Name: Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri come stabilire modelli xenograft derivati dal paziente e linee cellulari primarie da campioni chirurgici di cancro gastrico utilizzando topi NSG. Questo metodo consente di preservare l'eterogeneità intratumorale e migliorare la valutazione preclinica delle terapie antitumorali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81572392); il National Key Research and Development Program of China (2016YFC1201704); Tip-top talento giovanile scientifico e tecnico innovativo del programma di supporto speciale Guangdong (2016TQ03R614).
Ringraziamo specificamente Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. per l'aiuto nella preparazione delle cifre.

Questo studio umano è stato approvato dal Institutional Ethics Review Board del Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Cina). Lo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Sun Yat-sen. Nota: tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le leggi pertinenti e le linee guida istituzionali, tra cui la linea guida per la protezione dell'esposizione professionale contro gli agenti patogeni di origine ematica.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Ottenere tessuti gastrici del cancro (P0 - passaggio 0) direttamente dall'operazione. Il campione di tumore deve essere maggiore di 0,5 cm3.</li>
	<li>Preparare 3-4 mL di soluzione stock: ad esempio, RPMI-1640 medio (1x) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 0,1 mg/mL streptomicina.</li>
	<li>Mettere il campione di tumore fresco nella soluzione di magazzino a 4 gradi centigradi per non più di 4 ore.</li>
</ol>2. Istituzione del modello PDX (Figura 1)
<ol><li>Per garantire un'area chirurgica sterile, disinfettare tutti i materiali con luce ultravioletta per più di 30 min prima del trasferimento nel laboratorio animale. Nota: la sala operatoria deve essere disinfettata con luce ultravioletta per 30 min, prima di pulire la scrivania con dicloro isocianurico acido suppositoria disinfettante. Quindi il povidone-iodio viene utilizzato per disinfettare la pelle.</li>
	<li>Utilizzando pinze e forbici, sezionare attentamente i tessuti tumorali e tagliarli in diversi piccoli pezzi (circa 1 mm3 cubetti) in condizioni sterili.</li>
	<li>Anestetizza i topi NOD-SCID-IL2rg (NSG) di sesso femminile da 5 a 7 settimane, dall'esposizione all'1-1,5% dell'isoflurane con una macchina per l'anestesia.<ol>
<li>Anestesizzare il mouse fino a quando non smette di lottare, ma mantiene anche la respirazione. NOTA: Il tubo da 50 mL è un'apparecchiatura semplice che funziona in modo simile a una macchina per anestesia. L'uso di unguento oculare veterinario per evitare la secchezza non è necessario a causa del breve tempo di funzionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare un'incisione di 1 cm su entrambi i fianchi dorsali utilizzando forbici sterili, e impiantare un pezzo di tumore in ogni fianco del mouse.<ol>
<li>Per garantire che il pezzo di tumore non scivoli, utilizzare pinze sterili per interrompere il tessuto sottocutaneo. Quindi, agganciare un pezzo del tessuto tumorale e posizionarlo nel sito profondo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chiudere l'area dell'impianto con sutura sottocutanea con aghi di sutura chirurgica e contrassegnare le orecchie del mouse con etichette auricolari etichettate</li>
	<li>Sterilizzare la ferita con lo iodio.</li>
	<li>Posizionare delicatamente i topi in una gabbia vuota dopo l'intervento chirurgico, pur mantenendo la recumbency sternale. Prestare molta attenzione alle condizioni dei topi; si svegliano e cominciano a camminare circa 3-4 minuti più tardi. Posizionare i topi che hanno subito un intervento chirurgico in un'altra nuova gabbia separata da quelli non sottoposti a intervento chirurgico.</li>
	<li>Valutare le dimensioni del tumore mediante palpazione del sito di impianto. Misurare i tumori con una pinza Vernier due volte a settimana.</li>
	<li>Una volta che il tumore raggiunge i 10 mm di diametro, la condizione animale peggiora, o il tumore ulcera, eutanasia il topo con un metodo approvato dall'IRB. Reimplant ha raccolto frammenti tumorali freschi in 2 nuovi topi per passare, o memorizzare temporaneamente i campioni in PBS sul ghiaccio per l'isolamento delle linee cellulari primarie.</li>
</ol>3. Crioconservazione dei tessuti
NOTA: Questa parte fa riferimento principalmente ai metodi per il kit Cryo Kit di tessuto vivo. I kit e le attrezzature principali sono elencati nella Tabella dei Materiali.
<ol><li>Eutanasia i topi con un metodo approvato IRB quando il tumore è maggiore di 10 mm di diametro.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili e forbici, isolare lentamente il tumore dai topi.</li>
	<li>Lavare i tessuti tumorali con DPBS in un piatto di 10 cm. Dissezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo con pinze e forbici.</li>
	<li>Tagliare i tessuti tumorali ad uno spessore massimo di 1 mm con uno stampo.</li>
	<li>Lavare le fette con DPBS in un piatto di 10 cm. NOTA: Il processo di vitrificazione prevede l'uso di tubi etichettati V1/V2/V3 nei passaggi 3.6-3.8. Gli ingredienti principali sono DMSO e saccarosio.</li>
	<li>Trasferire le fette nel tubo V1 con pinze, e incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 4 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per altri 4 min.</li>
	<li>Versare la soluzione V1 e le fette in un piatto di 10 cm. Trasferire le fette nel tubo V2 con pinze, e incubare tubo V2 a 4 gradi centigradi per 4 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per altri 4 min.</li>
	<li>Versare la soluzione V2 e le fette in un piatto di 10 cm. Trasferire le fette nel tubo V3 con pinze, e incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 5 min. Roll e invertire brevemente il tubo, e posizionarlo a 4 gradi centigradi per almeno 5 min. Assicurarsi che le fette si affondino tutte sul fondo del tubo.<ol>
<li>Se più fette rimangono galleggianti, rotolare e invertire brevemente il tubo, e posizionare il tubo a 4 gradi centigradi di nuovo fino a quando tutte le fette affondano completamente; se necessario, scartare le sezioni mobili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versare la soluzione V3 e le fette in un piatto di 10 cm.</li>
	<li>Tagliare i supporti del tessuto alla giusta lunghezza e metterli su garza sterile. Trasferire le fette sui supporti. Avvolgere i supporti con la garza e metterli in azoto liquido usando pinze, seguite da incubazione per 5 min.</li>
	<li>Etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sui tessuti.</li>
	<li>Trasferire i supporti con fette di tessuto in fiale criogeniche, che vengono immagazzinate in azoto liquido.</li>
</ol>4. Isolamento delle celle primarie (Figura 2)
<ol><li>Sterilizzare pinze e forbici con vapore ad alta pressione a 121 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Resect campioni di cancro gastrico da campioni resedati o tessuti PDX raccolti. Posizionare i tessuti sul ghiaccio, e poi, trasferire i tessuti in un piatto di coltura sterile 10 cm.</li>
	<li>Dissezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo con pinze e forbici.</li>
	<li>Lavare i tessuti tumorali una volta con DPBS contenente 100 U/mL penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina in un piatto di 10 cm.</li>
	<li>Tagliare il tessuto tumorale in 1 mm3 pezzi sul coperchio del piatto; lo spessore massimo di ogni pezzo deve essere di 1 mm.</li>
	<li>Trasferire i tessuti in un tubo di centrifuga di 50 mL con circa 7 mL di collagenasi di tipo 1 e soluzione di trypsin (1:14). Vortice brevemente la miscela.</li>
	<li>Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30-40 min.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di RPMI-1640 medio (1x) integrato con 10% FBS al tubo. Vortice accuratamente la miscela.</li>
	<li>Trasferire la miscela in un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL filtrando lentamente attraverso un filtro da 40 m. NOTA: Utilizzare filtri da 40 m per garantire un rapporto più elevato tra le cellule tumorali. Se necessario, è possibile utilizzare filtri da 100 m per preservare più tipi di cellule, come le cellule immunologiche.</li>
	<li>Centrifugare i filtrati a 113-163 x g per 5-7 min a RT. Rimuovere con attenzione il sovrentrato.</li>
	<li>Lavare il pellet con 5 mL di PBS e rimuovere con cura il supernatante.</li>
	<li>Se il pellet è rosso, contiene molti eritrociti. Risospendere delicatamente il pellet con 500 lun di lisi di lissi dei globuli rossi. Dopo un'incubazione di 5 min, aggiungere 5 mL di PBS e rimuovere con attenzione il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet con il mezzo di coltura e trasferire la miscela in un piatto sterile di 10 cm.</li>
	<li>Sostituire il mezzo con un supporto contenente siero ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Passare le cellule primarie utilizzando trypsin / EDTA quando raggiungono 50% confluenza.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Ca-a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
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<li>Liu, X., Meltzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Cancer+in+the+Era+of+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShultz%2C+LD+%22Human+cancer+growth+and+therapy+in+immunodeficient+mouse+models%22">Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models</a>. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).</li>
<li>McDermott, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma+%28c%29+%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+human+hematopoietic+stem+cells+and+human+breast+cancer+cells+in+NSG+mice%3A+a+novel+approach+to+generate+tumor+cell+specific+human+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies.</a> MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il cancro gastrico è una malattia aggressiva con opzioni terapeutiche limitate; così, i modelli di cancro gastrico sono diventati una risorsa critica per consentire studi di ricerca funzionale con traduzione diretta alla clinica4,8,17. Qui, abbiamo descritto i metodi e il protocollo per stabilire modelli PDX di cancro gastrico e linee cellulari primarie. È importante sottolineare che le caratteristiche morfologiche e biologiche ...

Il cancro gastrico è il quinto cancro più comune al mondo e la terza causa di morte per cancro. Nel 2018, oltre 1.000.000 nuovi casi di cancro gastrico sono stati diagnosticati a livello globale, e si stima che 783.000 persone siano state uccise da questa malattia1. L'incidenza e la mortalità del cancro gastrico rimangono molto elevate nei paesi dell'Asia nordorientale2,3. Nonostante i progressi significativi nel campo delle terapie contro il cancro, la prognosi dei pazienti con cancro gastrico avanzato rimane scarsa, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni di circa il 25%4,5,6, 7,. Pertanto, vi è un'urgente necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche per il cancro gastrico
Il trattamento del cancro gastrico è impegnativo a causa della sua elevata eterogeneità8,9. Così, la questione di come affrontare le sfide dell'eterogeneità tumorale per realizzare la medicina di precisione è centrale nella ricerca sul cancro. I modelli in vitro e in vivo svolgono un ruolo cruciale nel chiarire i meccanismi eterogenei e la biologia del cancro gastrico. Tuttavia, sebbene esistano numerose linee cellulari del cancro gastrico e molti modelli di topo transgenici convenzionali per la ricerca preclinica, gli svantaggi di questi modelli limitano le loro applicazioni10. Poiché le caratteristiche di questi modelli sono cambiate nella coltura, non modellano più l'eterogeneità tumorale e le loro risposte non sono state in grado di prevedere le risposte negli esseri umani11. Questi problemi limitano gravemente la possibilità di identificare sottogruppi di pazienti oncologici che risponderanno a farmaci mirati. La cultura a breve termine dei tumori primari fornisce un modo relativamente rapido e personalizzato per indagare le proprietà farmacologiche anticancro, che sarà probabilmente il segno distintivo del trattamento del cancro personalizzato.
Gli xenografi derivati dai pazienti (PDX) sono preferiti come modello preclinico alternativo per la profilazione della risposta ai farmaci12. Inoltre, i modelli PDX offrono un potente strumento per studiare l'inizio e la progressione del cancro13,14. I modelli PDX conservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratutale e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale15,16. Tuttavia, la limitazione dei modelli PDX ampiamente utilizzati è il basso tasso di successo per stabilire e propagare serialmente i tumori solidi umani. In questo studio, sono descritti metodi di decente successo per stabilire modelli PDX e linee cellulari primarie.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Cell Strainer</td><td>Biologix, Shandong, Cina</td><td>15-1040</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio biologico</td><td>OLYMPUS, Tokyo, Giappone</td><td>OLYMPUS CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf, Mittelsachsen, Germania.</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Basalmedia Technology, Shanghai, Cina</td><td>L40601</td><td></td></tr><tr><td>Armadio dell'acqua elettrotermostatico</td><td>Yiheng, Shanghai, Cina</td><td>DK-8AXX</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada</td><td>86150040</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter, Cina</td><td>Kit CN2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto Vivo Kit Criogenico</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghai, Cina</td><td>LT2601</td><td></td></tr><tr><td>Kit di scongelamento dei tessuti vivi</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghai, Cina</td><td>LT2602</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Biocytogen, Pechino, Cina</td><td>B-CM-002-4-5W</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina & streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi dei globuli rossi</td><td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>8118367</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da sutura chirurgici con filo</td><td>LingQiao, Ningbo, Cina</td><td>3/8 arco 4&volte; 10</td><td></td></tr><tr><td>stampi e lame ausiliarie per il trattamento dei tessuti</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghai, Cina</td><td>LT2603</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>2003779</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi di tipo 1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>17100017</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilimento di modelli xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

L'uso di modelli preclinici per far progredire la nostra comprensione della biologia tumorale e studiare l'efficacia degli agenti terapeutici è fondamentale per la ricerca sul cancro. Anche se ci sono molte linee cellulari di cancro gastrico stabilite e molti modelli di topo transgenici convenzionali per la ricerca preclinica, gli svantaggi di questi modelli in vitro e in vivo limitano le loro applicazioni. Poiché le caratteristiche di questi modelli sono cambiate nella coltura, non modellano più l'eterogeneità tumorale e le loro risposte non sono state in grado di prevedere le risposte negli esseri umani. Così, si stanno sviluppando modelli alternativi che meglio rappresentano l'eterogeneità del tumore. I modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente conservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratuita e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale. Tuttavia, di solito ci vogliono 4-8 mesi per sviluppare un modello PDX, che è più lungo della sopravvivenza prevista di molti pazienti gastrici. Per questo motivo, stabilire linee cellulari tumorali primarie può essere un metodo complementare efficace per gli studi di risposta ai farmaci. Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli PDX e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. Questi metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

Qui, i tessuti tumorali di un'operazione sono stati conservati in soluzione stock fino al passo successivo. Nel giro di 4 ore, i tessuti tumorali sono stati tagliati in piccoli pezzi e impiantati nei fianchi dorsali dei topi NSG che erano stati anestesizzati utilizzando cotone imbevuto di isoflurane. I tumori superiori a 1 cm3 potrebbero essere resezionati per l'impianto in nuovi topi (Figura1) o tagliati con cura e conservati in azoto liquido seguendo il protocollo. In questo stu...

Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. I metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

I modelli xenograft derivati dal paziente e le linee cellulari primarie stanno diventando parte integrante dello sviluppo del farmaco e dell'iniziazione e della progressione della ricerca sulla biologia tumorale. I modelli xenograft derivati dal paziente preservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratumorale e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale. I suoi modelli sono per rappresentazioni più accurate del cancro umano rispetto alle tradizionali linee cellulari tumorali e hanno il potenziale per migliorare la valutazione preclinica di nuove terapie anticancro.Inoltre, questi modelli possono essere utili per confrontare le caratteristiche molecolari o le firme tumorali tra diversi sottogruppi di pazienti oncologici. I topi NSG sono raccomandati come modello di topo immunodifeso. A causa della grave immunodeficienza dei topi, la sterilità deve essere mantenuta in tutti gli esperimenti.In condizioni sterili, utilizzare forcelle e forbici per sezionare attentamente i tessuti tumorali e tagliarli in diversi piccoli pezzi. Dopo aver anestetizzato il topo, usa forbici sterili per fare un'incisione di un centimetro su entrambi i fianchi dorsali. Utilizzare forcelle sterili per interrompere il tessuto sottocutaneo.Quindi, aggancia un pezzo del tessuto tumorale e mettilo nel sito profondo. Chiudere l'area dell'impianto per sutura sottocutanea con aghi di sutura chirurgica. Sterilizzare la ferita con iodio.Dopo questo, posizionare delicatamente i topi in una gabbia vuota mantenendo la reclinanza sternale. Presta molta attenzione ai topi perché dovrebbero svegliarsi e iniziare a camminare dopo circa tre o quattro minuti. Posizionare i topi sottoposti a intervento chirurgico in una nuova gabbia separata da quelli non sottoposti a intervento chirurgico.Valutare la dimensione del tumore palpando il sito di impianto e misurarli con una pinza Vernier due volte a settimana. Dopo aver eutanasiato i topi, utilizzare forcep e forbici sterili per isolare lentamente il tumore dai topi. Lavare i tessuti tumorali in DPBS in un piatto di 10 centimetri.Si forzano e forbici per sezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo. Successivamente, utilizzare uno stampo per tagliare i tessuti tumorali a uno spessore massimo di un millimetro. Lavare le fette tumorali con DPBS in un piatto di 10 centimetri.Per iniziare il processo di vetrificazione, utilizzare le forcep per trasferire le fette nel tubo V1 e incubare a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius per altri quattro minuti. Quindi, versare la soluzione V1 e le fette in un piatto di 10 centimetri e utilizzare le forcep per trasferire le fette nel tubo V2. Incubare a quattro gradi Celsius per quattro minuti.Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubarlo a quattro gradi Celsius per altri quattro minuti. Dopo questo, versare la soluzione V2 e le fette in un piatto di 10 centimetri. Trasferire le fette nel tubo V3 e incubare a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius per altri cinque minuti. Assicurarsi che tutte le fette affondino sul fondo del tubo. Se diverse fette rimangono galleggianti, rotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius fino a quando tutte le fette affondano completamente.Quindi, versare la soluzione V3 e le fette in un piatto di 10 centimetri. Tagliare i supporti del tessuto alla lunghezza corretta e posizionarli su una garza sterile. Trasferire le fette sui supporti.Avvolgere i supporti con garza. Utilizzando le bombole, posizionare i supporti in azoto liquido e lasciarli incubare per cinque minuti. Successivamente, etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sui tessuti.Trasferire i supporti con fette di tessuto nelle fiale, che verranno conservate in azoto liquido. In primo luogo, i campioni di cancro gastrico resect da campioni reinsediati o tessuti PDX raccolti. Posizionare i tessuti sul ghiaccio e trasferirli in un piatto di coltura sterile di 10 centimetri.Usa flessidi e forbici per rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo. Lavare i tessuti tumorali una volta con DPBS contenente penicillina e streptomicina in un piatto di 10 centimetri. Quindi, tagliare il tumore a pezzi sul coperchio del piatto.Lo spessore massimo di ogni pezzo dovrebbe essere di un millimetro. Trasferire i pezzi in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente sette millilitri di una soluzione di collagenasi e tripparina di tipo 1. Vortice brevemente la miscela.Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30-40 minuti, assicurandosi di vortice la miscela ogni cinque minuti. Successivamente, aggiungere un volume uguale di mezzo RPMI-1640 integrato con 10%FBS e vortice accuratamente la miscela. Trasferire questa miscela in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri mediante filtrazione lenta attraverso un filtro da 40 microlitri.Centrifugare i filtrati ad una velocità compresa tra 113 e 163 volte g per cinque-sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura questo supernatante. Lavare il pellet con cinque millilitri di PBS e rimuovere con cura il supernatante.Se il pellet è rosso, contiene eriociti. Rimescolare delicatamente il pellet con 500 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere cinque millilitri di PBS.Centrifuga a una velocità compresa tra 113 e 163 volte g per cinque-sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e risospendire il pellet con il mezzo di coltura e trasferire la miscela in un piatto sterile di 10 centimetri. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%, assicurandosi di sostituire il mezzo con mezzo contenente siero ogni due o tre giorni.In questo studio vengono stabiliti modelli PDX di cancro gastrico e linee cellulari primarie. Si vede che i tumori di prima generazione crescono più lentamente di quelli delle generazioni successive, richiedendo tre settimane o più per raggiungere le dimensioni appropriate. Il tasso di successo della formazione di tumori sottocutanei di prima generazione è superiore all'80%L'identità delle cellule tumorali dai modelli PDX è confermata dai modelli PDX dalla colorazione H&E.Il tasso di successo della formazione tumorale dal tessuto tumorale crioconservato è visto come circa il 95%Le cellule tumorali possono essere facilmente riconosciute dalle differenze morfologiche. Le cellule primarie sono autenticate indipendentemente da due patologi al microscopio. Per ulteriori conferme, la colorazione H&E viene utilizzata per osservare la morfologia delle cellule tumorali dopo la fissazione.Il tasso di isolamento riuscito delle linee cellulari primarie è di circa il 40%Questi modelli hanno dimostrato di essere predittivi dei risultati clinici e vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci mediante identificazione marcatore, studi biologici e strategie di medicina personalizzata.

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Questo video descrive il protocollo per la generazione di metastasi da parte degli organoidi CRC derivati da PDX marcati con lentivirus GFP nella milza di un topo immunodeficiente. Le micrometastasi tumorali che colonizzano altri organi possono essere rilevate utilizzando un microscopio a fluorescenza per valutare l'espressione di GFP.

Stabilire un modello murino sperimentale di metastasi: impianto di cellule organoidi CRC che esprimono GFP nel modello PDX per rilevare le micrometastasi

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

Qui descriviamo un protocollo per stabilire e coltura umano e del mouse-derivato organoids gastrico 3-dimensionale (3D) e il metodo per il trasferimento di organoids 3D di un monostrato di 2-dimensionale. L'uso del monolayer epiteliale gastrico come un'analisi novella di zero-ferita per studi di rigenerazione è anche descritto.

Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

I modelli PDX di metastasi del sistema nervoso centrale rappresentano le caratteristiche fenotipiche e molecolari delle metastasi umane, rendendoli modelli eccellenti per studi preclinici. Qui viene descritto come stabilire i modelli PDX e le vie di inoculazione meglio utilizzate per gli studi preclinici.

L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale

Il presente protocollo stabilisce e caratterizza un modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), poiché i modelli PDX stanno rapidamente diventando lo standard nel campo dell'oncologia traslazionale.

Definizione e caratterizzazione di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di carcinoma anaplastico della tiroide e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo

Questo protocollo descrive l'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti. Il modello ricapitola la malattia metastatica del carcinoma colorettale avanzato e consente la valutazione di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario clinicamente rilevante di metastasi polmonari ed epatiche.

L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato

Gli organoidi derivati da pazienti gastrici trovano un uso crescente nella ricerca, ma mancano protocolli formali per la generazione di organoidi gastrici umani da digest a singola cellula con densità di semina standardizzata. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per creare in modo affidabile organoidi gastrici da tessuto bioptico ottenuto durante l'endoscopia superiore.

Costituzione e caratterizzazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da biopsie del corpo gastrico benigno e dell'epitelio antrale

Questo protocollo descrive un metodo efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario nei topi. La tecnica prevede la dissociazione enzimatica del tumore seguita da un'iniezione diretta nei cuscinetti adiposi mammari, consentendo un impianto ad alto rendimento. La convalida completa garantisce la fedeltà del modello, facilitando studi rigorosi su vari sottotipi di cancro al seno.

Dissociazione ad alto rendimento e impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Scopri come stabilire modelli xenograft derivati dal paziente e linee cellulari primarie da campioni chirurgici di cancro gastrico utilizzando topi NSG. Questo metodo consente di preservare l'eterogeneità intratumorale e migliorare la valutazione preclinica delle terapie antitumorali.

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

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