Name: Metodi per il test biomeccanico In Vivo su plexus brachiale in porcellini neoatali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Scopri i metodi per il test biomeccanico in vivo del plesso brachiale utilizzando un modello di porcellino neonatale. Questo approccio aiuta a comprendere i meccanismi di lesione da stiramento e a determinare le soglie di danno nel plesso brachiale neonatale.

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development dei National Institutes of Health con il premio numero R15HD093024 e dal National Science Foundation CAREER Award Numero 1752513.

Institutional Animal Care and Use Committee presso Drexel University ha approvato tutte le procedure (#20704).
1. Arrivo e acclimazione degli animali
<ol><li>Quarantena 1-2 maialini di giorno per almeno 24 ore dopo l'arrivo.</li>
	<li>Casa suinetti in gabbie pulite e igienizzate in acciaio inossidabile (36 in x 48 in x 36 in) su biancheria da letto di truciolo di pioppo e mangime ad libitum con sostituto del latte di maiale.</li>
	<li>Mantenere la temperatura ambiente a 85 gradi centigradi per garantire un ambiente termoneutro.</li>
</ol>2. Giorno dell'Esperimento
<ol><li>Rimuovere il feed 2 h prima dell'esperimento.</li>
	<li>Iniettare suinetti con un'iniezione intramuscolare di chetamina (10-40 mg/kg)/xylazina (1,5-3,0 mg/kg Di IM) e il trasporto tramite una gabbia di trasporto nello spazio chirurgico.</li>
</ol>3. Induzione e manutenzione dell'anestesia
<ol><li>Somministratura 4% aneslazione islurane anestetico mescolato in ossigeno per cono naso e verificare che l'animale è profondamente anestetizzato valutando l'assenza di riflessi palpebrali e di ritiro.</li>
	<li>Intubare l'animale posizionandolo in posizione supina e utilizzare una laringoscopio (lama dritta) per guidare il tubo di intubazione (diametro 2,5–2 mm) nella trachea.</li>
	<li>Posizionare l'animale sul ventilatore una volta fissato il tubo di intubazione.</li>
	<li>Assicurarsi che i suinetti ricevano una miscela di isoflurane (0,25%-3% di manutenzione), ossigeno e protossido di azoto.</li>
	<li>Fornire una dose di fentanil (10 g/kg) e continuare a somminiferire una dose ogni 1–2 h per garantire una profondità adeguata di analgesia e sedazione ed evitare artefatti di movimento che potrebbero rischiare lo slovacco del tubo endotracheale.</li>
	<li>Stabilire l'accesso endovenoso (IV) nella vena addominale sottocutanea o in qualsiasi altra vena periferica.</li>
	<li>Stabilire la linea arteriosa attraverso l'arteria femorale. Questo può essere fatto in modo non invasivo o eseguendo un cut-down.</li>
</ol>4. Monitoraggio e cura
<ol><li>Monitorare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di riflesso canthal e l'assenza di risposta di ritiro al pizzico dei diici.</li>
	<li>Eseguire un monitoraggio continuo dei parametri fisiologici durante l'anestesia e durante l'esperimento, che include la pressione sanguigna arteriosa, l'elettrocardiografia (ECG), la CO di mareafinale 2, l'ossimetria dell'impulso e la temperatura corporea.</li>
	<li>Monitora i gas sanguigni e gli zuccheri nel sangue ogni 0,5-1 h e dai fluidi endovenosi (50% di dextrose e 50% salina normale) agli animali anestesizzati più a lungo di 1 h a 100 cc/kg/giorno, se necessario, per garantire l'euglycemia.</li>
	<li>Monitorare il piano anestetico dell'animale da vicino e frequentemente. Fornire analgesia e/o aumentare l'anestesia inalata.</li>
	<li>Mantenere l'animale alla normale tensione di ossigeno controllando i parametri del ventilatore e i dosaggi di droga in base alle esigenze per garantire la normossia, quindi posizionare l'animale su una coperta d'acqua circolante regolata a temperatura in modo tale che la temperatura corporea normale sia mantenuta a 39 gradi centigradi per tutta la durata dell'esperimento.</li>
</ol>5. Chirurgia del plesso brachiale
<ol><li>Posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio dopo un'adeguata anestesia come descritto nella sezione 3, con l'arto superiore nel rapimento, esponendo la regione ascellare.</li>
	<li>Utilizzare qualsiasi drappo chirurgico per coprire l'animale. Utilizzare tecniche pulite ma non sterili.</li>
	<li>Esporre il complesso del plesso brachiale su entrambi i lati della colonna vertebrale facendo un'incisione mediana (utilizzando una lama #10) sulla pelle e fascia sovrastante la trachea, fino al terzo superiore dello sterno, corrispondente ai livelli della colonna vertebrale tra C3–T3.</li>
	<li>Estrapolare l'incisione utilizzando le pinze e l'elocuma orizzontalmente su ciascun lato dalla tacca soprasternale lungo il bordo della clavicola fino al braccio superiore, risparmiando le vene cefaliche e basili.</li>
	<li>Rilasciare i lembi superiori e inferiori per dissezione smussata utilizzando forbici e pinze, consentendo l'accesso alle regioni cervicali e toraciche del plesso brachiale, rispettivamente.</li>
	<li>Identificare l'asse (C2) e la prima nervatura in corrispondenza del T1. Utilizzando questi punti di riferimento, identificare i tre cervi inferiori (C6-C8) e il primo forame vertebrale spinale toracico (T1), quindi esaminare attentamente il plesso per individuare le biforcazioni delle divisioni (forma M) per ottenere l'esposizione.</li>
	<li>Etichettare (utilizzando anelli nervosi) le regioni del plesso brachiale sopra queste biforcazioni più vicine alla colonna vertebrale come radice / tronco ed etichettare quelli sotto queste biforcazioni come accordo seguito dal nervo, che si trovano più vicino al braccio.</li>
</ol>6. Test biomeccanici
<ol><li>Configurazione del dispositivo di test biomeccanico NOT:</</c0> Un dispositivo di test meccanico personalizzato è stato progettato e fabbricato per eseguire l'estensione in vivo della BP (Figura 1).<ol>
<li>Fissare la base del set-up a un carrello.</li>
		<li>Attaccare l'attuatore elettromeccanico sulla base utilizzando grandi morsetti a C. L'attuatore è in grado di fornire 150 libbre di forza, 10" corsa e velocità di 15 mm / s. La velocità può essere ridotta a 0,2 mm/s e può comunque funzionare come desiderato.</li>
		<li>Collegare la cella di carico 200 N all'attuatore.</li>
		<li>Fissare (screw-in) un morsetto alla cella di carico che consiste in plexiglass imbottito, che impedisce la concentrazione di sollecitazione nel sito di serraggio.</li>
		<li>Collegare una fotocamera a un treppiede. Assicurarsi che la fotocamera abbia la capacità di registrare fino a 120 f/s con una risoluzione di 658 x 4926 pixel.</li>
		<li>Collegare i cavi USB dalla fotocamera, dall'attuatore e dalla cella di carico al computer per integrare e sincronizzare tutti i componenti della configurazione.</li>
		<li>Collegare il computer, l'attuatore e la cella di carico in una fonte di alimentazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrare la cella di carico prima di registrare i carichi applicati. A tale scopo, eseguire la procedura seguente:<ol>
<li>Impostare l'attuatore con un angolo di 90 gradi utilizzando la maniglia regolabile e controllando l'angolo con un goniometro.</li>
		<li>Aprire il software che funziona con la cella di caricamento (Tabella dei materiali). Premere il pulsante Start per visualizzare una lettura in tempo reale della tensione.</li>
		<li>Appendere i pesi dal morsetto che vanno da 0 a 1.000 g in incrementi di 100 g dalla configurazione e registrare le tensioni misurate.</li>
		<li>Calcolare l'equazione lineare delle tensioni e dei pesi trovando la pendenza (m) e l'intercetta (b). Questo viene fatto utilizzando un programma di foglio di calcolo e la funzione di pendenza inclusa per calcolare b dall'equazione 1 qui sotto. Inserire l'equazione 2 illustrata di seguito nel codice di impostazione meccanica. Equazione 1: b - y - mx Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è l'intercetta (costante). Equazione 2: y , mx e b Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è la costante.</li>
	</ol></li>
	<li>Test: il nervo BP viene tagliato e ancorato al set-up di prova con un morsetto personalizzato.<ol>
<li>Tagliare il nervo BP con le forbici sottili.</li>
		<li>Bloccare il lato tagliato del nervo BP nel morsetto personalizzato, come illustrato nella Figura 1.</li>
		<li>Posizionare manualmente vernice acrilica nera o inchiostro indiano sul segmento BP bloccato (Figura 2).</li>
		<li>Posizionare una griglia di calibrazione, che è un righello di 1 cm, piatta all'interno dell'animale per impostare la scala per l'analisi dei dati.</li>
		<li>Utilizzare il software della fotocamera per visualizzare la posizione della telecamera direttamente sui segmenti testati, consentendo in tal modo il monitoraggio del movimento/spostamento dei marcatori e determinando l'effettivo ceppo tissutale in qualsiasi momento.</li>
		<li>Registrare le misure iniziali come l'altezza alla quale il nervo si inserisce nel corpo dal tavolo e l'altezza del morsetto dal tavolo, l'angolo dell'attuatore e l'intera lunghezza del tessuto.</li>
		<li>Aprire il software di programmazione (tabella contenente l'interfaccia utente grafica [GUI] come illustrato nella Figura 3).</li>
		<li>Eseguire la GUI premendo il pulsante Esegui.</li>
		<li>Inizializzare il sistema premendo il pulsante Initialize.</li>
		<li>Tare il sistema premendo il tasto Tare.</li>
		<li>Estendere il segmento BP premendo il pulsante di avvio del test. Questo tira il tessuto ad una velocità assegnata di 500 mm /min fino a quando non si verifica un guasto completo in qualsiasi segmento della BP. Questa velocità di estensione viene selezionata in base alla letteratura disponibile4,8,18. Il programma salva anche un file video, il carico di tensile applicato, lo spostamento del tessuto e la durata del test.</li>
		<li>Registrare il sito di guasto, che è il punto in cui il tessuto si rompe.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasia: eutanasia suinetti alla fine dell'esperimento con una dose letale di pentobarbital (120 mg/kg i.v.).</li>
	<li>Analisi dei dati: utilizzare un software di tracciamento del movimento per l'analisi dei video acquisiti durante il test.<ol>
<li>Aprire il file video dall'esperimento all'interno del software di tracciamento del movimento selezionando File Apri file video.</li>
		<li>Utilizzare la griglia di calibrazione per impostare la scala nel software di rilevamento del movimento utilizzando lo strumento Linea, facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla linea dopo che è stata disegnata, selezionando Calibrate Measure (Misura calibrata)e immettendo un valore noto in centimetri(Figura 4).</li>
		<li>Traccia i marcatori sul tessuto all'interno del software di tracciamento del movimento facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video e selezionando Traccia traccia e allineando il centro del marcatore con il marcatore sul tessuto e virando fino alla rottura.</li>
		<li>Esportare le coordinate x e y dai marcatori selezionando Esporta file in foglio di calcolo in modo che possa essere utilizzato per calcolare i ceppi.</li>
		<li>Importare i dati in un software di programmazione per calcolare la distanza tra le coordinate x e y nel tempo per calcolare le sollecitazioni.</li>
		<li>Calcolare i valori di deformazione in ogni punto temporale dividendo la variazione di distanza per la distanza originale dopo aver tenuto conto dei cambiamenti di inclinazione durante l'allungamento. I valori di deformazione effettivi vengono determinati tra ogni coppia di marcatori adiacenti in ogni punto temporale. Viene calcolata anche la media di questi ceppi.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La letteratura disponibile sulle risposte biomeccaniche di stretch sul tessuto BP presentano una vasta gamma di valori soglia così come discrepanze metodologiche4,6,8,18,19,20,21,22,23. Le variazioni nei risultati pubblica...

Nonostante i recenti progressi nell'ostetricia, il problema della NBPP causato da lesioni stretch al complesso BP continua ad essere un onere sanitario globale, con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi1,2. I fattori di rischio associati possono essere materni (ad esempio, peso eccessivo, diabete materno, anomalie uterine, storia della paralisi della BP), fetali (cioè macrosomia fetale) o legati alla nascita (cioè distocia della spalla, lavoro prolungato, erogazione assistita con pinze o estrattori di aspirazione del vuoto, Mentre queste complicazioni sono inevitabili in determinate circostanze, la prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche della BP neoordinata quando sottoposta a stretching.
Studi biomeccanici riportati sul BP hanno utilizzato animali adulti e tessuto cadaverico umano e mostrano discrepanze significative4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. La rilevanza clinica delle proprietà biomeccaniche del complesso tessuto BP garantisce un modello animale neooo-acqua e un approccio di test biomeccanici in vivo. Inoltre, le limitazioni con lo studio delle lesioni stretch BP in complicati scenari di consegna nel mondo reale aumentano la dipendenza da modelli computerizzati che forniscono metodi che consentono di studiare gli effetti di varie complicazioni e tecniche di consegna. La chiave per la rilevanza clinica di questi modelli è la loro biofedeltà (risposta umana). I modelli computazionali disponibili di Gonik et al.16 e Grimm et al.17 si basano sul tessuto nervoso di coniglio e ratto, ma non sul tessuto BP neooatale. L'esecuzione di test biomeccanici in vivo in un modello animale neoooonale clinicamente rilevante può colmare il divario critico di dati BP neoatali non disponibili.
Lo studio attuale descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in maialini neonatale dello Yorkshire di 3-5 giorni. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano i ceppi e i carichi in vivo durante il guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il sistema consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoalatale quando sottoposto a stiramento, fornendo così le sollecitazioni di soglia della BP e le sollecitazioni per guasti meccanici in vivo. I dati ottenuti possono migliorare ulteriormente il comportamento umano (biofedeltà) dei modelli computazionali esistenti che sono progettati per studiare gli effetti delle forze esogene ed endogene sull'estensione BP in scenari di consegna associati a NBPP.

<table><tbody><tr><td>Omega Subminature Tensione & Cella di carico a compressione</td><td>Omega</td><td>LCM201-200N</td><td>Cella di carico 200N</td></tr><tr><td>Telecamera Basler acA640-120uc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attuatore lineare di feedback</td><td>Automazioni progressive</td><td>PA-14P</td><td>Corsa 10", forza 150 libbre, velocità 15 mm/s</td></tr><tr><td>Software di tracciamento del movimento</td><td>Kinovea</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software di programmazione open source - MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>versione 2018A</td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11006-12 e 11027-12 o 11506-12</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Fine</td><td>Science Tools Inc</td><td>14094-11 o 14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per il test biomeccanico in vivo su plexus brachiale in porcellini neoatali

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

La paralisi del plesso brachiale neonatale (NBPP) è una lesione elastica che si verifica durante il processo di nascita nei complessi nervosi situati nelle regioni del collo e della spalla, collettivamente indicata come plesso brachiale (BP). Nonostante i recenti progressi nell'assistenza ostetrica, il problema di NBPP continua ad essere un onere sanitario globale con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi. Tipi più gravi di questa lesione possono causare paralisi permanente del braccio dalla spalla in giù. La prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche dei nervi BP appena nati quando sottoposti a stiramento. L'attuale conoscenza della BP appena nata viene estrapolata dal tessuto animale adulto o cadaverico BP invece del tessuto BP neonatale in vivo. Questo studio descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in vivo in suinetti neotomotori. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano ceppi e carichi in vivo fino al guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il metodo presentato consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoonale quando sottoposto a allungamento.

Un grafico rappresentativo del tempo di carico e i ceppi di quattro segmenti di plexp BP (tra quattro marcatori) sono mostrati rispettivamente nella Figura 5 e nella Figura 6. Il carico di guasto ottenuto di 8,3 N al 35% di deformazione media di guasto riporta le risposte biomeccaniche di BP neooatale quando sottoposto a allungamento. Alcune regioni del nervo subiscono ceppi più elevati rispetto ad altre, indicative di lesioni no...

Qui sono presentati metodi per eseguire test biomeccanici in vivo su plexus brachiale in un modello di maialino neooatale.

Metodi per il test biomeccanico In Vivo su plexus brachiale in porcellini neoatali

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Questa tecnica replica i test di allungamento biomeccanico in vivo del plesso brachiale in un maialino, fungendo da modello animale neonatale di grandi dimensioni cliniche altamente rilevante. Questi metodi possono non solo aiutare a comprendere i meccanismi di lesione elastica, ma possono anche segnalare i valori soglia di lesione per i deficit funzionali e strutturali all'interno del plesso brachiale neonatale. A dimostrare la procedura sarà Rachel Magee, una studentessa laureata del mio laboratorio.Dopo aver confermato la mancanza di riflessi palpebrali e di astinenza, posizionare il maiale anestetizzato in posizione supina sul tavolo operatorio, con l'arto superiore in sequestro da esporre alla regione ascellare. Posizionare un drappo sull'animale e utilizzare una lama bisturi numero 10 per fare incisioni sulla pelle marcata. L'incisione della linea mediana sta sovrascrivere la trachea fino al terzo superiore dello sterno, esponendo il complesso del plesso brachiale su entrambi i lati della colonna vertebrale.Per esporre un lato del plesso brachiale dell'animale, viene eseguita un'incisione superiore dall'estremità superiore dell'incisione della linea mediana, corrispondente a C3, alla parte superiore del braccio e un'incisione inferiore è fatta dall'estremità inferiore dell'incisione della linea mediana, corrispondente a T3, alla parte superiore del braccio. Utilizzare le forcelle su ciascun lato dell'incisione per separare il tessuto dalla tacca soprasternale lungo il bordo della clavicola fino alla parte superiore del braccio risparmiando le vene cefaliche e basiliche. Usando forbici, forcep e dissezione smussata, rilasciare il lembo superiore per accedere alla regione cervicale del plesso brachiale e il lembo inferiore per accedere alla regione toracica del plesso brachiale.Eseguire la dissezione smussata sui muscoli superficiali per esporre il plesso brachiale. Quindi esaminare attentamente il plesso per individuare le biforcazioni delle divisioni e identificare le regioni del plesso brachiale sotto le biforcazioni, più vicine al braccio, come il cordone e il nervo e le regioni sopra le biforcazioni, più vicine alla colonna vertebrale, come radice o tronco. Per impostare il dispositivo di prova biomeccanico, collegare la base del dispositivo a un carrello e utilizzare grandi morsetti a C per collegare l'attuatore elettromeccanico alla base.Collegare una cella di carico di 200 newton all'attuatore e avvitare in un morsetto con plexiglass imbottito per evitare la concentrazione di sollecitazioni nel sito di bloccaggio. Utilizzando un treppiede, collegare una fotocamera in grado di registrare fino a 100 fotogrammi al secondo con una risoluzione di 658 per 492 pixel e collegare cavi USB dalla fotocamera, dall'attuatore e dalla cella di carico al computer per integrare e sincronizzare tutti i componenti della configurazione. Quindi collegare il computer, l'attuatore e la cella di carico a una fonte di alimentazione.Per calibrare la cella di carico prima di registrare i carichi applicati, utilizzare la maniglia regolabile per impostare l'attuatore con un angolo di 90 gradi in modo che sia allineato verticalmente e controllare l'angolo con un protrattore. Aprire il software della cella di carico e fare clic su Avvia per visualizzare una lettura in tempo vivo della tensione. Successivamente appendere zero a 1.000 grammi di peso dal morsetto in incrementi di 100 grammi, registrando le tensioni misurate ad ogni carico.Quando le tensioni sono state registrate per tutti i 10 pesi, calcolare la pendenza e intercettare per determinare l'equazione lineare delle tensioni e dei pesi. Per i test biomeccanici del nervo plesso brachiale isolato, utilizzare forbici fini per tagliare il nervo e utilizzare un morsetto personalizzato per bloccare il lato tagliato del nervo. Etichettare il segmento nervoso bloccato con vernice acrilica nera e posizionare un righello di un centimetro piatto all'interno dell'animale per impostare la scala per l'analisi dei dati.Nel software della fotocamera, posizionare il campo visivo della fotocamera direttamente sui segmenti testati per consentire il monitoraggio del movimento e/o dello spostamento dei marcatori e per determinare l'effettivo ceppo tissutale in un determinato punto temporale. Registrare le misurazioni di base come l'altezza alla quale il nervo si inserisce nel corpo dal tavolo, l'altezza del morsetto dal tavolo, l'angolo dell'attuatore e l'intera lunghezza del tessuto. Aprire il software di programmazione e fare clic su Esegui.Immettete il nome e lo spostamento del file e fate clic su Inizializza (Initialize) e TARE. Fate clic su Inizia (Start) per allungare il segmento del plesso brachiale. Il tessuto verrà tirato ad una velocità assegnata di 500 millimetri al minuto fino a quando non si verifica un completo fallimento in qualsiasi segmento del tessuto nervoso.Quindi salvare un file video, il carico di trazione applicato, lo spostamento del tessuto e la durata del test e registrare il sito di guasto come il segmento in cui il tessuto si rompe. In questo test rappresentativo di quattro segmenti di plesso brachiale, il carico di guasto ottenuto era di 8,3 newton e l'insufficienza media dello sforzo era del 35% per i campioni di tessuto nervoso neonatale quando sottoposti ad allungamento. Alcune regioni del nervo hanno subito uno sforzo più elevato rispetto ad altre, indicando una lesione non unica lungo la lunghezza del nervo.I dati della telecamera hanno permesso di identificare la posizione del guasto in questo esperimento come prossimale al forame. È importante assicurarsi che in primo luogo, l'animale sia profondamente anestetizzato e non mostri segni di dolore o disagio, in secondo luogo, per calibrare la cella di carico e, in terzo luogo, per bloccare saldamente il tessuto. Questo modello animale in vivo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti funzionali e istologici nel tessuto del plesso brachiale dopo vari gradi di allungamento e per studiare scenari di nascita complicati.

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Metodi per il test biomeccanico In Vivo su plexus brachiale in porcellini neoatali

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