Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Il nostro protocollo consente la cattura della relazione genetica tra lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione di alterazioni molecolari coinvolte nella progressione della malattia. Il nostro metodo offre l'opportunità di esplorare la relazione genetica in esemplari clinici ad alta sensibilità e specificità. Ciò è dovuto all'integrazione dell'analisi molecolare e istopatologica.

La valutazione dell'eterogeneità intratumorale nel campo della ricerca sul cancro è di fondamentale importanza nella progettazione di strategie antitumorali efficaci e il nostro metodo è ampiamente applicabile a molti tipi di tumore solido. Dopo aver preparato e quantificato le librerie di interesse, diluire ogni libreria a una concentrazione di 100 picomolare in acqua priva di nucleasi e combinare 10 microlitri di ogni libreria diluita per una singola corsa in un unico tubo. Quindi mescolare le librerie raggruppate mediante pipettazione.

Per avviare un'esecuzione di sequenziamento, aprire prima il browser Torrent su un computer collegato al sistema di sequenziamento. Pianificare una nuova esecuzione utilizzando il modello generico per l'applicazione selezionata e nella scheda kit selezionare sistema Ion Proton o sistema Ion Gene Studio S5. Selezionate il chip appropriato dal menu a discesa tipo chip e selezionate Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit dall'elenco a discesa del kit libreria.

Selezionare il pulsante Ion Chef per il kit di modelli e selezionare il kit chef appropriato dall'elenco a discesa del kit modello. Selezionate il kit di sequenziamento appropriato dal menu a discesa del kit di sequenziamento e selezionate Ion Express dall'elenco a discesa set di codici a barre. Nella scheda plug-in selezionare il plug-in di analisi della copertura.

Nella scheda piano selezionare il genoma GRCH37HG19 dall'elenco a discesa della libreria di riferimento. Nell'elenco a discesa aree di destinazione selezionare il pannello appropriato da sequenziare. Impostare quindi il numero di codici a barre da sequenziare e impostare il nome del codice a barre e il nome di esempio per ogni libreria.

Per una diluizione delle librerie raggruppate, diluire la libreria di serie con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 25 picomolare per un chip protonico ionico e pipettare 50 microlitri di ogni libreria diluita sul fondo del tubo campione della libreria appropriata. Caricare i tubi campione contenenti le librerie diluite raggruppate nel sistema di preparazione della libreria e avviare l'amplificazione clonale. Per il sequenziamento di nuova generazione, seguire le istruzioni visualizzate per inizializzare lo strumento.

Al termine dell'amplificazione clonale, aprire la porta dello strumento Ion Chef, quindi aprire il coperchio della centrifuga di caricamento del truciolo e rimuovere i due chip dal sistema di preparazione della libreria. Posizionare i trucioli in contenitori separati per lo stoccaggio dei trucioli e caricare uno dei trucioli nel vano truciolo nello strumento. Quindi chiudere il coperchio del vano truciolo e iniziare il sequenziamento.

Per l'analisi delle mutazioni, aprire il plug-in di analisi della copertura e utilizzare l'output di analisi della copertura per verificare la profondità di copertura e uniformità. Utilizzare il plug-in Torrent Variant Caller per eseguire la chiamata variante selezionando la linea germinale o il flusso di lavoro somatico a caso. Quindi scaricare i file di formato delle chiamate variante varianti filtrate e utilizzare il software di predittore dell'effetto variante nel database NCBI RefSeq per annotare le varianti.

Per stimare le variazioni del numero di copia, utilizzare il plug-in uploader ion reporter per caricare i dati di sequenziamento nel software ion reporter e utilizzare il flusso di lavoro completo della coppia normale tumorale del pannello tumorale per analizzare i dati. Filtrare manualmente le mutazioni e le variazioni del numero di copia in base ai punteggi assegnati dal software e verificare visivamente le variazioni con il Visualizzatore genomico integrativo. Quindi ispezionare visivamente l'allineamento alla ricerca di letture insolite che possono generare chiamate artefatto e ispezionare la copertura normalizzata per tutte le ampliconi attraverso un determinato gene rispetto alla copertura normalizzata della linea di base per verificare le variazioni del numero di copia.

Per ogni caso, indice la mutazione chiama dal sequenziamento del tessuto normale o del sangue o tumore primario o metastasi. Contrassegnare come linea germinale e scartare le chiamate che sono evidenti anche dai dati di sequenziamento del DNA della linea germinale. Contrassegnare come clonale o fondatore le mutazioni che sono condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente.

Quindi contrassegnare come sottoclonale o progress o le mutazioni rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente. In questo esperimento rappresentativo, il sequenziamento multi-lesione di cinque casi di neoplasia pseudopapillare solida mirati alle sequenze codificanti di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in otto geni. Le mutazioni sono state definite come fondatrici o clonali se condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente e progressor o sottoclonale quando rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente.

Coerentemente, la colorazione immunoistochimica per la betacatenina e il KMD6A era omogenea tra le diverse lesioni dei casi con mutazioni dei geni corrispondenti. La colorazione moderata per KMD6A in esemplari mutati suggerisce che l'alterazione genetica potrebbe alterare la funzione piuttosto che l'espressione della proteina. KMD6A perdita di funzione nei tumori pancreatici è associata alla regolazione verso l'alto del marcatore di ipossia GLUT-1.

E di conseguenza, glut-1 era sovrascrivo nei casi con mutazioni del KMD6A. L'immunoistochimica per BAP1 e TP53 ha confermato che le mutazioni in quei geni erano subclonali. In questo cariotipo virtuale di un caso rappresentativo che mostra la posizione, la prossimità e lo stato del numero di copia dei geni alterati, l'analisi della variazione del numero di copia utilizzando i dati di sequenziamento ha rivelato alterazioni in tutti i campioni analizzati.

E a differenza delle mutazioni puntili, la maggior parte delle alterazioni della variazione del numero di copia erano soclonali. La convalida e l'indicizzazione delle mutazioni e la variazione del numero di copia e l'utilizzo del normale confronto del DNA tumorale sono importanti per evitare la generazione di chiamate artefatto che potrebbero invalidare i risultati. Questa procedura potrebbe essere applicata anche agli studi di sequenziamento dell'intero genoma volti a interrogare l'intero genoma per l'identificazione della mutazione tra lesione di diversi tipi di tumore solido.

Nel campo della ricerca sul cancro, queste tecniche sono strumenti critici per comprendere la biologia delle malattie con importanti implicazioni cliniche volte a progettare terapie mirate personalizzate ed efficaci.