Name: Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara la coltivazione di Dolioletta gegenbauri per studi di biologia marina e zooplancton. Questo metodo sospende organismi e particelle alimentari nella colonna d'acqua, replicando le condizioni naturali per ricerche ecologiche.

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Siamo grati alle molte persone che hanno contribuito alla conoscenza accumulata a questo progetto nel corso degli anni, tra cui G.-A. Paffenhàfer e D. Deibel che originariamente svilupparono questi protocolli. Anche M. Kàster e L. Lamboley hanno contribuito in modo significativo allo sviluppo di queste procedure.  N.B. L'Pez-Figueroa e l'E.E. Rodriguez-Santiago hanno generato le stime dell'abbondanza di doliolidi fornite nella tabella 1. Questo studio è stato sostenuto in parte dai premi della US National Science Foundation OCE 082599, 1031263 a MEF, progetti collaborativi OCE 1459293 e OCE 14595010 a MEF e DMG e, il premio National Oceanic and Atmospheric Administration NA16SEC4810000 a DMG. Siamo grati all'equipaggio laborioso e professionale della R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparò le figure, Charles Y. Robertson rileviillo del manoscritto e James (Jimmy) Williams produsse la ruota del plancton

1. Preparazione impianti di coltura per l'allevamento D. gegenbauri
NOTA: tutti i materiali e le attrezzature necessari sono elencati nella Tabella dei materiali.
<ol><li>Preparare la soluzione 1 M di idrossido di sodio (NaOH), 0,06M di Potassio Permanganate (KMnO 4). Per preparare questa soluzione, sciogliere 400 g di NaOH in 10 L acqua deionizzata. Aggiungere 100 g di KMnO4 alla soluzione NaOH e mescolare bene.</li>
	<li>Preparare una soluzione bisulfite di sodio (NaHSO3)da 0,1 m dissolvendo 100 g di NaHSO3 in acqua deionizzata da 10 L e mescolare bene. AVVISO: Questi reagenti sono irritanti che possono causare problemi respiratori se inalati. Mettere in una zona ben ventilata come un cappuccio fumatore. Evitare qualsiasi contatto con la pelle. Indossare guanti protettivi, indumenti protettivi, protezione degli occhi e protezione del viso durante la manipolazione.</li>
	<li>Prima di stabilire e allevare colture doliolidi in laboratorio, pulire e sterilizzare i vasi di coltura.<ol>
<li>Sciacquare i barattoli di coltura 1.9 L e 3.8 L almeno 3 volte con acqua deionizzata. Lasciare asciugare i tappi a vite, in quanto i tappi non sono inclusi nei seguenti passaggi di pulizia.</li>
		<li>Pulire e sterilizzare i vasetti della coltura di vetro da 1,9 e 3,8 L immergendoli nella soluzione NaOH/KMnO 4. Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte.</li>
		<li>Rimuovere i vasetti dalla soluzione NaOH/KMnO4 e immergerli nella soluzione bisulfite di sodio (NaHSO3). Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte.</li>
		<li>Rimuovere i vasetti dalla soluzione NaHSO3 e risciacquare accuratamente con acqua deionizzata. Lasciare asciugare i barattoli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare la ruota del plancton (Figura 2) in uno spazio a temperatura controllata (camera ambientale). Elda la temperatura a 20 gradi centigradi. Per una descrizione più dettagliata della ruota personalizzata del plancton, fare riferimento alla Figura supplementare 1.</li>
</ol>2. Cultura del fitoplancton
<ol><li>Ottenere le culture algali dal National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) o altre fonti da utilizzare come cibo per D. gegenbauri. Miscele di due specie flagellolate, tra cui Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740), e una piccola diatoma, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) sono state ottenute dalla NCMA e sono state utilizzate in laboratorio precedente studi per retrovisore i doliodi con successo17.</li>
	<li>Preparare i supporti di crescita L1 e L1-Si22 come raccomandato dal NCMA.</li>
	<li>Seguire le istruzioni fornite dal fornitore per avviare le nuove colture algali.</li>
	<li>Per mantenere le colture stock, utilizzando rigorose tecniche di coltura ascia, trasferire 0,5 mL di vecchia coltura di senescing a 25 mL di nuovi supporti a crescita fresca in sterili tubi di coltura del vetro da 55 mL ogni due settimane. NOTA: Non è possibile memorizzare le culture algali viventi senza trasferirle regolarmente. Se le culture non saranno utilizzate per lunghi periodi e non è possibile mantenere le colture per tutta la durata del periodo di non utilizzo, si consiglia di riacquistare queste culture algali comuni dalle loro fonti originali (ad esempio, NCMA).</li>
	<li>Preparare volumi maggiori di fitoplancton per l'alimentazione di doliolidi in bottiglie di coltura di tessuti plastici puliti da 500 ml contenenti 200 mL di supporti di crescita.<ol>
<li>Fitoplancton inoculato da stock axenici (4 mL) a 200 mL di mezzi di crescita (1:50 didiluizione).</li>
		<li>Incubare a 20 gradi centigradi con un ciclo di luce:scuro di 12:12 h sotto un'illuminazione fredda di luce bianca di 65-85 E/m2. Fiasche di coltura di laici piatte per massimizzare l'illuminazione. Delicatamente vortice cultura ogni giorno.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un contatore di particelle o un microscopio per monitorare la crescita delle colture. NOTA: Dopo 7-10 giorni dall'inoculazione, le colture flagellate conterranno 105-106 celle / mL e la coltura del diatoma conterrà 104-105 celle / mL. Queste concentrazioni sono sufficienti per mantenere le colture doliolidi.</li>
		<li>Avviare nuovi stock di alimentazione ad un minimo di ogni due settimane per fornire biomassa algale sufficiente per sostenere tutte le attività culturali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Collezione di doliolidi selvatici e acqua di mare per la cultura
NOTA: una panoramica degli approcci di raccolta e coltivazione è descritta nella Figura 3. Nella figura 4è disponibile una descrizione della rete e del cod-end di raccolta specializzati.
<ol><li>Individuare i doliolidi rilevandoli utilizzando reti plancton o sistemi di imaging in situ23. NOTA: Poiché i doliolidi sono raramente presenti nelle acque superficiali e non sono rilevabili dalla tecnologia di telerilevamento, guidati da una conoscenza prerequisita delle condizioni favorevoli ai doliolidi (vedi Discussione),la presenza di doliolidi deve essere determinata prima del campionamento.</li>
	<li>Raccogliere l'acqua di mare ricca di particelle prima di raccogliere doliolidi vivi in preparazione per l'atto di l'idea di una coltura D. gegenbauri.<ol>
<li>Distribuire le bottiglie Niskin montate su una rosetta CTD o attrezzature equivalenti per raccogliere l'acqua dal sito in cui si trovano i doliolidi e dalla profondità contenente le più alte stime di clorofilla una concentrazione stimata da fluometria in situ. NOTA: La clorofilla viene utilizzata come indicatore delle concentrazioni di particelle. Sulla piattaforma centro-continentale dell'Atlantico meridionale (SAB), la clorofilla del sottosuolo un massimo è di solito vicino al fondo, ma in altre località, potrebbe non esserlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta individuati i doliolidi, recuperare gli zooidi dolioidi intatti utilizzando la rete e il merluzzo di merluzzo specializzati. Prima di distribuire la rete, riempire il merluzzo con acqua di mare.<ol>
<li>Da una nave alla deriva, abbassare e sollevare la rete attraverso la colonna d'acqua mantenendo un angolo di traino obliquo di 15 - 25 s e dispiegamento verticale e velocità di recupero non superiore a 15 m / min.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che la rete è a bordo, trasferire delicatamente e dividere il contenuto dell'estremità del merluzzo in 3, secchi di plastica da 5 galloni (20 L) ciascuno contenente 10 L di acqua di superficie raccolta dal sito. NOTA: I nuovi secchi di plastica devono essere condizionati dall'aggiunta di giorni di acqua di mare prima di vivere la raccolta dei doliolidi. L'obiettivo è ridurre la lisciviazione delle sostanze chimiche dalla plastica. Se l'acqua di mare non è disponibile, utilizzare purificato (ad esempio, Milli Q) o acqua di rubinetto priva di contaminanti tossici per condizionare i secchi.</li>
	<li>Isolare gli zooidi doliolidi da altri plancton.<ol>
<li>In piccoli lotti (n. 2 L) trasferire plancton misti dal contenuto di traino netto (ora in secchi di plastica da 20 L) a un becher di vetro da 2 L.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta di vetro larga (ID 8 mm x 38 cm di lunghezza), sifone con attenzione e trasferimento attivamente nuotando zooidi doliolidi dal becher in vasi di coltura vetro pulito contenenti acqua di mare ricca di particelle raccolti utilizzando bottiglie Di Niskin da dove i doliolidi sono stati Situato.</li>
		<li>Rilasciare delicatamente gli zooidi doliolidi sotto la superficie dell'acqua di mare. NOTA: Raccogliere gonozoidi, forozoidi contenenti gonozoidi in via di sviluppo associati e stadi infermieristici contenenti trofozoidi collegati (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'aggiunta di doliolidi, aggiungere Rhodomonas sp. coltura ad una concentrazione finale di 5 x 103 – 104 cellule / mL (50 mL di una coltura contenente 5 x 104 – 1 x 105 celle / mL in un barattolo 3.8 L). Questo per determinare se i doliolidi si alimentano attivamente. Quando i doliolidi ingeriscono Rhodomonas sp,il loro tratto digestivo apparirà di colore rosso. Rimuovere gli zooidi che non sembrano nutrirsi.</li>
	<li>Per evitare che i doliolidi rimangano intrappolati nell'interfaccia aria-acqua, evitalo nei barattoli di coltura riempiendo completamente i barattoli con acqua di mare non filtrata ricca di particelle e posizionando un pezzo di involucro di plastica sopra l'apertura del barattolo (89 mm di larghezza).<ol>
<li>Evitare di creare bolle d'aria che possono anche danneggiare gli animali. Avvitare con attenzione il tappo sul vaso e invertire delicatamente il vaso per determinare se sono presenti bolle. Se sono presenti bolle, rimuoverle.</li>
		<li>Dopo che i vasetti sono pieni, pulire l'acqua in eccesso dall'esterno del barattolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Montare ogni barattolo sulla ruota del plancton (Figura 2) posizionando il barattolo sulle barre metalliche verticali ricoperte di tubi di gomma e tra un morsetto in acciaio inossidabile.<ol>
<li>Assicurarsi che la parte posteriore del barattolo sia ammortizzata contro il tubo di gomma. Stringere il morsetto del tubo intorno al barattolo regolando la vite.</li>
		<li>Verificare che il barattolo non si muova una volta fissato in modo sicuro sul posto. Lasciare che i vasetti ruotino a 0,3 rpm per mantenere i doliolidi in sospensione. AMMONIMento: È importante non stringere troppo il barattolo per evitare che il barattolo si rompa.</li>
	</ol></li>
	<li>Sulla nave, mantenere le navi di coltura sulla ruota del plancton a 20 gradi centigradi in luce fioca fino a quando non possono essere trasferite alla struttura di coltura di laboratorio.</li>
	<li>Al ritorno in laboratorio, trasferire i barattoli contenenti doliolidi nella struttura di coltura preparata. Montare i vasetti sulla ruota del plancton (vedere il passaggio 3.8) e consentire ai vasetti di continuare a ruotare a 0,3 rpm. NOTA: Tutti gli allevamento di doliolidi in questo studio sono stati condotti a 20 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Mantenere le colture D. gegenbauri
<ol><li>Dalla nave al laboratorio, consentire agli animali di acclimatarsi nei vasi originali alle condizioni di laboratorio per 3 giorni.<ol>
<li>Durante il periodo di acclimatazione, utilizzare un'ampia pipetta di vetro di foro per scambiare il 10% dell'acqua con acqua di mare non filtrata ricca di particelle dal sito di raccolta ogni giorno per 3 giorni.</li>
		<li>Tenere diversi copepodi nel barattolo, ma rimuovere tutti gli altri zooplancton, grandi pellet fecali e grandi particelle aggregate che potrebbero intasare l'apparato filtrante del dolio (rete di muco). Se la coltura è composta da primi infermieri, tenere un grande gonozoide (6 mm) nel barattolo. NOTA: Non è importante quali specie di copepodi sono incluse nella cultura, ma in questo esperimento, sono state utilizzate le specie più abbondanti presenti da cui sono stati catturati i doliolidi.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo il periodo di acclimatazione, trasferire zooidi e copepodi doliolidi dal vaso originale in un barattolo di coltivazione pulito contenente l'80% di filtro in fibra di vetro (GF/F) filtrato con acqua di mare e il 20% dell'acqua di mare dal vaso originale. Preparare l'acqua di mare filtrata filtrando l'acqua di mare attraverso un GF/F con una dimensione nominale dei pori di 0,7 m di carta da filtro.</li>
	<li>Mantenere la nuova cultura scambiando il 10% dell'acqua con l'acqua di mare filtrata GF/F ogni 3 giorni e rimuovendo aggregati e pellet fecali. Settimanalmente, trasferiscono gli animali in un nuovo barattolo come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Alimentare i doliolidi mantenendo le concentrazioni di fitoplancton nei vasetti di coltura tra i 40 e i 95 g c/L. NOTA: Queste concentrazioni imitano le condizioni ambientali che sono noti per sostenere le condizioni di fioritura per D. gegenbauri17. La miscela di specie di alghe varia a seconda dello stadio di vita e del numero di zooidi in ogni vaso. Durante le fasi della prima vita, aggiungere la miscela 1:1 (per contenuto di carbonio) delle alghe cryptomonad (Isochrysis galbana e Rhodomonas sp.) solo. Le specie di prede più grandi possono facilmente intasare l'apparato alimentare dei piccoli infermieri e sviluppare trofozoidi. Aggiungere la diatoma Thalassiosira weissflogii alla miscela di alghe, anche a uguale contenuto di carbonio, quando si nutrono infermieri più grandi, forozoidi e gonozoidi.<ol>
<li>Monitorare le concentrazioni di alghe prima e dopo l'alimentazione per guidare la decisione di quanto spesso e quanta alghe aggiungere alle culture. Utilizzare un contatore di particelle per determinare le concentrazioni di alghe, perché le concentrazioni di alghe nei barattoli di coltura sono relativamente diluiti.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere abbastanza zooidi per mantenere le concentrazioni di alghe di 40 – 95 gC/L in modo che i doliolidi rimanenti avranno abbastanza cibo per crescere. NOTA: La fase di vita più difficile da mantenere con successo in condizioni di laboratorio è lo sviluppo di larve e oozooid (infermiera precoce). Durante questa fase della coltura, mantenere un grande gonozooid (z 6 mm) oltre a diversi copepodi nel vaso con lo sviluppo di larve e oozooidi (20 per 3,8 L vaso).</li>
	<li>Trasferire almeno 4 infermiere in un nuovo barattolo da coltura una volta che un minimo di 8 trofozoidi sono visibili sul cadoforo dell'infermiera (Figura 1B). NOTA: I trohozoidi raddoppieranno ogni 1 – 2 giorni a 20 gradi centigradi. I trofozoidi sono abbastanza grandi da essere visibili ad occhio nudo.<ol>
<li>Rimuovere due delle infermiere una volta che le infermiere sviluppano 20 trofozoodi.</li>
		<li>Rimuovere un infermiere quando le infermiere sviluppano > 30 trofozoodi sui loro cadofori. Lasciare che l'infermiera rimanente sviluppi i forozoidi sul suo cadoforo.</li>
		<li>Rimuovere l'infermiera una volta che l'infermiera rilascia fino a 30 forozoidi.</li>
	</ol></li>
	<li>Ridurre il numero di animali nel barattolo una volta che i forozoidi raggiungono i 3 mm di dimensione.<ol>
<li>Rimuovere tutti i forozoidi tranne quattro quando i forozoidi diventano più grandi (> 5 mm) e hanno sviluppato cluster gonozoidi.</li>
		<li>Ridurre la coltura a due forozoidi quando il numero di cluster gonozoidi aumenta di dimensioni e inizia a nutrirsi.</li>
		<li>Rimuovere i forozoidi una volta che i forozoidi rilasciano fino a 30 gonozoidi.</li>
	</ol></li>
	<li>Ridurre il numero di gonozoidi da 30 zooidi a 2 per vaso. Lasciare che le uova fecondate vengano rilasciate nel barattolo.<ol>
<li>Rimuovere un gonozooid lasciando un singolo gonozoide nel barattolo una volta che gli oozoidi si sviluppano. NOTA: Infermieri, forozoidi e gonozoidi abbandonati possono essere utilizzati per semare colture aggiuntive e per condurre ulteriori esperimenti.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

La capacità di coltura doliolidi è stata stabilita nel corso degli ultimi decenni ed è stata utilizzata per sostenere la ricerca in diversi settori. Studi sperimentali nei nostri laboratori hanno sostenuto la pubblicazione di almeno 15 studi scientifici incentrati sull'alimentazione e la crescita18,26, riproduzione18,28, dieta6, 29, fisiologia<su...

Lo zooplancton rappresenta la più grande biomassa animale dell'oceano, è componenti chiave nelle nate alimentari marine e svolge un ruolo importante nei cicli biogeochimici oceanici1,2. Lo zooplancton, anche se composto da un'enorme diversità di organismi, può essere grossolanamente distinto in due categorie: gelatinose e non gelatinose con pochi taxa intermedi3,4. Rispetto allo zooplancton non gelatinoso, lo zooplancton gelatinoso è particolarmente difficile da studiare a causa delle loro complesse storie di vita5e i loro tessuti delicati sono facilmente danneggiati durante la cattura e la manipolazione. Le specie di zooplancton gelatinose sono, quindi, notoriamente difficili da coltura in laboratorio e generalmente meno studiate rispetto alle specie non gelatinose6.
Tra i gruppi di zooplancton gelatinosi, uno abbondante e di importanza ecologica nell'oceano del mondo sono i Thaliaceani. I tunicati pelagici sono una classe di tunicati pelagici che includono gli ordini Salpida, Piromida e Doliolida7. I Doliolida, collettivamente chiamati doliolidi, sono piccoli organismi pelagici a forma di barile che possono raggiungere un'elevata abbondanza nelle regioni neritiche produttive degli oceani subtropicali. I Doliolidi sono tra i più abbondanti di tutti i gruppi zooplancton4,8. Come alimentatori di sospensioni, i doliolidi raccolgono particelle di cibo dalla colonna d'acqua creando correnti filtranti e catturandole sulle reti di muco9. Tassonomiamente, i doliolidi sono classificati nel phylum Urochordata10. Ancestrali ai cordati, e oltre al loro significato ecologico come componenti chiave dei sistemi pelagici marini, i taliacei sono importanti per comprendere le origini della storia della vita coloniale10,11 e l'evoluzione dei cordati5,7,10,12,13,14.
La storia della vita dei doliolidi è complessa e contribuisce alla difficoltà di coltivarli e sostenerli durante il loro ciclo di vita. Una rassegna del ciclo di vita e dell'anatomia doliolidi può essere trovata in Godeaux etal. Il ciclo di vita del doliolide, che comporta un'alternanza obbligatoria tra le fasi della storia sessuale e asessuata, è presentato nella Figura 1. Uova e spermatozoi sono prodotti dai gonozoidi ermatodici, l'unica fase solitaria del ciclo di vita. I gonozoidi rilasciano spermatozoi nella colonna d'acqua e le uova vengono fecondate internamente e rilasciate per svilupparsi in larve. Le larve si schiudono e si trasformano in ozooidi che possono raggiungere 1-2 mm. Suming suming conducive environmental conditions and nutrition, oozooids become early nurses within 1-2 days at 20 sC and initiate the colonial stages of the life cycle. Gli oozoidi producono cime sul loro stolone ventrale. Queste gemme lasciano lo stolone e migrano verso il cadoforo dorsale dove si allineano in tre file accoppiate. Le doppie file centrali diventano forozoidi e le due file doppie esterne diventano trofozoidi. Questi ultimi forniscono cibo sia all'infermiera che ai forozoidi16,17. I trofozoidi forniscono all'infermiera la nutrizione quando perde tutti gli organi interni. Con l'aumentare dell'abbondanza di trofozoidi, la dimensione dell'infermiera può raggiungere i 15 mm in laboratorio. Man mano che i forozoidi crescono, ingerino sempre più prede planctoniche e raggiungono 1,5 mm di dimensione prima di essere rilasciati come individui17. Un singolo infermiere può rilasciare > 100 forozoidi durante la sua durata18. Dopo che i forozoidi vengono rilasciati dal cadoforo, continuano a crescere e sono la seconda fase coloniale del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 5 mm, ogni forozoide sviluppa un gruppo di gonozoidi sul loro peduncolo ventrale. Questi gonozoidi possono ingerire particelle quando raggiungono 1 mm di lunghezza. Dopo che i gonozoidi hanno raggiunto le dimensioni da 2 a 3 mm vengono rilasciati dal forozoide e diventano l'unica fase solitaria del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 6 mm di dimensione, i gonozoidi diventano sessualmente maturi17. I gonozoidi possono raggiungere 9 mm o più di lunghezza. I gonozoidi sono ermafroditici, lo sperma viene rilasciato a intermittenza mentre la fecondazione degli ovuli avviene internamente16,17. Quando il gonozooid è di 6 mm di dimensione, rilascia fino a 6 uova fecondate. Una coltura di successo richiede il sostegno alle esigenze specifiche di ognuna di queste fasi uniche della storia della vita.
A causa del significato ecologico ed evolutivo dei tualiacei, compresi i doliolidi, c'è bisogno delle metodologie di coltivazione per far progredire la comprensione della biologia unica di questo organismo, della fisiologia, dell'ecologia e della storia evolutiva19 . I Doliolidi hanno notevoli promesse come organismi modello sperimentale nella biologia dello sviluppo e nella genomica funzionale perché sono trasparenti e probabilmente hanno genomi semplificati20,21. La mancanza di metodi di coltivazione affidabili, tuttavia, ne ostacola l'utilità come modelli di laboratorio. Anche se una manciata di laboratori hanno pubblicato risultati basati su doliolidi coltivati, per i nostri approcci di coltivazione della conoscenza e protocolli dettagliati non sono stati pubblicati in precedenza. Sulla base di anni di esperienza, e tentativi di prova ed errore di coltivazione, lo scopo di questo studio era quello di rivedere le esperienze e di condividere i protocolli per la raccolta e la coltivazione di doliolidi, in particolare la specie Dolioletta gegenbauri.

<table><tbody><tr><td>Provette per colture algali (55 mL di provette sterili monouso in vetro)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per colture algali</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per apparecchiature di sterilizzazione e acqua di mare per colture algali</td></tr><tr><td>Bicchieri (vetro da 2 L)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per lo smistamento del plancton diluito Contenuto netto del rimorchio</td></tr><tr><td>Secchi (5 galloni, ~20L)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per diluire il contenuto della stoppa della rete planton - deve essere condizionato con acqua di mare prima del primo utilizzo</td></tr><tr><td>Damigiane (20 L)&nbsp;</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Per conservare l'acqua di mare</td></tr><tr><td>Barattolo di coltura in vetro Doliolid (barattolo di vetro a bocca stretta da 1,9 L con tappo)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01882</td><td>Contenitore per coltura</td></tr><tr><td>Barattolo di coltura in vetro Doliolid (barattolo di vetro a bocca stretta da 3,8 L con tappo)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01858</td><td>Contenitore per camera</td></tr> ambientale di coltura <tr><td>(camera ambientale a temperatura controllata)</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Per ospitare la ruota del plancton e la manutenzione delle colture</td></tr><tr><td>Apparato di filtrazione per filtri da 47 mm</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per filtrare l'acqua di mare per le colture</td></tr><tr><td>Filtri in microfibra di vetro, 47 mm</td><td>Whatman</td><td>1825-047</td><td>Per filtrare l'acqua di mare per le colture</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro (pipetta in vetro borosillicato, tubo di vetro), OD 10 mm, ID 8 mm, spessore della parete 1 mm)</td><td>Science Company</td><td>NC-10894</td><td>Taglio e bordi personalizzati lucido</td></tr><tr><td>Fascette stringitubo, acciaio inox, #104 (178 mm)</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Per fissare i vasi di coltura al ceppo plancton wheel</td></tr><tr><td>Isochrysis galbana CCMP1323</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td><td>strain CCMP1323</td><td>Per l'alimentazione di colture doliolid</td></tr><tr><td>L1 Media Kit, 50 L</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td><td>MKL150L</td><td>Per la coltura di alghe</td></tr><tr><td>Lampada (Lampada da tavolo fluorescente con braccio regolabile)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per illuminare i doliolids nei barattoli e nei becher Incubatore</td></tr><tr><td>illuminato a temperatura controllata</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per colture algali</td></tr><tr><td>Micropipette e puntali sterili (0-20 &; micro; l, 20-200 &micro; l, 200-1000&nbsp; &micro; l)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per colture algali</td></tr><tr><td>Plancton Net (202 &micro; m 0,5 m, lunghezza 5:1) con anello di estremità del sacco e &nbsp; Sacco acquario da 4 L</td><td>Sea-Gear Corporation</td><td>90-50x5-200-4A/BB</td><td>Per la raccolta di doliolid vivi (vedi Figura 4)</td></tr><tr><td>Plankton Wheel</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Costruito su misura (vedi Figura 2)</td></tr><tr><td>Involucro di plastica</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per coprire l'interno del coperchio dei barattoli di coltura doliolid</td></tr><tr><td>Permanganato di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P279-500</td><td>Reagente per la pulizia di barattoli e vetreria</td></tr><tr><td>ceppo Rhodomonas sp. CCMP740</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td> <td>ceppo CCMP740</td><td>Per l'alimentazione di colture di doliolidi</td></tr><tr><td>Tubi di gomma</td><td>NA</td><td>NA Per</td><td>tenere i vasi di coltura alla ruota del plancton (può essere fatto da tubi di tygon)</td></tr><tr><td>Bisolfito di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S654-500</td><td>Reagente per la pulizia di barattoli e vetreria</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td>Reagente per la pulizia di barattoli e vetreria</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per colture algali</td></tr><tr><td>Thalassiosira weissflogii ceppo CCMP1051</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td><td>ceppo CCMP1051</td><td>Per l'alimentazione di colture doliolid</td></tr><tr><td>Palloni per colture tissutali (250 mL)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per colture algali</td></tr></tbody></table>

coltivazione del marine pelagic tunicate dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) per studi sperimentali

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gli zooplancton gelatinosi svolgono un ruolo cruciale negli ecosistemi oceanici. Tuttavia, è generalmente difficile studiare la loro fisiologia, crescita, fecondità e interazioni trofiche principalmente a causa di sfide metodologiche, compresa la capacità di colture. Questo è particolarmente vero per il doliolide, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri si verifica comunemente nei sistemi produttivi di scaffale continentale subtropicale in tutto il mondo, spesso a concentrazioni di fioritura in grado di consumare una grande frazione della produzione primaria giornaliera. In questo studio, descriviamo approcci di coltivazione per la raccolta, l'allevamento e il mantenimento di D. gegenbauri allo scopo di condurre studi di laboratorio. D. gegenbauri e altre specie di doliolid possono essere catturati dal vivo utilizzando obliquamente towed conico 202 m reti a rete da una nave alla deriva. Le colture sono stabilite in modo più affidabile quando le temperature dell'acqua sono al di sotto dei 21 gradi centigradi e sono iniziate da gonozoidi immaturi, fostozoidi in scadenza e grandi infermieri. Le colture possono essere mantenute in vasi di coltura arrotondati su una ruota di plancton che ruota lentamente e sostenuta su una dieta di alghe coltivate nell'acqua di mare naturale per molte generazioni. Oltre alla capacità di stabilire colture di laboratorio di D. gegenbauri, dimostriamo che la condizione di raccolta, la concentrazione di alghe, la temperatura e l'esposizione all'acqua di mare naturalmente condizionata sono tutti fondamentali per la coltura crescita, sopravvivenza e riproduzione di D. gegenbauri.

Seguendo le procedure descritte per la raccolta e la coltura del doliolide, D. gegenbauri delineato figura 3, è possibile mantenere una cultura di D. gegenbauri per tutta la sua storia di vita complessa (Figura 1) e sostenerlo per molte generazioni. Anche se la coltivazione di D. gegenbauri è descritta qui, queste procedure dovrebbero essere rilevanti anche per la coltivazione di altre specie doliolidi.
L'ac...

I Doliolidi, tra cui la specie Dolioletta gegenbauri, sono piccoli zooplancton marina gelatinosi di significato ecologico che si trovano sui sistemi produttivi di scaffale subcontinentale in tutto il mondo. La difficoltà di coltivare questi delicati organismi limita la loro indagine. In questo studio vengono descritti gli approcci di coltivazione per la raccolta, l'allevamento e la manutenzione del doliolide Dolioletta gegenbauri.

Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

La disponibilità di organismi modello culturabili è stata fondamentale per il progresso in molti campi di studio. Questo protocollo, per quanto ne sappiamo, è l'unico approccio disponibile per coltivare i Doliolidi. L'affidabile tecnologia di coltura doliolidi fornisce un modello sperimentale unico per studiare organismi che sono importanti per alcune delle regioni più produttive dell'oceano e che rappresentano i primi antenati evolutivi dei vertebrati.Questa tecnica è unica in quanto mantiene le particelle di cibo algale e gli organismi sospesi nella colonna d'acqua senza contatto con le pareti del contenitore come sperimentano in natura. Questo metodo di coltivazione può essere applicato alla coltivazione di altre piccole specie gelatinose e crostacee o plancton. Poiché i Doliolidi hanno un ciclo di vita complesso, comprendere e riconoscere le esigenze di ogni fase della vita è fondamentale.Imparare il ciclo di vita e come riconoscerli e gestirli richiede molta pratica. Nella nostra esperienza, l'unico modo per imparare questa tecnica di coltivazione è vederla e farlo. Molti altri partecipanti al progetto, tra cui Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye,

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Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali

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