Name: Analisi anticorp-free per lanalisi dellattività di RNA methyltransferase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri un saggio in vitro senza anticorpi per analizzare l'attività delle RNA metiltransferasi usando S-adenosil-metionina tritiata. Questo metodo consente quantificazione e visualizzazione affidabili della metilazione dell'RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Turja Kanti Debnath per il suo aiuto con ChemDraw. La ricerca nel laboratorio di Xhemalèe è supportata dal Department Of Defense - Congressionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 e fondi di start-up dell'Istituto Biologia molecolare e College of Natural Sciences presso l'Università del Texas ad Austin, USA.

1. Trascrizione in vitro e purificazione del gel dell'RNA bersaglio
<ol><li>Clonare la sequenza di interesse in plasmidi contenenti promotori T7 e/o SP6 utilizzando tecniche di clonazione molecolare stabilite12 o kit.</li>
	<li>Linearizzazione del modello di DNA per la trascrizione in vitro
	<ol>
<li>Amplificare la sequenza di interesse da parte della PCR del plasmide con primer progettati per includere la regione Promotore T7 attraverso l'inserto, 20-30 bp a monte e a valle come descritto in precedenza13.</li>
		<li>In alternativa, digerire 5 g del plasmico utilizzando un enzima di restrizione (RE) sito di taglio disponibile a valle dell'inserto secondo le istruzioni fornite dal fornitore della RE. NOTA: Ricordarsi di verificare che l'inserto non sia tagliato dal RE selezionato. La selezione del RE utilizzato in questo passaggio può influire notevolmente sulla resa della trascrizione. Preferibilmente, linearizzare con un'estremità smussata o 5'-overhanging producendo RE per evitare la commutazione del modello della polimerasi dell'RNA T7 sul filamento di DNA opposto14. Provare RE diverso se i rendimenti iniziali sono insufficienti.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificare il DNA risultante utilizzando il kit per l'estrazione e la pulizia del gel di agarose del DNA. Elutare il DNA con 30 litri d'acqua.</li>
	<li>Mescolare bene vorticendo, pipet 1,5 l e misurare la concentrazione del DNA con uno spettrofotometro a microvolume.</li>
	<li>Utilizzare 250 ng di DNA per verificare la qualità e le dimensioni del DNA purificato su un 1% di elettroforesi gel di agarose in 1t TBE buffer migrato per 1 h a 4 V/cm.</li>
	<li>Scongelare i reagenti congelati del kit di trascrizione in vitro. Posizionare il Mix di polimerasi T7 RNA sul ghiaccio e gli altri reagenti su un nutatore a temperatura ambiente. Subito dopo lo scongelamento completo, girare velocemente i tubi rNTP per 5 s per raccogliere la soluzione sul fondo dei tubi e posizionare sul ghiaccio. Mantenere il buffer di reazione 10x a temperatura ambiente per evitare precipitazioni.</li>
	<li>Convogliare in un tubo da 1,5 mL i seguenti componenti della reazione di trascrizione di 20 .L a temperatura ambiente nell'ordine indicato: 6 L di acqua, 2 l (0,1 - 1 g) di modello di DNA lineare, 2 L di 75 mM soluzione ATP, 2 . , 2 - L di soluzione CTP 75 mM, 2 -L di soluzione UTP da 75 mM, 2 -L di 10x Reaction Buffer e 2 -L di T7 RNA Polymerase Mix. NOTA: Per il modello di DNA generato dalla PCR, utilizzare 100 - 200 ng DNA; per il modello di DNA generato dalla digestione enzimatica di restrizione di un plasmide, utilizzare il ricombinante attivo da 1 opprimente Il suo polimerano t7 RNAa 6tag Può essere purificato in E. coli15.</li>
	<li>Mescolare accuratamente il tubo. Rotazione rapida per 5 s per raccogliere la soluzione di reazione nella parte inferiore del tubo, quindi incubare a 37 gradi centigradi per 2-4 h. NOTA: ogni trascrizione si comporterà in modo diverso a seconda del modello di DNA, della sua lunghezza, della sua sequenza o struttura. Ottimizzare le condizioni di trascrizione in vitro testando tempi di incubazione diversi fino a 6 h; diverse concentrazioni di modello di DNA, T7 RNA Polymerase, o NTP; o l'aggiunta di MgCl2 supplementare a ciò che è presente nel Mix di polimerasi t7 RNA.</li>
	<li>Alla fine del periodo di incubazione, aggiungere 1 L di DNase I per una reazione a 20 gradi e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. NOTA: La reazione di trascrizione può essere temporaneamente mantenuta sul ghiaccio fino a quando il gel di poliacrilammide non è pronto.</li>
	<li>Procedere con la purificazione con gel poliacrilammide. NOTA: poiché l'RNA è sensibile alla contaminazione da pH e RNase, utilizzare apparecchiature dedicate all'RNA e reagenti privi di RNase.</li>
	<li>Determinare la percentuale di poliacrilammide per il gel a seconda delle dimensioni della trascrizione di interesse: 3,5% per 100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt), 5% per 80-500 nt (XC: 260 nt ; BB: 65 nt), 8% per 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% per 40-200 nt (XC: 70 nt ; BB: 20 nt), 15% per 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt) e 20% per 6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).</li>
	<li>Preparare il gel di poliacrilamide di demilazione dell'urea combinando i seguenti reagenti in un tubo conico da 50 mL: 9,6 g di urea di grado molecolare, 2 mL di 10x TBE, x mL del 40% di acrilammide 40%:bis-acrylamide mix (29:1) e acqua fino al marchio 20 mL sul tubo , dove x-20 mL/(40%/percentuale di gel%). AVVISO: i gel di poliacrilammide spesso contengono acrilammide non polimerizzato, che è un materiale tossico che può produrre un pericolo quando introdotto nell'ambiente. Smaltire i gel di poliacrilammide attraverso il programma di rifiuti chimici dell'istituzione.</li>
	<li>Microonde per 15 s al 30% di potenza. Mettere sul nutatore per 10 min a temperatura ambiente o fino a quando l'urea si è completamente sciolta.</li>
	<li>Mentre la miscela di gel sta ruotando, recuperare una cassetta di gel (18-bene, 1 mm di spessore; 13.3 x 8.7 cm (W x L)), rimuovere il pettine e posizionare la cassetta per la colata gel.</li>
	<li>Rotazione rapida del tubo da 50 mL per 5 s per raccogliere la soluzione gel nella parte inferiore del tubo. Aggiungere 125 L del 10% di soluzione persolfati di ammonio (APS). Posizionare sul nodo per 1 min.</li>
	<li>Aggiungere 25 -L di tetrametiletilenediamina (TEMED) e mescolare accuratamente pipetting su e giù 5 volte con una pipetta da 25 mL evitando le bolle.</li>
	<li>Pipette nel colata gel e inserire con attenzione il pettine gel evitando bolle.</li>
	<li>Stringere il sigillo aggiungendo una grande clip legante sopra la parte superiore della cassetta.</li>
	<li>Lasciare che il gel polimerizzi per 1 h.</li>
	<li>Una volta che il gel si è solidificato, rimuovere la clip legante. Inserire la cassetta nella scatola dell'elettroforesi. Aggiungere 1x tampone TBE nei serbatoi superiore e inferiore.</li>
	<li>Recuperare la reazione di trascrizione. Aggiungere acqua fino a 100 l, quindi aggiungere 100 l una di 2x Gel Loading Buffer. Preparare la scala mescolando la quantità raccomandata con acqua a 10 l e 10 -L di 2x Gel Loading Buffer in un tubo separato da 1,5 mL.</li>
	<li>Incubare sia la scala che la reazione di trascrizione in vitro nel termomixer a 70 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Mentre i campioni si denano a 70 gradi centigradi, rimuovere con cura il pettine, pulire i pozzetti pipettando su e giù ogni pozzo con una pipetta P1000, e immediatamente pre-esecuzione per 10 min a 100 V.</li>
	<li>Una volta che i campioni hanno completato la loro denaturazione di 15 min a 70 gradi centigradi, rimuovere i tubi dal termomixer e posizionare immediatamente sul ghiaccio.</li>
	<li>Pulire nuovamente ogni pozzetto del gel con la pipetta P1000. Caricare 20 l della scala sul primo pozzo a sinistra, 20 l del campione di RNA su 10 pozzi separati e 20 l of 1x Gel Loading Buffer sui pozze non utilizzati.</li>
	<li>Eseguire il gel a 100 V per 60 -240 min, a seconda della % poliacrilammide del gel. NOTA: i coloranti nel Buffer di carico Gel si separeranno in due bande mentre attraversano il gel, una banda blu Bromophenol Blue (BB) lenta che migra e una banda cianica Xylene Cyanol (XC) che migra velocemente. La migrazione approssimativa di queste bande in diversi gel di poliacrilammide %è ben nota (vedi fase 1.11) e può essere utilizzata per stimare la migrazione dell'RNA nel gel.</li>
	<li>Una volta che il gel è stato fermato, rimuovere con attenzione il gel dalla cassetta.</li>
	<li>Mettere il gel in una scatola pulita contenente una soluzione di 50 mL di 1x tampone TBE con 50 -L di macchia di gel acido nucleico e incubare per 5 min su un rocker per macchiare l'RNA.</li>
	<li>Scattare un'immagine prima e dopo l'escissione della banda del gel sul sistema di imaging gel, preferibilmente utilizzando la luce blu invece della traslazione UV.</li>
	<li>Ascisto ogni banda di interesse utilizzando una punta di taglio gel usa e getta senza nuclesino. Dopo ogni pozzo, trasferire la punta contenente la fetta di gel in un tubo da 1,5 mL e ruotare brevemente per raccogliere la fetta di gel. Ripetere fino a quando tutte le bande sono state raccolte nello stesso tubo da 1,5 mL.</li>
	<li>Una volta raccolte tutte le fette di gel, aggiungere 100 l of nuclease-free water o TE buffer al tubo da 1,5 mL. Conservare a 4 gradi centigradi per 48 ore. Ciò consente all'RNA di uscire dalle fette di gel nella soluzione.</li>
	<li>Dopo 48 h, convogliare l'acqua o il tampone DI TE in un tubo fresco da 1,5 mL. Smaltire le fette di gel rimanenti. Purificare l'RNA tramite kit di pulizia come segue.<ol>
<li>Equilibrate la colonna di spin a temperatura ambiente per almeno 30 min.</li>
		<li>Per la soluzione di 100 L di RNA nel nuovo tubo da 1,5 mL del passaggio 1,32, aggiungere 350 L di buffer RLT e mescolare bene per 2 min su un nutator. Girare per 1 s a 200 x g per raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Aggiungere 675 luna del 100% EtOH e mescolare bene per 2 min sul nutatore. Girare per 1 s a 200 x g e procedere immediatamente al passaggio successivo.</li>
		<li>Trasferire 565 l dell'impasto sulla colonna di spin e girare per 1 min a 15.000 x g. Svuotare il tubo di raccolta per aspirazione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente con la seconda metà del campione.</li>
		<li>Aggiungere 500 l di buffer RPE alla colonna e ruotare per 1 min a 15.000 x g. Svuotare il tubo di raccolta per aspirazione.</li>
		<li>Aggiungere 750 l dell'80% di etanolo alla colonna e ruotare per 1 min a 15.000 x g. Svuotare il tubo di raccolta per aspirazione.</li>
		<li>Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL con il coperchio aperto e ruotare a 15.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Trasferire la colonna in un nuovo tubo da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 17 l'acqua al centro della colonna e ruotare a 15.000 x g per 1 min per eluire. Elutare di nuovo con altri 17 - L di acqua. Il volume totale recuperato deve essere di 32.</li>
	</ol></li>
	<li>Mescolare bene vorticendo, pipet 1,5 l e misurare la concentrazione dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.</li>
	<li>Controllare la qualità della purificazione dell'RNA mediante gel di poliacrilammide ad urea denatura come nei passaggi 1.11-1.29.</li>
</ol>2. Analisi di metiltransferasi in RNA in vitro
<ol><li>Impostare il saggio di 100 ml di metiltransferase in un tubo da 1,5 mL sul ghiaccio come segue: 23 -L di acqua, 10 -L di 10x TBS (500 mM Tris-HCL, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 : L di 0,05 M EDTA, 5 . , 40 -L del 50% glicerolo, 4 - L di 58 M 3H-SAM, 5 -L di 20x Protease Inhibitor Cocktail, 1 -L di RNaseOUT (opzionale), 5 l di RNA e 5 -L di Methyltransferase. AVVISO: il materiale tritiato radioattivo è pericoloso e deve essere maneggiato solo indossando guanti, un camice da laboratorio e qualsiasi altro PPE necessario. Tutte le punte e i tubi delle pipette a contatto con il materiale radioattivo sono considerati scorie radioattive solide. Smaltire tutte le scorie radioattive solide e liquide secondo il protocollo di scorie radioattive approvato dal laboratorio. NOTA: Includere campioni di controllo senza metiltransferasi e senza l'RNA. Le concentrazioni di reagente possono richiedere l'ottimizzazione e/o l'inclusione di sali di cation divalenti, come MgCl2 o SAM senza etichetta. L'intervallo ottimale di concentrazione finale dell'RNA è compreso tra 50 nM e 1m, mentre la concentrazione di metiltransferate è compresa tra 25 nM e 300 nM.</li>
	<li>Mescolare accuratamente vorticendo delicatamente il tubo. Girare 5 s a 200 x g per raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo. Incubare i tubi a 37 gradi centigradi per 2 h.</li>
	<li>Pulire la reazione utilizzando la purificazione della colonna come nel passaggio 1.32. AVVISO: Fare molta attenzione a smaltire correttamente i materiali radioattivi, in particolare durante gli autoforni della colonna (pipette fuori invece di aspirare i rifiuti dai tubi di raccolta).</li>
	<li>Eseguire il conteggio scintillio liquido<ol>
<li>Impostare il rack del conteggio scintillazione con una fiala per campione, una fiala per la misurazione dello sfondo e una fiala per il test di scorrimento. Riempire le fiale con 5 mL di soluzione di conteggio scintillio.</li>
		<li>Aggiungete 10 l di ogni campione di RNA radioattivo eluito in 1 fiala, e stringete il coperchio e mescolate delicatamente.</li>
		<li>Preparare le fiale di prova. Strofinare accuratamente tamponi di cotone su tutte le superfici e le attrezzature utilizzate durante il protocollo. Aggiungere tamponi alle fiale riempite con 5 mL di soluzione scintillante e stringere il coperchio.</li>
		<li>Eseguire gli esempi sul contatore di scintillazione come indicato di seguito. Aprire il cofano del contatore, inserire il rack nella macchina e chiudere il cofano. Selezionare Conteggio rack singolo . Selezionare Seleziona programma utente . Selezionare o creare un programma che misura il trizio (3H) per 60 s. Hit Count Rack. Ripetere il conteggio scintillio tre volte. NOTA: l'apparecchiatura misurerà il conteggio scintillio di ogni campione ed emesso sia sullo schermo che su una stampa. Protocollo può essere messo in pausa qui, se lo si desidera. I campioni di RNA rimanenti a partire dalla fase 2.3 devono essere congelati a -80 gradi centigradi per un uso successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedere con l'autoradiogramma<ol>
<li>Preparare e pre-eseguire il gel di poliacrilammide di profilazione come nei passi 1.11-1.20.</li>
		<li>Pipette 20 -L di materiale di RNA radioattivo in un nuovo tubo da 1,5 mL contenente 20 -L di 2x Gel Loading Buffer. Mescolare bene. Preparare la scala come al punto 1.21. Incubare i campioni a 70 gradi centigradi per 15 min.</li>
		<li>Lavare i pozze del gel ancora una volta immediatamente prima del caricamento del campione. Caricare 20 l della scala preparata, 20 l dei campioni e 20 -L di 1x Gel Loading Buffer sulle corsie rimanenti. Eseguire il gel a 100 V per 60-180 min, a seconda della percentuale di poliacrilammide.</li>
		<li>Al termine della corsa del gel, togliere il gel dalla cassetta e metterlo in una scatola contenente 50 mL di 1x tampone TBE con 5 .L di macchia di gel acido nucleico ultrasensibile.</li>
		<li>Incubare per 5 min sul rocker per macchiare l'RNA.</li>
		<li>Estrarre con attenzione il gel dalla scatola e posizionarlo sul transilluminatore UV del sistema di imaging gel con i pozzi e la scala a sinistra.</li>
		<li>Mettere a fuoco la fotocamera sul gel, accendere la luce UV e quindi scattare un'immagine del gel esponendo da 50 ms a 1 s a seconda dell'intensità del segnale.</li>
		<li>Disattivare l'esposizione ai raggi UV e salvare l'immagine come file Tiff.</li>
		<li>Riposizionare il gel nella scatola. Rimuovere TBE. Fissare il gel con 50 mL di soluzione di fissaggio (50% di metanolo, 10% di acido acetico, 40% acqua ultra-pura) per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.</li>
		<li>Spostare delicatamente il gel in una scatola nera fresca contenente 25 mL della soluzione di miglioramento dell'autoradiografia. In assenza di una scatola nera, coprire la scatola con un foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce.</li>
		<li>Incubare per 30 min a temperatura ambiente sul rocker.</li>
		<li>Sollevare delicatamente il gel e posizionarlo a faccia in giù su un foglio di involucro di plastica con i pozze e la scala sul lato destro. Posizionare due fogli di carta cromatografica sul retro del gel. Capovolgere delicatamente l'intera pila.</li>
		<li>Preriscaldare l'asciugatrice ad gel a 80 gradi centigradi. Spostare indietro il coperchio di plastica sull'asciugatrice ad appiglio. Inserire la pila di carta avvolgente, gel e cromatografia sotto il coperchio di plastica e spostare il coperchio di plastica verso il basso per creare un sigillo.</li>
		<li>Asciugare per 1 h a 80 gradi centigradi nell'asciugatrice ad acqua gel.</li>
		<li>Spegnere l'asciugatrice ad gel e rimuovere delicatamente la pila. Rimuovere l'avvolgimento e la seconda carta cromatografica. Nastro rimanente carta cromatografia con il gel essiccato in una cassetta di autoradiogramma.</li>
		<li>Aggiungi 1 foglio di pellicola di autoradiografia nella stanza buia.</li>
		<li>Posizionare la cassetta a -80 gradi centigradi e sviluppare il film dopo 1 h a 4 settimane a seconda dell'intensità del segnale, che può essere giudicato in base ai conteggi di scintillazione precedentemente misurati: 1-4 settimane per 250-1.000 cpm, 24 h a 1 settimana per 1.000-10.000 cpm e da 1 h a 24 h per >10.000 cp m.</li>
		<li>Una volta che il film è sviluppato, posizionare il film sulla parte superiore della cassetta e segnare con attenzione con un marcatore di laboratorio i 4 bordi del gel, ogni pozzo, e la posizione dei coloranti XC e BB.</li>
		<li>Eseguire la scansione della pellicola con una risoluzione di 300 o 600 pixel per pollice e salvare l'immagine come file Tiff.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, viene riportato un metodo semplice e robusto per la verifica in vitro dell'attività di metiltransferasi dell'RNA verso trascrizioni specifiche. Il saggio sfrutta il fatto che la methionina S-adenosil può essere tritiata sul donatore del gruppo metilico (Figura 1), consentendo di rilevare con precisione l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi. Tuttavia, è importante notare che questo saggio non può indicare quale residuo o gruppo chimico è metilato dall'enzima. Per identificare o verific...

Il DNA, l'RNA e le proteine sono soggetti a modifiche che regolano strettamente l'espressione genica1. Tra queste modifiche, le metilazioni si verificano su tutti e tre i biopolimeri. Le metilazioni del DNA e delle proteine sono state studiate molto bene negli ultimi tre decenni. Al contrario, l'interesse per la metilazione dell'RNA è stato riacceso solo di recente alla luce dei ruoli importanti che le proteine che scrivono, cancellano o legano le metilazioni dell'RNA giocano nello sviluppo e nella malattia2. Oltre alle funzioni più conosciute negli ABbondanti RNA ribosomici e di trasferimento, le vie di metilazione dell'RNA regolano la stabilità specifica dell'RNA messaggero3,4, splicing5 e traduzione6,7, Elaborazione miRNA8,9 e pausa trascrizionale e rilascio10,11.
Qui, viene riportato un metodo semplice e robusto per la verifica in vitro dell'attività di metiltransferasi dell'RNA nell'impostazione di un laboratorio di biologia molecolare (riassunto nella Figura 1). Molti studi valutano l'attività di un RNA metiltransferase attraverso dot-blot con un anticorpo contro la modificazione dell'RNA di interesse. Tuttavia, dot-blot non verifica l'integrità dell'RNA in caso di incubazione con l'RNA metiltransferase. Questo è importante perché anche piccole contaminazioni di proteine ricombinanti con nucleasi possono portare a parziale degradazione dell'RNA e risultati confusi. Inoltre, anche gli anticorpi altamente specifici per la modificazione dell'RNA possono riconoscere gli RNA non modificati con sequenze o strutture specifiche. Il saggio di metiltransferasi in vitro di RNA qui riportato sfrutta il fatto che la methionina S-adenosyl può essere tritiata sul donatore di gruppo metilico (Figura 1), consentendo l'rilevazione accurata dell'RNA metilato senza l'uso di anticorpi . Vengono fornite istruzioni per la trascrizione in vitro e la purificazione di una trascrizione di interesse e di test della metilazione di tale trascrizione da parte dell'enzima di interesse. Questo metodo è flessibile e robusto e può essere regolato in base alle esigenze di un determinato progetto. Ad esempio, possono essere utilizzati RNA in vitro trascritti e purificati, RNA sintetizzati chimicamente, ma anche RNA cellulari. Questo saggio fornisce informazioni quantitative sotto forma di conteggi scintilliali, così come informazioni qualitative mostrando dove esattamente l'RNA metilato viene eseguito su un gel. Questo può fornire una visione unica della funzione di una metiltransferasi dell'RNA, in particolare quando si utilizzano RNA cellulari come substrato, in quanto fornisce un metodo per osservare direttamente le dimensioni dell'RNA o degli RNA che sono mirati alla metilazione.

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 bp DNA Ladder kit.</td></tr><tr><td>10% di persolfato di ammonio (APS)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per il gel di poliacrilammide denaturante dell'urea (Per 10 mL, sciogliere 1 g in 8 mL di milliQ di acqua; regolare il volume a 10 mL con milliQ di acqua; filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 10 mL dotata di 0,45 &micro; m filtro).</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per il gel di poliacrilammide denaturante dell'urea (Per 1 litro, aggiungere 108 g di Tris Base, 55 g di acido borico in un cilindro con una barra di agitazione; aggiungere 800 ml di acqua distillata e lasciare sciogliere; aggiungere 40 ml di Na2EDTA 0,5 M (pH 8,0); regolare il volume a 1 litro con milliQ di acqua; filtrare la soluzione con un 0,22&micro; m filtro).</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per 1 litro, aggiungere 60,5 g di Tris Base, 87,6 g di NaCl in un cilindro con ancoretta di agitazione; aggiungere 800 ml di acqua distillata e lasciare sciogliere; regolare il pH a 7,5 con HCl concentrato; regolare il volume a 1 litro con acqua milliQ; filtrare la soluzione con un microacido 0,22; filtro m.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acrilammide: bis-acrilammide 29:1 (soluzione al 40%/elettroforesi), Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.</td></tr><tr><td>ADENOSIL-L-METIONINA, S-[METIL-3H]; (SAM[3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>Per la metilazione in vitro dell'RNA; Concentrazione = 1,0 mCi/mL; Attività specifica = 17,1 Ci/mmol; Molarità= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 &micro;M.&nbsp; &nbsp; Al ricevimento del tubo 3H-SAM congelato, scongelarlo a 4 gradi; C, fare 20 &micro; L aliquote e congelarle a -30°C. Non ricongelare e riutilizzare mai un'aliquota parzialmente utilizzata.</td></tr><tr><td>Cassette per autoradiografia per ipercassetta Amersham</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>Per l'esposizione al gel per autoradiogramma.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>Per l'esposizione al gel per autoradiogramma.</td></tr><tr><td>Contatore di scintillazione Beckman</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>Per il conteggio della scintillazione liquida.</td></tr><tr><td>Biorad Mini Sistema di Elettroforesi Orizzontale</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini Sistema di Elettroforesi Orizzontale.</td></tr><tr><td>cOmplete Mini Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>Per una soluzione 20X, sciogliere 1 compressa in 0,525 ml di acqua priva di nucleasi.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>Cassetta vuota senza RNasi per gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Criterion cassette vuote Biorad</td><td></td><td>1656001</td><td>Cella di elettroforesi verticale in formato midi.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro per microvolumi DeNovix DS-11 Spettrofotometro</td> per microvolumi <td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>per la misurazione della concentrazione di DNA e RNA.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>Per il conteggio della scintillazione liquida.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Fiale di scintillazione in HDPE da 7 ml</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>Per il conteggio della scintillazione liquida.</td></tr><tr><td>Potenziatore per autoradiografia ad azione rapida Fluoro-Hance,</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>Per il pretrattamento con gel per autoradiogramma.</td></tr><tr><td>Essiccatore di gel</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>Per asciugare il gel.</td></tr><tr><td>Tampone di caricamento su gel II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>Per caricare l'RNA in gel di poliacrilammide urea denaturante (composizione: 95% formammide, 18 mM EDTA e 0,025% SDS, xilene cianolo e blu di bromofenolo).</td></tr><tr><td>Punte per escissione in gel monouso GeneCatcher</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>Per rimuovere le bande dai gel di agarosio e poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Kit Megascript</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>Per la trascrizione in vitro con RNA polimerasi T7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (trasparente)/ NC9965364 (nero)</td><td>Scatola per colorazione in gel.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Plasmide per la produzione di trascritti in vitro con estremità omogenee</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Per la pulizia dell'RNA, utilizzare il protocollo modificato fornito nel protocollo.</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit per l'estrazione del gel e la purificazione del frammento di dsDNA utilizzato per la trascrizione in vitro.</td></tr><tr><td>Saran Premium Plastic Wrap</td><td>Saran Wrap</td><td>Amazon</td><td>Per gel essiccante.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Colorante in gel di acido nucleico ultra sensibile.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Colorante in gel di acido nucleico.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodico, pH 8,0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.</td></tr><tr><td>Thermomixer con SMARTBLOCK 24X 1,5mL TUBES</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>Per l'incubazione a temperatura controllata di provette da 1,5 mL.</td></tr><tr><td>TOPO TA Kit di clonazione</td><td>tecnologie di vita</td><td></td><td>Kit per la clonazione rapida della Taq polimerasi... prodotti di PCR amplificati in vettori contenenti promotori T7 e/o SP6 per la trascrizione dell'RNA in vitro.</td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U&frasl; &micro; L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Per la rimozione del DNA da reazioni di trascrizione in vitro.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.</td></tr><tr><td>Carta Whatman 3MM</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>Carta per cromatografia per gel essiccante.</td></tr></tbody></table>

analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di rna methyltransferase

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Ci sono più di 100 modifiche chimicamente distinte dell'RNA, due terzi delle quali consistono di metilazioni. L'interesse per le modifiche dell'RNA, e in particolare le metilazioni, è riemerso a causa dei ruoli importanti svolti dagli enzimi che li scrivono e li cancellano nei processi biologici rilevanti per la malattia e il cancro. Qui, viene fornito un saggio in vitro sensibile per un'analisi accurata dell'attività degli autori di metilazione dell'RNA sugli RNA trascritti sintetici o in vitro. Questo saggio utilizza una forma tritiata di S-adenosyl-methionine, con conseguente etichettatura diretta dell'RNA metilato con trizio. La bassa energia della radiazione di trizio rende il metodo sicuro, e i metodi preesistenti di amplificazione del segnale di trizio, consentono di quantificare e visualizzare l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi, che sono comunemente inclini a manufatti. Mentre questo metodo è scritto per la metilazione dell'RNA, poche modifiche lo rendono applicabile allo studio di altre modifiche dell'RNA che possono essere etichettate radioattivamente, come l'acetilazione dell'RNA con coenzima acetil 14C A. Nel complesso, questo saggio consente di valutare rapidamente l'RNA condizioni di metilazione, inibizione con piccoli inibitori molecolari, o l'effetto di mutanti di RNA o enzimi, e fornisce un potente strumento per convalidare ed espandere i risultati ottenuti nelle cellule.

Reazione di trascrizione in vitro Figura 2 A rappresenta una tipica esecuzione da una reazione di trascrizione in vitro con la polimerasi t7 RNA dello snRNA 7SK, che è relativamente breve (331 nt) e RNA altamente strutturato. Come mostrato in quell'immagine grezza, ci sono più bande indesiderate, sia più brevi che più lunghe di 7SK, probabilmente risultanti da eventi di inizio o terminazione trascrizionali casuali. Per questo motivo, la purificazione del ...

Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l'analisi diretta dell'attività di metiltransferasi sull'RNA transscritto sintetico o in vitro.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Ci sono più di 100 distinte modifiche dell'RNA, due terzi delle quali sono metilazioni. Questo protocollo fornisce un metodo per un'analisi sensibile e accurata dell'attività dello scrittore di metilazione dell'RNA. Questa tecnica facile da usare ci consente di quantificare e visualizzare l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi, che sono comunemente inclini agli artefatti.A dimostrare la procedura sarà Samantha Shelton, una studentessa del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, impostare il saggio 100-microliter RNA metiltransferasi in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio, come delineato nel protocollo di testo. Vortice il tubo per mescolare accuratamente e centrifugare a 200 volte g per cinque secondi per raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo.Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, pulire la reazione utilizzando la purificazione delle colonne, come delineato nel protocollo di testo. Per eseguire il conteggio delle scintillazioni liquide, impostare il rack del conteggio delle scintillazioni con una fiala per campione, una fiala per una misurazione dello sfondo e una fiala per il test di scorrimento rapido.Riempire le fiale con cinque millilitri di soluzione di conteggio scintillazione. Aggiungere 10 microlitri di ogni campione di RNA radioattivo eluito in una fiala. Stringere il coperchio e mescolare delicatamente.Per preparare le fiale di prova di scorrimento rapido, strofinare accuratamente i tamponi di cotone su tutte le superfici e le attrezzature utilizzate durante la procedura. Aggiungere questi tamponi alle fiale riempite con soluzione di scintillazione e stringere il coperchio. Per eseguire i campioni sul contatore di scintillazione, aprire il cofano del contatore, inserire il rack nella macchina e chiudere il cofano.Selezionare Conta rack singolo. Scegliere Seleziona programma utente. Selezionare o creare un programma che misura il trizio per 60 secondi e premere Count Rack.Ripetere il conteggio delle scintillazioni tre volte. Successivamente, preparare e rominare un gel di poliacrilammide denaturante di urea, come delineato nel protocollo di testo. Trasferire 20 microlitri di materiale RNA radioattivo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di tampone di carico del gel 2X.Dopo aver preparato la scala, incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Lavare ancora una volta i pozzi del gel immediatamente prima del caricamento del campione tubazionando il tampone dai serbatoi di gel nei pozzi del gel. Quindi, caricare 20 microlitri della scala preparata, 20 microlitri dei campioni e 20 microlitri di tampone di carico del gel 1X nelle corsie del gel.Far funzionare il gel a 100 volt per 60-180 minuti, a seconda della percentuale di poliacrilammide. Una volta terminato il funzionamento del gel, rimuovere il gel dalla cassetta e posizionare in una scatola contenente 50 millilitri di tampone TBE 1X con cinque microlitri di macchia di gel acido nucleico ultrasensibile. Incubare su un rocker per cinque minuti per macchiare l'RNA.Successivamente, eserti con cura il gel dalla scatola e posizionarlo sul transilluminatore UV del sistema di imaging in gel con i pozzi su e la scala a sinistra. Mettere a fuoco la fotocamera sul gel, accendere la luce UV e scattare un'immagine del gel. Quindi, disattivare l'esposizione ai raggi UV e salvare l'immagine come file TIFF.Riposizionare il gel nella scatola, rimuovere il TBE e fissare il gel con 50 millilitri di soluzione di fissaggio su un rocker a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, spostare delicatamente il gel su una scatola nera fresca contenente 25 millilitri della soluzione di miglioramento dell'autorazione. Incubare sul rocker a temperatura ambiente per 30 minuti.Sollevare delicatamente il gel e posizionarlo a faccia in giù su un foglio di plastica avvolgente con i pozzi alzati e la scala sul lato destro. Posizionare due fogli di carta cromatografica sul retro del gel e capovolgere l'intera pila. Prerimente riscaldare l'essiccatore a gel a 80 gradi Celsius.Spostare indietro il coperchio di plastica sull'essiccatore a gel. Inserire l'intera pila sotto il coperchio di plastica e spostare di nuovo il coperchio di plastica verso il basso per creare una guarnizione. Asciugare il gel a 80 gradi Celsius per un'ora.Quindi, spegnere l'essiccatore di gel e rimuovere delicatamente la pila. Rimuovere l'involucro e la seconda carta cromatografica. Nastro la carta cromatografica rimanente con il gel essiccato in una cassetta autoradiogramma.In una stanza buia, aggiungi un foglio di pellicola autoratografica. Conservare la cassetta a -80 gradi Celsius e sviluppare il film al momento opportuno, a seconda dell'intensità del segnale. Una volta sviluppato il film, posizionarlo sopra la cassetta e utilizzare un marcatore da laboratorio per contrassegnare attentamente i quattro bordi del gel, ogni pozzo, e la posizione dei coloranti XC e BB.Scansiona la pellicola con una risoluzione di 300 o 600 pixel per pollice e salva l'immagine come file TIFF. In questo studio, viene dimostrato un saggio privo di anticorpi per analizzare l'attività dell'RNA metiltransferasi. Una corsa tipica da una reazione di trascrizione in vitro con l'RNA polimerasi T7 del piccolo RNA nucleare 7SK mostra RNA relativamente breve e altamente strutturato.Ci sono più bande indesiderate, sia più corte che più lunghe di 7SK, probabilmente risultanti da eventi casuali di iniziazione o terminazione trascrizionale. Per questo motivo, la purificazione del gel dopo la reazione di trascrizione in vitro è importante per ottenere un campione di RNA pulito. A questo punto, l'RNA di interesse può essere identificato dalla sua posizione rispetto alla scala e purificato dalla purificazione del gel.Un saggio rappresentativo di RNA metiltransferasi utilizzando il limite inferiore delle concentrazioni raccomandate di RNA e proteine è mostrato qui. Questo saggio consente sia risultati quantitativi dal conteggio delle scintillazioni, sia risultati qualitativi dall'autoradiogramma. Qui, si dimostra che un RNA metiltransferasi noto per metilare 7SK è in grado di metilare U6. Inoltre, come mostrato di recente per 7SK, il legame dell'istone H4 al MePCE inibisce anche la metilazione U6.Questo può essere osservato sia nel conteggio delle scintillazioni che nell'autoradiogramma, mostrando la robustezza di questo protocollo. L'RNA è suscettibile di degradazione, quindi assicurati di utilizzare reagenti senza RNasi e di pulire accuratamente tutte le superfici e le attrezzature. L'RNA etichettato radioattivamente ottenuto da questo saggio di metiltransferasi può essere usato direttamente per valutare l'attività della demetilasi dell'RNA o l'attività di legame dell'RNA per saggio di spostamento di mobilità elettroforetica, per esempio.Questo metodo consente ai ricercatori di testare l'effetto di diversi fattori sull'attività dell'RNA metiltransferasi, comprese le mutazioni puntili e i trattamenti inibitori delle piccole molecole. Questo metodo utilizza materiale radioattivo, quindi assicurati di indossare i DPI appropriati e fai attenzione durante la manipolazione e lo smaltimento di materiali radioattivi.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Un metodo per l&#39;RNA di misura<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione biochimica dell'enzima modificante la RNA lievito, Mod5 e discutere come questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri enzimi modificanti la RNA.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

Qui presentiamo un protocollo per la scissione dell'RNA dipendente da DNAzyme. Ciò consente un'analisi rapida e dipendente dal sito dell'RNA 2'-O-metilazione. Questo approccio può essere utilizzato per la valutazione preliminare o importante dell'attività dello snoRNA.

Analisi dipendente da DNAzyme del rRNA 2'-O-Metilazione

Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis

Questi protocolli forniscono la metodologia utilizzata per valutare l'attività enzimatica dei singoli membri della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) nelle cellule. Vengono descritte linee guida dettagliate sulla valutazione dell'attività delle PRMT utilizzando biomarcatori endogeni ed esogeni, anticorpi di riconoscimento metil-arginina e composti degli utensili inibitori.

Metodi quantitativi per studiare l'attività delle proteine arginina metiltransferasi 1-9 nelle cellule

Il ruolo delle modificazioni dell'RNA nelle infezioni virali sta appena iniziando ad essere esplorato e potrebbe evidenziare nuovi meccanismi di interazione virale-ospite. In questo lavoro, forniamo una pipeline per studiare le modifiche dell'RNA m6A e m5C nel contesto delle infezioni virali.

Esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Qui presentiamo un protocollo per valutare semi-quantitativamente i livelli globali di m⁶A utilizzando dot blot. L'RNA totale viene estratto, denaturato, maculato su una membrana di nylon, sondato con anticorpi anti-m⁶A e visualizzato tramite chemiluminescenza. L'intensità del segnale, quantificata dall'analisi in scala di grigi ImageJ, riflette l'abbondanza relativa di metilazione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per la ricerca.

Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNAN 6-metiladenosina

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Scopri un saggio in vitro senza anticorpi per analizzare l'attività delle RNA metiltransferasi usando S-adenosil-metionina tritiata. Questo metodo consente quantificazione e visualizzazione affidabili della metilazione dell'RNA.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

Esplora altri video