Name: In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Ontdek hoe je hartveld-specifieke cardiale voorlopercellen genereert uit muizenembryonale stamcellen. Deze methode maakt hoogdoorvoerstudies van congenitale hartziekten en regeneratieve therapieën mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E. T. werd ondersteund door de magie die telt en AHA. C. K. werd gesteund door toelagen van NICHd/NIH (R01HD086026), AHA, en MSCRF.

Opmerking: In vitro generatie van hartgebied-specifieke muis hart voorlopercellen (Figuur 1).
1. onderhoud van de muis Ser's
<ol><li>Grow mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP, MESCISL1-offerte)25 op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium (870 ml van GLASCOW minimale essentiële medium (GMEM), 100 ml foetale boviene serum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml niet-essentiële aminozuren, 10 ml natrium pyruvaat, 3 l van Beta-mercaptoethanol, 20 l van LIF (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 en 0,1 μM PD0325901).</li>
	<li>Wanneer de cellen bereiken 70-80% samenvloeiing, spoel de cellen een keer met fosfaatbuffer Solution (PBS) en vervolgens te scheiden in enkele cellen door toevoeging van 1 mL trypsine en incubatie bij 37 ° c voor 3 min.</li>
	<li>Neutraliseren trypsine door toevoeging van 4 mL van 10% FBS in Dulbecco gemodificeerde Eagle medium (DMEM). Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller.</li>
	<li>Centrifuge ~ 3 x 105 cellen voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende, de cellen opnieuw op te schorten in 5 mL 2i medium en replate op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven voor onderhoud.</li>
</ol>2. generatie van cardiale stamcellen met behulp van cardiale Sferoïden
<ol><li>Centrifugeer 2,5 x 106 cellen van stap 1,3 voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in 25 mL SFD medium (105 cellen/ml). Afhankelijk van de schaal van het experiment, kan het mESC nummer dienovereenkomstig worden aangepast. Opmerking: SFD medium bevat 715 mL van het Iscove gemodificeerde Dulbecco medium (IMDM), 250 mL van de F12 van de ham, 5 mL N2-supplement, 10 mL B27 minus vitamine A, 5 mL 10% (w/v) BSA (in PBS), 7,5 mL GlutaMAX en 7,5 mL penicilline-streptomycine. Voeg ascorbinezuur (50 mg/mL) en 3,9 x 10-3% (v/v) van monothioglycerol voorafgaand aan het gebruik.</li>
	<li>Plaat de cel schorsing in 1 150 mm x 25 mm steriele plaat en Incubeer bij 37 ° c in de 5% CO2 incubator voor 48 h. cardiale sferoïden moet worden gevormd binnen 24 uur.</li>
	<li>Verzamel alle gevormde cardiale sferoïden en centrifugeren voor 3 min bij 145 x g en kamertemperatuur om selectief te isoleren sferoïden en te voorkomen dat enkele cellen.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de sferoïden in 25 mL SFD medium met 1 ng/mL van Activin A en 1,5 ng/mL BMP4 voor differentiatie inductie. Plaat de sferoïden in dezelfde 150 mm x 25mm steriele plaat en incubeer ze bij 37 °C in de 5% CO2 incubator voor 40 h. Opmerking: Verschillende concentraties van Activin A (0-3 ng/mL) en BMP4 (0,5-2 ng/mL) kunnen worden gebruikt voor differentiatie optimalisatie afhankelijk van de mESC lijn.</li>
	<li>Verzamel alle hart sferoïden en centrifugeer voor 3 min bij 145 x g en kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de sferoïden in 25 mL SFD medium. Breng de opnieuw gesuspendeerde EBs over in een ultra-lage bevestigings 75 cm2 kolf en broed ze bij 37 °c in de 5% Co2 incubator voor 48 h.</li>
</ol>3. isolatie van hartgebied specifieke cardiale stamcellen met behulp van TL-Reporters
<ol><li>Centrifugeer cardiale sferoïden bij 145 x g en kamertemperatuur voor 3min en aspireren de bovendrijvende. Voeg 1 mL trypsine toe en Incubeer bij 37 °C voor 3 min. Meng goed door te pipetteren om de cellen te scheiden.</li>
	<li>Voeg 4 mL 10% FBS in DMEM toe om trypsine te deactiveren en meng goed door pipetten. Voor het verwijderen van de niet-gescheiden EBs, filter de mix met behulp van een 70 mm zeef en centrifugeer de gefiltreerde cellen voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.</li>
	<li>Om Cpc's te sorteren die fluorescente verslaggevers dragen (Cpc's voortgekomen uit mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP), aspireren de bovendrijvende en voeg 500 l van FACS Sorteer oplossing toe (1% (v/v) FBS, 200 mm Hepes en 10 mm EDTA in PBS) om opnieuw op te schorten.</li>
	<li>Voor het verwijderen van alle cel clusters voorafgaand aan het sorteren, filter de cellen opnieuw met behulp van een 5 mL polystyreen ronde bodem buis met een 40 μm cel zeef. Houd de cellen op het ijs tot het sorteren.</li>
	<li>Sorteer de cellen te isoleren Tbx1-CRE; Rosa-offerte en HCN4-GFP positieve Cpc's met behulp van een fluorescerende geactiveerde cel Sorter (FACS). Verzamel de gesorteerde cellen in 1 mL FBS. Houd de cel monster en gesorteerd cellen op 4 ° c.</li>
</ol>4. isolatie van hartgebied specifieke cardiale stamcellen met behulp van Cxcr4 als een cel oppervlakte eiwit marker
<ol><li>Te isoleren eerste VS tweede hartveld Cpc's gebaseerd op de expressie van het oppervlak eiwit receptor Cxcr4, gebruik maken van de mESCIsl1-offertelijn. Aspireren de bovendrijvende uit stap 3,3 en hersuspendeer de enkelvoudige Cpc's in 300 l van 10% FBS in PBS met 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 geconjugeerd anti-Cxcr4 antilichaam.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur voor 5min en wassen door toevoeging van 1-2 mL koude PBS. Centrifugeer de enige Cpc's voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur en was nog twee keer gevolgd door centrifugeren.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende en voeg 500 l van FACS Sorteer oplossing toe om de enkelvoudige Cpc's en filter te hersuspenderen als in stap 3,4.</li>
	<li>Isoleer Cxcr4 + en Cxcr4-cellen met behulp van FACS. Verzamel de gesorteerde cellen in 1 mL FBS. Houd de cel monster en gesorteerd cellen op 4 ° c.</li>
</ol>5. analyse van geïsoleerde hartgebied specifieke hart voorlopercellen
<ol><li>Centrifugeer gesorteerde Cpc's voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur. De gesorteerde cellen kunnen voor gen en eiwit uitdrukkings analyses worden gebruikt of zij kunnen voor analyses op recentere tijdpunten worden hercultiveerd.</li>
	<li>Om re-cultuur geïsoleerde Cpc's, aspireren de bovendrijvende, de cellen opnieuw op te schorten in SFD medium en replate ~ 3 x 104 cellen per put van een 384-well plaat bekleed met 0,1% (w/v) gelatine.  Als verhoogde celdood na het sorteren wordt genoteerd, voeg 10 μM van Y-27632 (rots inhibitor) aan het monster toe. Twee dagen na de recultuur, spontane kloppen moet worden opgemerkt.</li>
	<li>Om de capaciteit van plated Cpc's te analyseren om aan cardiomyocytes te onderscheiden, verzamel de cellen bij dag 12 van differentiatie. Gebruik trypsine zoals beschreven in stappen 1.2-1.5 om enig CMs te isoleren. hersuspendeer de cellen in 4% (w/v) Paraformaldehyde (middel) en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur om de cellen vast te zetten.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen voor 3 min bij 895 x g, en kamertemperatuur. Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in PBS om het te wassen. Herhaal deze stap nogmaals.</li>
	<li>Aspireren de bovendrijvende en de cellen opnieuw op te schorten in 10% FBS in PBS. Incubeer de helft van de cel monster met de muis anti-troponine T antilichaam (1:500) en gebruik de rest van het monster als een negatieve controle. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de cellen tweemaal zoals beschreven in stap 5,4 gebruikend PBS. Aspireren de bovendrijvende en hersuspenderen beide cel monsters in 10% FBS in PBS met 1:500 Donkey anti-Mouse IgG (H + L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647 geconjugeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was tweemaal met PBS zoals in stap 5,6. Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in 200 l van PBS. Gebruik een flow cytometer om de cellen te analyseren.</li>
</ol>

<ol><li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li>
<li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
<li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li>
<li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li>
<li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Regeneration%3A+Lessons+From+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292(2013).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li>
<li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1%2C+Nkx2-5%2C+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li>
<li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li>
<li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+heart+disease%3A+entering+a+new+era+of+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413(2012).</li>
<li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li>
<li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164(2014).</li>
<li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li>
<li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp%2FWnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).</li>
<li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets voor de onthullingen.

In ons protocol beschrijven we een methodologie om cardiale sferoïden en geïsoleerde hartveld-specifieke Cpc's te genereren. Die kunnen worden gebruikt om mechanismen van CPC-specificatie en hun eigenschappen te bestuderen, evenals voor cardiale kamer-specifieke ziektemodel lering. Één eerder gepubliceerd werk gebruikte een mESC lijn met twee fluorescente verslaggevers (Mef2c/Nkx 2.5) om cardiogenesis in vitro te bestuderen, echter, worden beide markeringen uitgedrukt bij embryonale dag 9.5-10 wanneer cardiomyocytes reed...

Het gebruik van pluripotente stamcellen (psc's) heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van cardiale regeneratie en gepersonaliseerde geneeskunde met patiënt-specifieke myocytes voor ziektemodel lering en drugs therapieën1,2,3, 4. meer recentelijk, in vitro protocollen voor de generatie van atriale VS ventriculaire evenals pacemaker-achtige PSC-afgeleide cardiomyocytes zijn ontwikkeld5,6. Echter, of cardiogenesis kan worden herschapen in vitro om cardiale ontwikkeling te bestuderen en vervolgens te genereren ventriculaire kamer-specifieke cardiale cellen is nog steeds onduidelijk.
Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, mesodermaal cellen onder invloed van afgescheiden morphogens zoals BMP4, Wnts en Activin een vorm van de primitieve streak7. Cardiale mesodermaal cellen gekenmerkt door de expressie van Mesp1, migreren naar voren en de laatste tijd om de hart sikkel en vervolgens de primitieve hart buis7,8te vormen. Deze migrerende groep van cellen omvat twee zeer verschillende populaties van cardiale stamcellen (cpc's), namelijk de eerste en de tweede hartveld (fhf en SHF)9,10. Cellen uit de SHF zijn zeer proliferative en trekkende en zijn primair verantwoordelijk voor de rek-en lus van de hart buis. Bovendien, SHF cellen differentiëren tot cardiomyocytes, fibroblasten, gladde spieren en endothelial cellen als ze in het hart buis om de rechter ventrikel, rechter ventrikel uitstroom tractus en een groot deel van beide atria7,10te vormen. In tegenstelling, FHF cellen zijn minder proliferatie en trekkende en differentiëren vooral om cardiomyocytes als ze aanleiding geven tot de linker ventrikel en een kleiner deel van de atria11. Bovendien SHF progenitoren worden gekenmerkt door de expressie van Tbx1, FGF8, FGF10 en Six2, terwijl fhf cellen Express Hcn4 en Tbx511, 12,13,14,15.
Psc's kan aan alle drie kiem lagen en later aan om het even welk type van cel in lichaam4,16onderscheiden. Daarom bieden ze een enorm potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en voor het modelleren van specifieke ontwikkelingsstoornissen resulteert in aangeboren hart-en vaatziekten, de meest voorkomende oorzaak van aangeboren afwijkingen17. Een grote subgroep van aangeboren hartziekte omvat kamer-specifieke cardiale afwijkingen18,19. Nochtans, is het nog onduidelijk of deze uit abnormale hart gebiedsontwikkeling voortkomen. Bovendien, gezien het onvermogen van cardiomyocytes te vermenigvuldigen na de geboorte, zijn er uitgebreide inspanningen om cardiale weefsel te creëren voor hart regeneratie1,7,20. Gezien de fysiologische en morfologische verschillen tussen hartkamers, is het genereren van kamer-specifieke cardiale weefsels met behulp van Psc's van groot belang. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot een robuuste generatie van cardiale cellen van Psc's, is het nog onduidelijk of de twee hart velden kunnen worden geïnduceerd in PSC-systemen.
Om recapituleren cardiogenesis in vitro en de studie van de specificatie en de eigenschappen van cpc's, hebben we eerder gebruik gemaakt van een systeem op basis van differentiëren PSC-afgeleide cardiale sferoïden21,22,23,24. Onlangs hebben we gegenereerd muis embryonale stamcellen (mESCs) met GFP en offerte verslaggevers onder de controle van de FHF gen Hcn4 en de SHF gen Tbx1, respectievelijk (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP) 25. In vitro gedifferentieerde mESCs gevormd cardiale sferoïden waarin GFP + en offerte + cellen verschenen uit twee verschillende gebieden van mesodermaal cellen en patroon in een complementaire wijze. De resulterende GFP + en offerte + cellen tentoongesteld FHF en SHF kenmerken, respectievelijk, bepaald door RNA-sequencing en klonale analyses. Belangrijk is, met behulp van mESCs die de Isl1-offerte Reporter (mESCIsl1-offerte), ontdekten we dat SHF cellen getrouw werden gekenmerkt door de cel-oppervlakte-eiwit CXCR4, en dit kan de isolatie van hartgebied-specifieke cellen mogelijk te maken zonder transgenen. Het huidige protocol beschrijft de generatie en isolatie van hart-specifieke Cpc's van mESCs, die als waardevol instrument kunnen dienen voor het bestuderen van kamer-specifieke hartziekten.

<table><tbody><tr><td>& beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>0.1% (w/v) Gelatin</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS zonder calcium en magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>20% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-493</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyreen ronde bodembuis met een 40&mu;m cel zeef</td><td>BD Falcon</td><td>35223</td><td></td></tr><tr><td>Activine A</td><td>R &amp; D Systems</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 zonder vitamine A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R &amp; D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Celsorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td>Sony of een andere fluorescentie-geactiveerde celsorter</td></tr><tr><td>Celzeef 70&mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall Legend XT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004508</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck chemicals</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td></td></tr><tr><td>Corning Ultra Low Attachment T75 fles</td><td>Corning</td><td>07-200-875</td><td></td></tr><tr><td>Countless II FL geautomatiseerde celteller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ezel anti-muis IgG secundair antilichaam, Alexa Fluor 647-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571, Lot #1757130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium hoog glucose (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL microscoop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Invitrogen</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow&rsquo;s MEM (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12</td><td>Gibco</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-Troponin T antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MS-295-P1</td><td></td></tr><tr><td>N2-SUPPLEMENT</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuurlop (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-efluor 710 geconjugeerd anti-Cxcr4 antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>Suspensiecultuurschotel 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>T25 flessen</td><td>Corning</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (Trypsine)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>Stem cell technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro generatie van muis hartveld-specifieke hart voorlopercellen

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotente stamcellen bieden een groot potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en ziekte en voor regeneratieve geneeskunde. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot het genereren van hartcellen uit pluripotente stamcellen, is het onduidelijk of de twee cardiale velden-de eerste en tweede hart velden (FHF en SHF)-worden geïnduceerd in pluripotente stamcellen systemen. Om dit aan te pakken, genereerden we een protocol voor in vitro specificatie en isolatie van hartveld-specifieke cardiale stamcellen. We gebruikten embryonale stamcellen lijnen die Hcn4-GFP en Tbx1-CRE; Rosa-offerte reporters van de FHF en de SHF, respectievelijk, en levende cel immunokleuring van de celmembraan eiwit Cxcr4, een SHF marker. Met deze aanpak genereerden we voorlopercellen die de functionele eigenschappen en transcriptoom van hun in vivo recapituleren. Ons protocol kan worden gebruikt om vroege specificatie en scheiding van de twee hart gebieden te bestuderen en kamer-specifieke hartcellen voor de modellering van de hartkwaal te produceren. Aangezien dit een in vitro organite systeem is, kan het geen nauwkeurige anatomische informatie verstrekken. Echter, dit systeem overwint de slechte bereikbaarheid van gastrulation embryo's en kan worden opgeschaald voor high-throughput schermen.

Na ongeveer 132 h van differentiatie, Tbx1-offerte en Hcn4-GFP Cpc's kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorescerende Microscoop (Figuur 2). Over het algemeen, GFP en offerte cellen verschijnen ongeveer rond dezelfde tijd. De twee populaties van Cpc's blijven groeien in de nabijheid en vaak in een complementair patroon. Aanpassing van de concentraties van Activin A en BMP4 zal veranderen de percentages van FHF VS SHF Cpc's (Figuur 3). De CPC-specificati...

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Onze methode is gericht op het genereren van hartveld-specifieke cardiale voorloper cellen uit muis embryonale stamcellen. Deze hartveldverslaggever stamcellijn zorgt voor de hoge doorvoer studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan aangeboren hart-en vaatziekten, het verstrekken van een systeem dat vatbaar is voor genetische en farmacologische manipulatie. Er zijn verschillende kamerspecifieke aangeboren hartziekten.Door cardiogenese in vitro te recapituleren, maakt dit protocol de studie van het ziektemechanisme en de ontwikkeling van toekomstige regeneratieve therapieën mogelijk. Dit protocol kan inzicht geven in hoe hartvererver cellen van verschillende kamers worden gespecificeerd tijdens de ontwikkeling van het hart. Begin met het kweken van transgene muis embryonale stamcellen in 0,1%gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, spoel de culturen met PBS en voeg een milliliter trypsine per fles om de cultuur te scheiden in enkele cellen op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseert u de reactie met vier milliliters 10 FBS in DMEM en tel de cellen met een geschikte method

in-vitro-generation-of-heart-field-specific-cardiac-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Dit protocol beschrijft hoe functionele sinus nodale weefsel van muizen pluripotente stamcellen (PSC) te produceren. T-Box3 (TBX3) overexpressie plus hartmyosine-zware-keten (Myh6) promotor antibiotische selectie leidt tot zeer zuivere cel pacemaker aggregaten. Deze "Induced-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") bevatten meer dan 80% pacemaker cellen, vertonen een zeer verhoogde kloppend tarieven en zijn in staat om myocard ex vivo tempo.

Generatie van muizen pacemaker celaggregaten Gebaseerd op ES-Cell-programmering in combinatie met Myh6-Promoter-Selection

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO's) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

Ontdek hoe je hartveld-specifieke cardiale voorlopercellen genereert uit muizenembryonale stamcellen. Deze methode maakt hoogdoorvoerstudies van congenitale hartziekten en regeneratieve therapieën mogelijk.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Meer video's verkennen