia a cellule vive non è priva di limitazioni tecniche. L'uso di proteine fluorescenti introduce confini agli esperimenti che limitano la portata di ciò che può essere studiato. Il fotosbiancamento e la foto-tossicità sono problemi tipici dell'acquisizione prolungata delle immagini. Possono essere contrastati non esponendo le cellule a lunghezze d'onda corte per troppo tempo o troppo frequentemente. Per gli esperimenti che coinvolgono GFP, CFP, YFP, mRFP e DsRed, proteine fluorescenti tipiche utilizzate nell'imaging a celle vive del lievito di fissione, è comune impiegare una luce di eccitazione del 5-15% e un tempo di esposizione di 100-500 ms per gli esperimenti di routine. Questi parametri cambiano, tuttavia, in base alle specifiche esigenze dell'esperimento del ricercatore. Inoltre, gli z-stack sono composti da 9-13 sezioni con spaziatura di 0,5 m utilizzando un obiettivo 60x è sufficiente per risolvere lo spessore di una cella di lievito di fissione. Inoltre, è importante confermare che i marcatori fluorescenti non interrompono la corretta regolazione o funzione delle proteine bersaglio o generano fenotipi spuri. Pertanto, è consigliabile costruire ceppi contenenti diversi tag fluorescenti e di affinità per lo stesso gene bersaglio per corroborare le osservazioni con mezzi diversi. Inoltre, è responsabilità dei ricercatori garantire che i parametri sperimentali possano essere riprodotti attraverso gli esperimenti e che i dati raccolti siano adatti all'analisi a valle1,3. Nessuna tecnologia può sostituire la pratica collaudata nel tempo di validazione meticolosa dei sistemi sperimentali mediante un'attenta osservazione e un rigoroso esame della linearità nel rilevamento dei segnali fluorescenti.
Infine, è fondamentale analizzare i dati di microscopia in formati che non modificano le immagini raw. Fiji fornisce eccellenti strumenti di documentazione per tenere traccia delle misurazioni dei dati grezzi e consente ai ricercatori di esaminare diversi parametri cellulari in una singola sessione. Queste caratteristiche, così come la sua ricchezza di tutorial online e ampia copertura letteraria, rendono Fiji uno strumento importante per misurare, analizzare e presentare dati di imaging di cellule vive che descrivono la dinamica nucleare del lievito di fissione in mitosi e meiosi.

La microscopia a cellule vive consente ai ricercatori di esaminare le dinamiche nucleari senza uccidere le cellule di lievito di fissione ed elimina la necessità di fissativi e macchie letali. È possibile osservare la stabilità, il movimento, la localizzazione e la tempistica delle proteine fluorescenti che sono coinvolte in eventi importanti come la replicazione cromosomica, la ricombinazione e la segregazione, oltre alla membrana e al citoscheletro Movimenti. Mantenendo la vitalità cellulare e il rilevamento del segnale non tossico, c'è un'intrusione fisiologica minima. Se eseguito correttamente, questo metodo di microscopia può ridurre gli effetti di confusione che derivano dalla manipolazione tecnica estesa o dalla reattività chimica spuria. Inoltre, durante un esperimento, i ricercatori possono effettuare osservazioni pertinenti degli stati nutrizionali e di stress del lievito di fissione, dell'efficienza proliferare e dello stato apoptotico che indicano parametri di imaging inappropriati o fisiologia cellulare anomala1 ,2,3.
La mitosi e la meiosi sono caratterizzate dalla divisione nucleare e cellulare. Nella meiosi, contrariamente alla mitosi, il contenuto genetico è dimezzato in quanto le cellule dei genitori danno origine alle cellule figlie4. Poiché l'imaging a celle vive fornisce una dimensione temporale oltre alla relazione spaziale, un gran numero di cellule può essere esaminato in tempo reale. La microscopia a cellule vive ha permesso ai ricercatori di esaminare le dinamiche della divisione nucleare utilizzando tag fluorescenti per itoni5, sottounità coesina6, microtubuli7, centrimeri8, kinetochores9, componenti di il corpo del palo del mandrino (SPB)10,e quelli del complesso passeggeri cromosomico (CPC)11. Al di fuori dell'apparato di segregazione cromosomico, l'imaging delle cellule vive ha catturato anche il comportamento delle proteine necessarie, ma non direttamente coinvolto nella segregazione cromosomica. La funzione di queste proteine ha dimostrato di influenzare la replicazione, la ricombinazione cromosomica, il movimento nucleare e l'attaccamento cromosomico ai microtubuli12,13,14. Queste osservazioni hanno contribuito a una migliore comprensione degli eventi cellulari i cui componenti funzionali non erano suscettibili all'esame biochimico o genetico. Con i nuovi progressi nella tecnologia della microscopia, limitazioni come scarsa risoluzione, fotosbiancamento, fototossicità e stabilità di messa a fuoco diminuiranno, facilitando così migliori osservazioni in tempo reale delle dinamiche nucleari mitotiche e meiotiche1, 2,3. La meiosi è particolarmente impegnativa in quanto è un percorso di differenziazione terminale che richiede una stretta attenzione ai tempi.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo relativamente semplice per esaminare le dinamiche nucleari del lievito di fissione in tempo reale nella mitosi e nella meiosi. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario utilizzare cellule che non sono state esposte allo stress ambientale, preparare pastiglie di agarose in grado di resistere a immagini prolungate e montare le cellule a densità che facilitano la visualizzazione delle dinamiche a singola cellula. Inoltre, questo protocollo si avvale di cellule che trasportano proteine fluorescenti etichettate che fungono da indicatori utili per la cinetica nucleare (Hht1-mRFp o Hht1-GFP), la segregazione cromosomica (Sad1-DsRed), la dinamica del citoscheletro (Atb2-mRFP), l'attivazione in G1/S (Tos4-GFP) e la stabilità della coesione nella meiosi (Rec8-GFP). Questo metodo introduce anche ulteriori marcatori nucleari e citosolici (Tabella I) che possono essere utilizzati in diverse combinazioni per affrontare domande su processi cellulari specifici. Inoltre, strumenti di base Fiji sono presenti per aiutare i ricercatori a elaborare immagini di cellule vive e analizzare diversi tipi di dati. La forza di questo approccio deriva dall'uso di osservazioni in tempo reale di dinamica proteica, tempistica e stabilità per descrivere processi che sono parte integrante per la corretta esecuzione della mitosi e della meiosi.

<table><tbody><tr><td>Obiettivo 60x Plan Apochromat</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore Belly Dancer</td><td>Stovall</td><td>Brevetto USA #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,</td> <td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Plug-in software 3D Convolve</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD CoolSnap HQ</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza a deconvoluzione DeltaVision</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffrazione PSF plug-in software 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edimburgo medio minimo (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1 kg</td><td></td></tr><tr><td>di FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Istidina</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Software di deconvoluzione Huygens</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software di deconvoluzione Imaris</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositolo</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Plug-in software 3D iterativo Deconvolve</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di malto (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Acido molibdico</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Acido nicotinico,</td> <td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Acido pantotenico</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato di pombe medio (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 software di elaborazione delle immagini</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulazione Polvere media</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a temperatura controllata</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito più integratori (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

L'imaging a cellule vive è una tecnica di microscopia utilizzata per esaminare la dinamica delle cellule e delle proteine nelle cellule viventi. Questo metodo di imaging non è tossico, generalmente non interferisce con la fisiologia cellulare e richiede una maneggevolezza sperimentale minima. I bassi livelli di interferenza tecnica consentono ai ricercatori di studiare le cellule attraverso più cicli di mitosi e di osservare la meiosi dall'inizio alla fine. Utilizzando tag fluorescenti come Green Fluorescent Protein (GFP) e Red Fluorescent Protein (RFP), i ricercatori possono analizzare diversi fattori le cui funzioni sono importanti per processi come la trascrizione, la replicazione del DNA, la coesione e la segregazione. Accoppiato con l'analisi dei dati utilizzando Fiji (una versione gratuita e ottimizzata ImageJ), l'imaging a celle vive offre vari modi per valutare il movimento delle proteine, la localizzazione, la stabilità e la tempistica, così come le dinamiche nucleari e la segregazione cromosomica. Tuttavia, come nel caso di altri metodi di microscopia, l'imaging a cellule vive è limitato dalle proprietà intrinseche della luce, che mettono un limite alla potenza di risoluzione ad alti ingrandimenti, ed è anche sensibile al fotosbiancamento o alla fototossicità ad alta lunghezza d'onda Frequenze. Tuttavia, con una certa cura, gli investigatori possono aggirare queste limitazioni fisiche scegliendo attentamente le giuste condizioni, ceppi e marcatori fluorescenti per consentire l'adeguata visualizzazione di eventi mitotici e meiotici.

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

La microscopia a cellule vive consente ai ricercatori di studiare la dinamica nucleare del lievito di fissione in mitosi e meiosi in tempo reale. La forza di questo metodo deriva dallo studio dei processi nucleari nelle cellule viventi in normali condizioni fisiologiche che eliminano la necessità di fissanti e macchie tossiche. Questa tecnica affronta questioni relative alla tempistica, alla stabilità e alla mobilità delle proteine che potrebbero non essere suscettibili alla manipolazione genetica o biomeccanica.È fondamentale prestare molta attenzione alla salute e all'idoneità delle cellule del lievito di fissione prima dell'imaging. Esaminare sempre la morfologia e le caratteristiche di crescita per garantire la coerenza dei risultati tra gli esperimenti. Questo protocollo mostra il modo relativamente semplice per preparare diapositive al microscopio che, se padroneggiate correttamente, possono migliorare la coerenza e la riproducibilità dell'imaging prolungato delle cellule vive.Per iniziare a raccogliere la materia cellulare dalla piastra di risveglio criogenica, strisciarla su piastre SI e incubarla a 25 gradi Celsius o 32 gradi Celsius a seconda del genotipo del lievito per svegliare i ceppi di lievito di fissione dalla conservazione criogenica. Quindi utilizzare un anello sterile per prelevare le cellule dalle singole colonie nei ceppi di lievito di fissione risvegliati e inocularle in provette contenenti tre millilitri di mezzo liquido SI. Posizionare i tubi in uno shaker a 150-220 giri/min per crescere a 25 o 32 gradi Celsius durante la notte fino alla fase di log tardiva con una lettura della densità ottica desiderata da 0,7 a 1,0.Trasferire 10 microlitri della coltura su una diapositiva del microscopio. Indossare un coverslip e metterlo al microscopio per verificare la corretta morfologia cellulare e lo stato nutrizionale. Per impostare uno scivolo al microscopio per l'analisi della mitosi o della meiosi aggiungere prima due grammi di agarosio nel pallone da 500 millilitri contenente 100 millilitri di mezzo minimo più integratori per mitosi o mezzo sporulante liquido per la meiosi.Riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde con una potenza del 60% in incrementi di 10 secondi o posizionare il becher in un bagno d'acqua di 55 gradi Celsius per 10 minuti. Ruotare la soluzione per garantire una fusione efficiente. Impostare due diapositive al microscopio su un supporto per la punta della pipetta con la diapositiva superiore appoggiata su due pile di nastro da laboratorio ad entrambe le estremità come supporto per creare una forma incrociata.Regolare la distanza tra le due diapositive a maggiore di due millimetri per formare un pad spesso nei seguenti passaggi per l'imaging prolungato. Dopo aver raffreddato l'agarosio fuso per un minuto a temperatura ambiente, rimuovere lo scivolo superiore e utilizzare una punta di pipetta ad ampio foro per erogare da 50 a 100 microlitri sullo scivolo inferiore per creare un punto. Prima che l'agarosio si raffredda, posizionare lo scivolo superiore in alto per generare una spalmazione di circa uno e 1/2 a due centimetri di diametro.L'imaging ottimale delle cellule vive è fondamentale per le successive fasi di elaborazione dei dati. Assicurarsi di eliminare eventuali palline d'aria nell'agarosio fuso e creare un pad sottile per periodi di imaging superiori a quattro ore. Per esaminare gli eventi mitotici crescono le cellule dalle colture di avviamento in EMM liquido o PMG più integratori durante la notte.Trasferire un millilitro della coltura in una cuvetta, e misurare sullo spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 595 nanometri. La crescita cellulare è considerata fase a metà log quando la densità ottica raggiunge 0,4. Quindi centrifugare un millilitro della sospensione cellulare a 1.375 volte g per un minuto.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un mezzo minimo più integratori per un volume finale di 100 microlitri. Per immagini eventi meiotici crescono cellule da colture di avviamento in mezzo minimo più integratori durante la notte. La crescita cellulare è considerata fase a log tardivo quando la densità ottica a 595 nanometri è compresa tra 0,7 e uno.Successivamente, dalle colture a log tardivo ottengono 500 microlitri di ogni ceppo di tipo mate, H negativo e H positivo, e si combinano per fare una sospensione cellulare millilitro. Centrifugare le cellule a 1.375 volte g per un minuto. Rimuovere il supernatante e risospendare il pellet in un millilitro di estratto liquido di maltosio.Ripetere il lavaggio dell'estratto di maltosio altre tre volte per garantire un'efficiente rimozione dei nutrienti. Dopo l'ultimo estratto di maltosio lavare risosopendare le cellule in un millilitro di estratto di maltosio e trasferire la miscela in un matraccio da 50 millilitri contenente nove millilitri di estratto di maltosio. Incubare per 12-16 ore a 22-25 gradi Celsius a una velocità di rotazione minima tra 50 e 100 giri/min.La comparsa di molti grumi rotondi di lievito di fissione derivanti da abbondante auto-flocculazione indica un accoppiamento efficiente. Quindi, prendi un campione di un millilitro della coltura di accoppiamento e della centrifuga a 1.375 volte g per un minuto. Rimuovere 750 microlitri del supernatante e rimescolare le cellule nel supernatante rimanente.Vortice vigorosamente per cinque secondi per interrompere i grumi. Erogare 20 microlitri di una sospensione cellulare mitotica o meiotica su un tampone di agarosio al 2%. Rimuovere qualsiasi mezzo in eccesso invertendo la diapositiva e mettendola sulla parte superiore del tovagliolo di carta privo di pelucchi per due o tre secondi.Capovolgere lo scivolo e posizionare delicatamente un coverslip di vetro sulla parte superiore del pad, assicurandosi di non generare bolle d'aria. Per creare un monostrato di cella ruotare il coverslip in senso orario con l'indice per un giro completo per le cellule mitosi o due giri completi per le cellule di meiosi. Assicurarsi che la materia cellulare si disperdi attraverso il cuscinetto di agarosio consentendo una migliore separazione di singole cellule o asci.Con l'aiuto di un piccolo bastoncino di legno erogare sigillante idrocarburi fuso lungo i bordi della coverslip per sigillare ogni tampone di agarosio. Una volta sigillato, il cuscinetto di agarosio lo posiziona sullo stadio del microscopio. Accendere la camera di temperatura e impostarla sulla temperatura desiderata.Posizionare una piastra con un tovagliolo di carta bagnato nella camera per controllare l'umidità del sistema di microscopio. Lasciare equilibrare per 10-15 minuti alle condizioni di imaging appropriate. Ciò consente a tutte le bolle d'aria rimanenti di dissiparsi e di verificarsi qualsiasi cambiamento di agarosio dell'ultimo minuto.Usa l'obiettivo 40X per trovare i campi di visualizzazione appropriati per l'immagine. Passare all'obiettivo 60X per iniziare l'acquisizione dei dati. Nel software che controlla la funzione del microscopio scegli i set di filtri al microscopio che meglio corrispondono ai fluorofori sotto osservazione.Regolare le lunghezze d'onda di eccitazione in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati, utilizzare la potenza di eccitazione più bassa che produce un segnale coerente e utilizzare tempi di esposizione da quattro a otto ore per generare dati di imaging accettabili ma quantificabili e riproducibili. Raccogli almeno sei punti di tempo di acquisizione ogni ora. Nel software di raccolta delle immagini selezionare almeno un canale di fluorescenza da cui acquisire dati e utilizzare un materiale Z composto da 13 sezioni con spaziatura di 0,5 micrometri.Nel software Fiji caricare un'immagine deconvolta selezionando la funzione Di importazione bio-formati nel menu dei plug-in. Nella finestra popup Opzioni importazione selezionare Hyperstack, Modalità colore predefinito, selezionare Scala automatica e premere il pulsante OK. Assicurarsi che la finestra visualizzata abbia il numero corretto di canali di fluorescenza e di frame di tempo scorrendo lateralmente sulle rispettive barre nella parte inferiore.Salvare come file Tiff che non comprime i dati. Quindi, nel menu Analizza (Analyze), utilizzate l'opzione Imposta misure (Set Measurements) per scegliere parametri diversi. Ad esempio:Area, Valore grigio minimo minimo, Densità integrata, Valore grigio medio, Mediana, Posizione stack, Perimetro e Etichetta di visualizzazione.Selezionate Colore (Color) e fate clic sullo strumento Canali (Channels Tool). Nella finestra popup Canali controllare il canale colore per il quale verrà misurata l'intensità o l'area. Selezionare Immagine, quindi Digitare e fare clic su 32 bit.Selezionate le feature Regola (Adjust) e Soglia (Threshold) nel menu Immagine (Image). Selezionare la casella Sfondo scuro, selezionare il metodo Predefinito e selezionare Rosso per sovrapporre i segnali di interesse. Utilizzare lo strumento bacchetta per evidenziare ogni struttura di interesse e premere la lettera T sulla tastiera per aggiungere il ROI selezionato alla finestra di gestione del ROI popup.Aprire quindi la cartella ROI compressa per caricare il gestore del ROI e fare clic su ogni identificatore ROI nel pannello laterale sinistro. Selezionate Misura (Measure) dal menu Analizza (Analyze) e ripetete questo comando su ogni identificatore roi per quantificare gli oggetti di interesse in tutte le sezioni dello stack di immagini. Salvare i risultati come file CSV per l'analisi statistica.In questo studio se le cellule muoiono di fame a causa della limitazione dei nutrienti o della crescita eccessiva, mostreranno vacuoli in eccesso e una diminuzione delle dimensioni delle cellule. Le cellule logaritmiche mostrano la replicazione attiva del DNA e la divisione cellulare, così come l'espressione tos4-GFP pannucleare e la separazione dei focolai Sad1-DsRed. Il mancato accoppiamento, come nel caso in cui le cellule non siano sufficientemente affamate di azoto, impedirà loro di entrare nella meiosi.Viene mostrata una coppia di cellule di fissione sottoposte a cariogamia. La robusta flocculazione della sospensione delle cellule di accoppiamento aumenta l'interazione tra cellule e quindi indica un accoppiamento riuscito e un'efficiente induzione meiotica. Gli asci zigotici prendono molteplici forme, tra cui le forme a zig-zag e a cellule di banana.Nella mitosi come transizione cellulare dalla metafase alla telofasi, il primo cambiamento comporta una contrazione delle dimensioni nucleari nella metafase, mentre il secondo mostra il nucleo che si divide durante l'anafase. Oltre a condividere alcune dinamiche di segregazione con cellule mitotiche, le cellule meiotiche mostrano oscillazione nucleare durante la ricombinazione omologa e l'ulteriore riduzione dei nucleosidi alla fine dell'anafase II.It è responsabilità dei ricercatori garantire che i parametri dell'esperimento possano essere riprodotti attraverso gli esperimenti e che i dati raccolti siano adatti per l'analisi a valle. L'imaging a cellule vive ha permesso agli investigatori di esaminare in dettaglio la meccanica della divisione nucleare nella mitosi e nella meiosi.Man mano che i tag fluorescenti e le capacità del microscopio migliorano il numero e il tipo di processi che possiamo osservare aumenteranno.

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