Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Il nostro protocollo è significativo perché fornisce il primo metodo quantitativo ex vivo per valutare la motilità spontanea di un utero intatto. Questo nuovo approccio offre un'alternativa facile e meno costosa per testare il potenziale rilassante dei rimedi naturali nei composti sintetici. Un grande vantaggio di questa tecnica è che tutte le interazioni cellulari intrauterina rimangono intatte durante l'esperimento.

Oltre la contrattilità dell'utero è associata alla dismenorrea, per la quale i rilassanti uterina possono essere utili per il trattamento. Questo metodo fornisce un modo semplice per testare nuovi rilassanti. Dopo aver confermato la fase del ciclo estrosa, posizionare il mouse in posizione supina e stendere le estremità per esporre la regione pelvica addominale.

Bagnare l'addome con il 70% di etanolo e utilizzare le forcep per sollevare con cura la pelle superiore al clitoride. Fare piccole incisioni trasversali sugli aspetti laterale della zona addominale inferiore fino agli arti superiori per esporre il peritoneo. Tagliare con cura il peritoneo per esporre il tratto gastrointestinale senza danneggiare le corna uterine e utilizzare le forcelle per rimuovere la fascia e il tessuto adiposo che copre il tratto gastrointestinale.

Rimuovere il duodeno, il giunone, l'ileo, il cieco e il colon ascendente e trasversale. Individuare la vescica urinaria per localizzare la vagina che si trova direttamente sotto la vescica urinaria. Individuare la sinfisi pubica alla confluenza delle ossa pubiche, caudale alla vescica e utilizzare le forbici per fare con cura un'incisione sui lati laterali della sifisi pubica attraverso il tessuto fibrocartilaginoso interpubico per ottenere l'accesso e fornire una via per l'estrazione vaginale.

Tagliare attraverso il perineo situato tra l'ano e la parte inferiore della vulva e utilizzare le forcep per sollevare la vagina per consentire una lenta escissione del retto. Identificare le due corna uterine che biforcano in una forchetta rostralmente nella vagina e individuare un ovidotto contorto e un'ovaia alla fine di ogni corno. Identificare correttamente le corna uterine è fondamentale per la procedura per garantire che i tessuti non siano danneggiati.

Utilizzare piccole forbici sezionanti per rimuovere eventuali legamenti che si collegano e sostengono le corna, gli ovidotti e le ovaie all'interno della cavità addominale e rimuovere la vagina, l'utero, gli ovidotti e le ovaie. Trasferire l'intero tratto riproduttivo isolato in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente 10 millilitri del PBS di Dulbecco. Utilizzare forcelle e forbici chirurgiche per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e adiposo che circonda le corna uterine e la vagina, nonché qualsiasi pelliccia nella regione pubica che potrebbe ostacolare la qualità dell'immagine.

Rimuovere l'ampio legamento per consentire la motilità delle corna uterine e lavare il tessuto due volte con pbs di Dulbecco fresco per lavaggio prima di trasferire il tratto riproduttivo isolato in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente tre millilitri di soluzione di Krebs ossigenata. Per l'imaging spontaneo della motilità, posizionare la piastra di Petri su una superficie nera a temperatura ambiente e lasciare da 15 a 30 minuti per l'inizio delle contrazioni spontanee. Quando è possibile osservare il movimento, registrare la motilità uterina spontanea per 10 minuti da un piano assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.

Successivamente, trasferire la preparazione in una piastra di Petri contenente tampone krebs ossigenato integrato con il composto di prova e registrare la motilità uterina spontanea per altri 10 minuti nello stesso modo. Alla fine del periodo di registrazione, lavare l'intero tratto riproduttivo in 10 millilitri del PBS di Dulbecco in una piastra di Petri da 100 millimetri e trasferire il campione in una nuova piastra di Petri di tampone Krebs appena ossigenato per valutare la reversibilità del trattamento. Registrare la motilità uterina spontanea per circa 10 minuti nello stesso modo, come per le ultime due registrazioni.

Quindi trasferire la preparazione in un'altra piastra di Petri di 35 millimetri riempita con tampone Krebs ossigenato integrato con il veicolo per il composto di prova per garantire che non ci siano cambiamenti indotti meccanicamente nella motilità uterina spontanea. La preparazione del tratto riproduttivo presentava un'elevata motilità nei pannelli A e C in assenza di epinefrina. Ma questo fenotipo è dormiente nel pannello B con la presenza di un micro muller epinefrina.

Qui viene mostrata un'analisi dei dati del campione della somministrazione di epinefrina e del recupero spontaneo della motilità, che illustra come gli effetti dell'ormone sulla motilità spontanea del tratto riproduttivo possano essere quantificati dalle registrazioni del tessuto prelevate prima, durante e dopo il trattamento del composto di prova. È importante evitare di comprimere o allungare eccessivamente le corna uterine altrimenti non verrà osservata alcuna contrattilità spontanea. Il nostro metodo può anche essere utilizzato per testare composti che possono aumentare la contrattilità dell'utero.

Questa procedura può essere applicata all'utero in gravidanza del topo nelle prime fasi della gravidanza. Questo esperimento ha il potenziale per essere aggiornato a un formato a sei piastre di pozzo per lo screening dei farmaci di produttività.