Name: Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Impara a depletare proteine specifiche in Saccharomyces cerevisiae con il sistema β-est AID. Questo metodo rapido consente di studiare funzioni essenziali senza compromettere la vitalità cellulare.

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Grazie a Jane Reid per aver dato l'avvio di questo programma, Barbara Terlouw per lo sviluppo, Vahid Aslanzadeh per i costrutti "ura looper" e Susana de Lucas per molte discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio a GIMO dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, Messico (CONACYT) e dalla Scuola di Scienze Biologiche dell'Università di Edimburgo, un dottorato di ricerca Wellcome a IEM [105256] e da Wellcome finanziamento [104648] a JD Beggs . Il lavoro nel Wellcome Centre for Cell Biology è supportato dal finanziamento del nucleo del Wellcome [092076].

NOT:</</c0> Vedere La Figura 2 per un riepilogo grafico.
1. Preparazione del deformazione
<ol><li>
Utilizzando un ura3-strain, introdurre il sistema DI AID (cioè i geni che codificano il fattore di trascrizione reattivo-estradiolo (ATF) e l'osTIR) e l'AID, etichettare la proteina bersaglio (vedere la Figura 3 e la Tabella 1 per un riepilogo della procedura).
	<ol>
<li>Trasformare il plasmidedi 15 p-TRK (G418) o il plasmide (marcatoreLEU2) (disponibile presso il Lievito Genetic Ogmcomino) nel ceppo di lievito riccio3 o utilizzare il plasmide come modello per produrre il prodotto PCR per la genomica integrazione f.</li>
		<li>La PCR amplifica l'ATF (contrassegnata con la 4EVATF sulla mappa plasmide) e l'osTIR utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà da uno dei plasmidi p-TRK o p-TRL. Utilizzare primer con 50 a 60 estensioni in base 3' con omologia alla regione genomica, per l'integrazione diretta con ricombinazione omologa16. Per l'integrazione genomica dei due componenti separatamente o insieme, vedere la tabella 1 per i primer e le condizioni. NOT:</</c9> Il ceppo p-4EV-NTR1 ha i componenti già integrati nel genoma (disponibile presso il Lievito Genetic Resource Centre, Giappone).</li>
		<li>Assicurarsi che la proteina bersaglio sia etichettata con la procedura Longtine17 (vedere la figura 3b e la tabella 1).</li>
		<li>Eseguire un'analisi della crescita sul ceppo senza la presenza di z-estradiol e IAA per determinare se il tag AID influenzi la crescita e per prevedere il tasso di crescita per l'uso al punto 1,5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procedura generale per l'esaurimento
<ol><li>Calcolare la quantità di cultura necessaria per la raccolta di tutti i campioni; ad esempio, 10 mL di coltura a OD600 di 0,8 sono sufficienti per l'estrazione di proteine, RNA e DNA per un singolo campione, quindi per 6 campioni sono necessari almeno 60 mL di coltura.</li>
	<li>Da una cultura notturna, impostare una nuova cultura sufficiente a OD600 0.1 a 0.2 e lasciare crescere a 30 gradi centigradi. Un mezzo ricco come YPDA è raccomandato, anche se altre condizioni di crescita possono essere utilizzati:<table><tbody>
<tr>
<td>Estratto di lievito</td>
				<td>10 g</td>
			</tr>
<tr>
<td>Peptone</td>
				<td>20 g</td>
			</tr>
<tr>
<td>glucosio</td>
				<td>20 g</td>
			</tr>
<tr>
<td>Solfato di Adenina</td>
				<td>40 mg</td>
			</tr>
<tr>
<td>H2O per</td>
				<td>1 L</td>
			</tr>
</tbody></table>
 NOT:</</c3> Autoclave o filtro sterilizzare; la sterilizzazione filtrante è preferita come complessi peptidi/zucchero prodotti da precipitazioni autoclaving nel metanolo utilizzato nella raccolta dei campioni.</li>
	<li>Prepararsi a ricevere i campioni.
	<ol>
<li>Mettere dal 30 al 50% del volume del campione previsto di metanolo in un tubo. Ad esempio, se deve essere prelevato un campione da 10 mL, mettere 5 mL di metanolo in un tubo falco da 15 mL e chiudere saldamente il tubo. Una volta chiuso, etichettare il tubo e mettere su ghiaccio secco o a -80 gradi per raffreddare. ATTENZIONE: Distribuisci il metanolo in una cappa di fumi.</li>
		<li>Etichettare i tubi da 1,5 mL per lo stoccaggio a lungo termine dei campioni e metterli nel ghiaccio per raffreddarle.</li>
		<li>Raffreddare abbastanza H2O (almeno 1 mL per campione) sul ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Anticipare la crescita della cultura. L'OD target per la raccolta dei campioni è di circa 0,7 a 0,8, ma la fase di pre-incubazione (l'incubazione con il -estradiolo per indurre l'osTIR), deve essere avviata prima in modo che la coltura raggiunga approssimativamente l'OD destro nel momento in cui i campioni sono raccolto. NOT:</</c0> Si consiglia di eseguire una curva di crescita nelle condizioni da utilizzare nell'esperimento in modo che questo OD iniziale possa essere stimato.</li>
	<li>Una volta raggiunto l'OD target per l'inizio della pre-incubazione, preleva un campione (di solito 10 mL), nel tubo pre-preparato contenente metanolo freddo. Invertire brevemente per mescolare e riporre nel ghiaccio secco. NOT:</</c0> Il campione può essere spostato sul ghiaccio d'acqua dopo circa 5 min, se conveniente farlo.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente il valore di z-estradiol, 1 l/mL di coltura (concentrazione finale di 10 M); hanno il modello z-estradiolo pre-misurato in una pipetta pronta per l'uso al fine di ridurre il tempo necessario tra la raccolta del campione e l'aggiunta del file estradiolo. Mescolare rapidamente vorticoso vigorosamente.</li>
	<li>Continuare a far crescere la coltura come prima (passaggio 2.2), incubare (questa è la fase di "pre-incubazione") con il percorso di z-estradiol per il tempo ottimale (per la determinazione del tempo ottimale pre-incubazione vedere Figura 1).</li>
	<li>Prepararsi ad aggiungere IAA (auxin). Riprendi il volume di IAA necessario per il passaggio 2.10 (cioè 0,5 - L di IAA per mL di coltura). Questo rende il passo 2.20 più veloce.</li>
	<li>Raccogliere un campione come passaggio 2.5.Collect a sample as step 2.5.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente iAA di 0,5 gradi/mL di coltura ad una concentrazione finale di 750 M, come preparato al punto 2.8. Mescolare rapidamente vorticoso vigorosamente.</li>
	<li>Raccogliere i campioni, come passo 2.5, secondo il vostro progetto sperimentale. O un singolo campione, in un momento in cui si prevede che la proteina sarà esaurita in modo affidabile, o più campioni in un ciclo temporale di esaurimento. Ad esempio, intervalli di 5 min sono convenienti per la temporizzazione e forniscono una gamma di livelli di proteine. La strategia di ottimizzazione, come illustrato nella Figura 1, darà un'indicazione dei tempi adatti.</li>
	<li>Elaborare i campioni.
	<ol>
<li>Mettere i campioni sul ghiaccio, se non già fatto. Assicurarsi che nessuno dei campioni sia congelato; se hanno, delicatamente caldo in mano, invertendo costantemente in modo che la temperatura non aumenti localmente. NOT:</</c2> Questo è meglio fare in mano come la temperatura del campione può essere valutato, dovrebbe sempre sentire freddo. Mettere sul ghiaccio. Questo non è un punto di pausa - una volta che tutti i campioni sono fluidi, procedere al passaggio successivo.</li>
		<li>Una volta che tutti i campioni sono stati raccolti e non sono più congelati, girare a 3.500 x g per 2 min (se possibile a 4 gradi centigradi).</li>
		<li>Versare il mix metanolo/medio e riporre il ghiaccio; non preoccuparti se non tutto il liquido è stato rimosso.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di ghiaccio freddo H2O (dal passo 2.3.3) e trasferirlo in un tubo etichettato da 1,5 mL (preparato al punto 2.3.2) sul ghiaccio.</li>
		<li>Girare brevemente (ad esempio, 10 s tempo totale) a >15,000 x g per re-pellet le cellule, riposizionare sul ghiaccio e rimuovere il liquido.</li>
		<li>Rimuovere H2O per aspirazione. I pellet cellulari possono essere immagazzinati a -20 gradi centigradi, o -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare il livello al quale la proteina è stata esaurita dall'analisi macchia occidentale18. NOT:</</c1> Una proteina19 e/o acido nucleico può essere estratta da un pellet a singola cellula per la maggior parte degli scopi, anche se le specie di RNA rare potrebbero richiedere più volume campione.</li>
</ol>

<ol><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anchor-Away+Technique%3A+Rapid%2C+Conditional+Establishment+of+Yeast+Mutant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes.</a> Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).</li>
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<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-961 (1998).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un protocollo ben ottimizzato può produrre un rapido ed efficiente esaurimento della proteina bersaglio. Determinare il tempo approssimativo pre-incubazione con il periodo di pre-incubazione è importante, in quanto ciò aumenta la riproducibilità dell'esaurimento, ma possono essere tollerate piccole variazioni nel tempo di pre-incubazione. D'altra parte, la cura deve essere presa con tempi dopo l'aggiunta di auxina, come il livello di proteine diminuisce molto rapidamente.
Un vantaggio di questo approccio è che l'esaurimento sintonizzato può essere ottenuto mediante combinazioni variabili di tempo di pre-incubazione con tempo di incubazione di z-estradiolo e IAA. Ad esempio, se lo si desidera, la proteina bersaglio può essere più lentamente esaurita riducendo il tempo di pre-incubazione.
Il sistema AID di est offre alcuni vantaggi rispetto ai sistemi in cui OsTIR è espresso in modo imposizione. Ad esempio, se la proteina bersaglio è essenziale per la vitalità, l'espressione regolata di osTIR può evitare l'esaurimento prematuro della proteina bersaglio. Inoltre, l'espressione di osTIR può essere regolata per soddisfare l'abbondanza della proteina bersaglio e la sua suscettibilità alla degradazione, e l'esaurimento può essere veloce o lento. I due piccoli effetti molecolari, estradiolo e auxina, non pertturbiscono il metabolismo del lievito nelle condizioni utilizzate qui, a differenza della rapamicina, utilizzata nel sistema di ancoraggio1.
Va notato che l'etichettatura di alcune proteine interrompe la loro funzione, che è un problema con qualsiasi sistema di deplezione mirato. In questo caso, un tag N-terminal può funzionare quando un tag C-terminal non funziona. Inoltre, non tutte le proteine saranno esaurite in modo efficiente; ad esempio, l'etichetta AID sulla proteina bersaglio potrebbe essere inaccessibile alla proteina osTIR. Pertanto, dopo l'etichettatura DELL'AID, ogni proteina bersaglio deve essere testata per qualsiasi effetto del tag sulla crescita e per determinare se l'esaurimento è efficace, prima che i tempi di pre-incubazione e trattamento dell'auxina siano ottimizzati.
Questo sistema AID è molto semplice ed è compatibile con qualsiasi procedura sperimentale successiva che non comporti ulteriore crescita, come l'analisi di proteine, DNA o RNA o microscopia. Inoltre, il sistema funziona bene se combinato con la tioetichettaling per purificare l'RNA nascente20.
Questo sistema fornisce un mezzo rapido, specifico e riproducibile per esaurire una proteina senza influenzare in altro modo il metabolismo della cellula di lievito.

Le mutazioni condizionali, come i mutanti sensibili alla temperatura, sono un potente strumento per lo studio delle proteine essenziali, consentendo la crescita cellulare nella condizione permissiva, ma causando la perdita di funzione in condizioni non permissive. Tuttavia, metabolismo cellulare può essere seriamente turbato dal cambiamento nelle condizioni di crescita necessaria per indurre il difetto e può anche creare effetti off-target. Sono stati sviluppati diversi metodi, in cui la proteina di interesse è sequestrata in modo condizionale1 o la sua espressione è controllata2,3 mediante l'aggiunta di una piccola molecola. Questo protocollo utilizza l'auxina e il sistema di degron auxina (AID) per esaurire in modo efficiente una proteina bersaglio.
Il sistema AID ha origine nelle piante, dove viene utilizzata un'auxina (in questo protocollo indole-3-acetica acid (IAA), stimola l'interazione della proteina Aux/IAA con TIR1, membro del complesso di ligase di ubiquitina SCF U34. L'interazione complessa SCF provoca l'assoluzione poliilogica delle proteine familiari Aux/IAA, che si traduce nella loro degradazione da parte del proteasome5,6.
Questo sistema è stato precedentemente adattato per l'uso nel lievito Saccharomyces cerevisiae7,8 esprimendo la proteina TIR1 di Oriza sativa (osTIR) nelle cellule di lievito, dove è in grado di interagire con il lievito endogeno Complesso SCF. La proteina di interesse è stata etichettata con un motivo della proteina Aux/IAA IAA17 per indirizzarla alla degradazione. I troncazioni funzionali di IAA17 sono stati sviluppati più tardi, come AID8,9,10, contenente il motivo sensibile all'auxina da 43 aminoacidi dell'Arabidopsis thaliana IAA17, insieme a un tag epitope per consentire scoperta.
Il sistema inizialmente adattato per l'uso in lievito in erba7,8 ha espresso la proteina osTIR1 da un promotore GAL di lievito. Espressione richiede il passaggio al mezzo di crescita con galactose come unica fonte di carbonio, che, purtroppo, si traduce in un spostamento diauxico con ampi cambiamenti al metabolismo cellulare11. D'altra parte, è stato riferito che l'espressione costitutiva di TIR1 può portare alla degradazione della proteina bersaglio in assenza di auxin/IAA12 se il livello di espressione è alto, mentre una bassa espressione TIR1 provoca un esaurimento inefficiente. È stato sviluppato un sistema di AID migliorato, denominato AID di z-est, in cui l'osTIR è sotto il controllo di un promotore inducibile che è regolabile per soddisfare la proteina bersaglio, con un effetto minimo sul metabolismo cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, è stato costruito un fattore di trascrizione artificiale (ATF) in cui l'attivatore di trascrizione virale VP16 viene fuso a un recettore degli estrogeni e a un dominio di legame del DNA delle dita di quattro zn (DBD). Quando è presente il z-estradiolo (un estrogeno), l'ATF può entrare nel nucleo e indurre la trascrizione osTIR legandosi al suo promotore (4EVpr)13,12.
L'espressione osTIR è solitamente rilevabile circa 20 min dopo l'aggiunta di estradiol12. Tuttavia, la durata ottimale dell'espressione osTIR per ottenere un'efficienza della proteina marcata con auxina, evitando l'esaurimento prima dell'aggiunta di auxina, deve essere determinata empiricamente per ogni proteina bersaglio. Un tempo approssimativo per questa pre-incubazione può essere stimato dai valori di abbondanza nel banca dati del genoma di Saccharomyces (SGD https://www.yeastgenome.org/). Come si può vedere nella Figura1, l'abbondante proteina, Dcp1 (2880 a 4189 molecole/cellule), richiede 40 min di pre-incubazione con zestradiolo, senza alcun esaurimento indipendente dall'auxina osservato. La proteina molto meno abbondante, Prp2 (172 a 211 molecole/cellule), è fortemente esaurita dopo soli 20 min di pre-incubazione. Si consiglia di testare due tempi pre-incubazione aggiuntivi, da 10 a 20 min prima o dopo questo tempo stimato iniziale (20 min è il tempo minimo consigliato). Il tempo ottimale di pre-incubazione è il momento in cui la proteina bersaglio non si è esaurita prima di aggiungere l'auxina e una volta aggiunta l'auxina è accettabile o i livelli di proteine si avvicinano al minimo possibile. Così, dalla figura 1b, per Prp22 con 30 min di pre-incubazione, i livelli non sono diminuiti di molto 10 min dopo l'aggiunta di auxina. Confrontando questo con 40 min di pre-incubazione e 15 min con iAA, dove c'è poco esaurimento aggiuntivo, non vi è alcun beneficio nell'incubazione con auxina più lunga di 10 min o pre-incubazione per più di 30 min, in particolare perché vi sono prove di l'esaurimento dipendente a 40 min. Per Dcp1 con 40 min di pre-incubazione (l'ultimo punto in cui il livello proteico è di circa il 100% prima dell'aggiunta di auxina), 15-20 min di esaurimento con auxina è accettabile. Si raccomanda di mantenere il tempo di esaurimento il più breve possibile per ridurre gli effetti secondari sul metabolismo cellulare14.
In questo articolo viene illustrato come utilizzare il sistema AID di tipo Est, ottimizzando i tempi di incubazione estradiolo per l'espressione osTIR per ottenere un rapido esaurimento delle proteine bersaglio sull'aggiunta di IAA senza esaurirsi prima di aggiungere l'auxina.

<table><tbody><tr><td>Adenina solfato</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>&Beta;-estradiolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2758-1G</td><td>10 mM soluzione in etanolo. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Alfa Aesar</td><td>42780</td><td>Il DMSO deve essere solido a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>IAA 1H-indolo-3-acido acetico</td><td>Across Orgainics</td><td>122150100</td><td>Auxin analogo. 1,5 M in DMSO. La soluzione sarà di un colore ruggine e si scurirà con il passare del tempo; Una soluzione di colore rosso intenso deve essere scartata e ne deve essere preparata una nuova. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>ATTENZIONE Farmacogenio tossico e infiammabile</td></tr><tr><td>&nbsp; DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>per medio</td><td>PEP03</td><td></td></tr><tr><td>SCSM singolo drop-out &ndash; ura</td><td>Formedium</td><td>DSCS101</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td></td></tr><tr><td>Lievito base azotata senza amminoacidi con solfato di amnio</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

Il recettore del legame dell'auxina vegetale, TIR1, riconosce le proteine contenenti uno specifico motivo degron auxina inducibile (AID) in presenza di auxina, mirando a degradarle. Questo sistema è sfruttato in molti eucarioti non vegetali, in modo che una proteina bersaglio, etichettata con il motivo AID, sia degradata sull'aggiunta di auxina. Il livello di espressione TIR1 è critico; un'espressione eccessiva porta alla degradazione della proteina marcata con AID anche in assenza di auxina, mentre la bassa espressione porta a un lento esaurimento. È stato creato un sistema AID inducibile con z-estradiolo, con espressione di TIR1 sotto il controllo di un promotore inducibile di estradiolo. Il livello di TIR1 è regolabile modificando il tempo di incubazione con l'aggiunta di auxl prima dell'auxina. Questo protocollo descrive come esaurire rapidamente una proteina bersaglio utilizzando il sistema AID. L'appropriato tempo di incubazione estradiolo dipende dall'abbondanza della proteina bersaglio. Pertanto, un esaurimento efficiente dipende dalla tempistica ottimale che riduce al minimo l'esaurimento indipendente dall'auxina.

Esempi rappresentativi di esaurimento sono visualizzati nella figura 1. I tre esperimenti presentati in questa figura sono stati esperimenti di ottimizzazione per l'esaurimento delle proteine Prp2, Prp22 e Dcp1. La bassa abbondanza, le proteine silliceosomic e Prp22 entrambe si esaurivano a meno del 20% dopo 40 min pre-incubazione con z-estradiol seguito da 15 min con auxina. Tempi di pre-incubazione più lunghi portano ad un esaurimento più rapido, ma mostrano anche un esaurimento indesiderato delle proteine prima dell'aggiunta di auxina. In confronto, il più abbondante Dcp1 è stato esaurito solo a circa il 30% con lo stesso trattamento, ma 60 min di pre-incubazione ha portato all'esaurimento al 13% con lo stesso trattamento con auxina, a costo di esaurimento prima che venga aggiunta l'auxina. È possibile che 50 min di pre-incubazione con z-estradiol e 15 min con auxina avrebbero ottenuto risultati simili in un momento più breve e quindi sarebbe stato più ottimale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig01.jpg"> Figura 1: Il tasso di esaurimento può essere sintonizzato modulando la durata dell'incubazione pre-estradiole. Blotoccidentale 18 delle proteine bersaglio: (a e b) Prp22-AID-6FLAG, (c e d) Prp2-AID-6FLAG, e (e e f) Dcp1-AID-6HA, da colture pre-incubate con zestradiolo ( 60 min prima dell'aggiunta di auxina12. Pari quantità di proteine totali sono state caricate in ogni corsia. Pgk1 viene rilevato come controllo di caricamento visivo, ad eccezione del pannello e, dove pgk1 e Dcp1 co-migrate. La quantificazione delle bande proteiche nei pannelli a, c ed e sono mostrate rispettivamente nei pannelli b, de f. Come misura del tasso di esaurimento, la pendenza (m) è stata calcolata per la sezione lineare (dal 100% al 30% dei valori iniziali) di ogni curva. Il tempo ottimale di pre-incubazione è il momento in cui i livelli proteici sono ancora vicini ai livelli non indotti (100%) e il successivo tasso di esaurimento è veloce. Per Dcp1 (f), 60 min di pre-incubazione è troppo lungo, poiché la proteina ha cominciato a degradarsi in assenza di auxina, mentre 20 min è troppo breve, in quanto la proteina non si esaurisce sensibilmente in questo corso di tempo. Dopo 40 min pre-incubazione, 15 min con auxina può essere utilizzato come la proteina è circa 70% impoverito e, anche se 20 min si tradurrebbe in un ulteriore esaurimento, potrebbe anche provocare effetti secondari. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di due repliche biologiche. Per ogni esperimento, viene mostrata una macchia rappresentativa. Questa cifra è derivata dalla precedente pubblicazione9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2.jpg"> Figura 2: Riepilogo grafico. Aggiungere lo z-estradiol a una cultura sufficiente crescendo nel mezzo ricco e alla temperatura richiesta al fine di iniziare l'incubazione pre-incubazione. Continuare la crescita per il tempo pre-incubazione richiesto prima di aggiungere IAA (auxin) per iniziare l'esaurimento. I tempi di pre-incubazione e di esaurimento dipendono dalla proteina da impoverire, ma la pre-incubazione è spesso compresa tra 20 e 60 min e il tempo di esaurimento è generalmente nell'ordine di 10-20 min. 10 mL devono essere prelevati all'inizio e alla fine della pre-incubazione e della durata g l'esaurimento. Questi campioni vengono rapidamente fissati nel metanolo freddo prima della pellettura e dell'immagazzinamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig03.jpg"> Figura 3: Generazione di deformazione per il sistema B-est. (a) Per generare un ceppo di lievito con il sistema AID, sia il p-TRL (LEU2) o la resistenza p-TRK (kanamycin (G418), plasmide dovrebbe essere introdotto nel ceppo o, in alternativa, l'ATF e l'osTIR possono essere inseriti nel genoma da ricombinazione omologa di un frammento generato dalla PCR da primer 3'end (vedere la figura 3b e la tabella 1). (b) L'etichettatura del terminale C della proteina bersaglio è ottenuta dall'amplificazione PCR della regione appropriata del pLAsmide pURA3-AID-6FLAG (pURA3_AID-6HA differisce solo nel tag e può essere trattata esattamente allo stesso modo), utilizzando i primer longtine S3-F e S2-R con 3' estensioni omologhe all'estremità 3' della proteina bersaglio. L'estensione del primer in avanti deve includere l'ultimo codone aminoacido nel telaio con l'inizio del tag AID e non deve includere il codone di arresto. L'estensione del primer inverso deve essere in un'area a valle dell'area di codifica. Una volta inserite nel genoma, le cellule che hanno perso il marcatore URA3 (mediante ricombinazione omologa tra le regioni identiche trovate a entrambe le estremità del marcatore) possono essere selezionate dalla crescita con 5-FOA, che controseleziona le cellule URA3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8">a. Sequenze Primer</td>
		</tr><tr><td>bersaglio</td>
			<td>posizione</td>
			<td>testo elementare</td>
			<td>nome</td>
			<td colspan="3">sequenza</td>
			<td>Tm (C)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">P-RATL (T. TRL)</td>
			<td>516 del sistema</td>
			<td>F</td>
			<td>F (in modo incui in base all'utilizzo di p</td>
			<td colspan="3"><regione di omologia->GCGACAGCATCACCGCTACTTG</regione></td>
			<td>61.23</td>
		</tr><tr><td>7897</td>
			<td>R</td>
			<td>P.TR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTCTCTTGCAGA<regione di omologia></regione></td>
			<td>61.30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">il nuovo p-TRK</td>
			<td>9154</td>
			<td>F</td>
			<td>P-TRK_F</td>
			<td colspan="3"><area di omologia->ACGTTGAGCCATTAGTATCAATCATTGCTTACC</td>
			<td>Ore 59.40</td>
		</tr><tr><td>5897</td>
			<td>R</td>
			<td>P.TR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTCTCTTGCAGA<regione di omologia></regione></td>
			<td>61.30</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="2">pURA3-AID-6FLAG o pURA3_AID-6HA</td>
			<td>F</td>
			<td>S3-F</td>
			<td colspan="3"><area di omologia->CGTACGCTGCAGGTCGAC</td>
			<td>59.21</td>
		</tr><tr><td>R</td>
			<td>S2-R</td>
			<td colspan="3">ATCGATGAATTCGAGCTCG<regione di omologia></regione></td>
			<td>52,76</td>
		</tr><tr><td colspan="8">l'operazione di amplificare il sistema AID</td>
		</tr><tr><td colspan="8">pURA3-AID-6FLAG/6HA per amplificare l'AID e il tag epitope per etichettare la proteina bersaglio (procedura Lontine)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">&lt;-regione di omologia-&gt;</td>
			<td colspan="5">Regione omologa alle regioni di fianco in cui deve essere inserito il sistema. Più a lungo questa regione è più probabile che la modifica abbia successo; 50 - 100 basi è raccomandato.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"><regione di omologia></regione></td>
			<td colspan="5">Regione omologa alle regioni di fianco in cui il sistema deve essere inserito, ricordarsi di utilizzare il complemento inverso. Come sopra, più a lungo questa regione è migliore.</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tm (C)</td>
			<td colspan="5">Tm utilizzando il metodo %GC con 50 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td colspan="8">b. Miscela PCR</td>
		</tr><tr><td colspan="4">componente</td>
			<td colspan="4">Volume (L)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">sagoma</td>
			<td colspan="4">&lt;10</td>
		</tr><tr><td colspan="4">NeB Phusion HF Buffer (5x)</td>
			<td colspan="4">100 del sistema</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Primer in avanti 100 M</td>
			<td colspan="4">2.5 24,5</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Primer inverso 100 M</td>
			<td colspan="4">2.5 24,5</td>
		</tr><tr><td colspan="4">dNTPs 10 mM ciascuno</td>
			<td colspan="4">10 del sistema</td>
		</tr><tr><td colspan="4">H2O</td>
			<td colspan="4">fino a 500</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Il NEB Phusion GC Buffer (5x) può anche essere utilizzato, ma non è preferito</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Fare questa miscela, divisa in 10 tubi da 50, mescolati ciascuno ed eseguire la PCR come Tabella 1 c.</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Controllare che la PCR abbia funzionato correndo su un gel di agarose</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Combinare tutte le reazioni riuscite in un unico tubo e precipitato di etanolo</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Trasformare il lievito con tutto il materiale prodotto dalla PCR</td>
		</tr><tr><td colspan="8">c. Condizioni PCR</td>
		</tr><tr><td colspan="6">passo</td>
			<td>Temp (C)</td>
			<td>ora</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Denaturazione iniziale</td>
			<td>98 (di base)</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td colspan="3" rowspan="3">25-35 cicli</td>
			<td colspan="3">Denatura</td>
			<td>98 (di base)</td>
			<td>10 s</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ricuocere</td>
			<td>45–60 anni</td>
			<td>20 s</td>
		</tr><tr><td colspan="3">interno</td>
			<td>72 del 179</td>
			<td>30 s/kb</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Estensione finale</td>
			<td>72 del 179</td>
			<td>10 min</td>
		</tr><tr><td colspan="6">tenere</td>
			<td>8 (IN vio</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="8">Anneal a 45 gradi centigradi per il set di primer Lontine (S3-F e S2-R) e 60 s per i primer p-TRL/K</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Estendere per 3 minuti per la PCR Lontine e 3 minuti per p-TRL/K</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: sequenze Primer, mix PCR e condizioni PCR.

Qui, presentiamo un protocollo per esaurire in modo efficace e specifico una proteina di interesse per il lievito Saccharomyces cerevisiae utilizzando il sistema AID di est.

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Una tecnica comune per scoprire la funzione di una proteina è eliminarla e vedere cosa succede. Ma non puoi farlo con una proteina essenziale. È essenziale, la cellula muore.Quindi hai bisogno di un modo per rimuovere quella proteina e dare un'occhiata a ciò che accade poco prima della morte cellulare. L'esaurimento delle proteine dovrebbe essere veloce, quindi non si ottengono effetti secondari. Dovrebbe essere specifico, in modo che solo quella proteina venga rimossa e esaurita solo quando si desidera che sia.E non dovrebbe influenzare la cellula in nessun altro modo se non rimuovere quella proteina. Dopo aver preparato il ceppo, utilizzare una coltura notturna per determinare quale diluizione è necessaria. Utilizzare queste informazioni per impostare una nuova cultura sufficiente con un OD600 compreso tra 0,1 e 0,2 e aumentarla a 30 gradi Celsius.In una cappa aspirante aggiungere un metanolo equivalente al 30-50% del volume del campione previsto a un tubo da 15 millilitri. Chiudere saldamente i tubi, etichettarli e metterli sul ghiaccio secco per raffreddare. Successivamente, etichettare i tubi da 1,5 millilitri per lo stoccaggio a lungo termine dei campioni e posizionarsi sul ghiaccio per raffreddare.Raffreddare almeno un millilitro di acqua per campione sul ghiaccio. Una volta raggiunta la densità ottica bersaglio per l'inizio della pre-incubazione, trasferire un campione nel tubo pre-preparato contenente metanolo freddo. Invertire brevemente il tubo e riposizionare di nuovo sul ghiaccio secco.Questo è l'esempio di controllo non indotto. Immediatamente, aggiungere il beta-estradiolo in modo che la concentrazione finale sia di 10 micromolare. Ruotare vigorosamente per mescolare.Continuare a far crescere la cultura come prima, incubando con beta-estradiolo per il tempo ottimale come delineato nel protocollo di testo. Il tempo di incubazione beta-estradiolo è il passo più importante e deve essere ottimizzato per ogni proteina. Troppo breve e l'esaurimento è incompleto e lento.Troppo a lungo e i livelli proteici diminuiranno anche prima di aver aggiunto l'auxina. Pipetta fino a 0,5 microlitri di AIA per millilitro di coltura da aggiungere in seguito. Raccogliere un campione dalle impostazioni cultura non definite come descritto in precedenza.Aggiungere immediatamente l'AIA ad una concentrazione finale di 750 micromolare e ruotare vigorosamente per mescolare. Avviare un timer il prima possibile dopo la miscelazione. Raccogliere campioni secondo il progetto sperimentale.Quindi, metti i campioni sul ghiaccio. Assicurarsi che nessuno dei campioni si sia congelato. Se ce ne sono, scaldarli delicatamente nella mano mentre si inverte costantemente.Una volta raccolti e non congelati tutti i campioni, centrifugarli a 3,500 volte G e quattro gradi Celsius per due minuti. Versare il metanolo e mescolare mediamente e riposizionare i campioni sul ghiaccio. Quindi, resuspend il pellet cellulare in un millilitro di acqua e trasferire questa sospensione su un tubo etichettato sul ghiaccio.Centrifugare brevemente ad una velocità superiore a 15.000 volte G per repellere le cellule. Successivamente, riposizionare i tubi sul ghiaccio e aspirare il liquido. In questo studio, la degradazione è ottimizzata per ottenere un esaurimento proteico specifico ed efficiente senza altrimenti influenzare il metabolismo della cellula di lievito.Le proteine Prp2 e Prp22 spliceosomiche a bassa abbondanza sono entrambe esaurite a meno del 20% dopo 20 minuti di pre-incubazione con beta-estradiolo, seguite da 15 minuti con auxina. Tempi di pre-incubazione più lunghi portano a un impoverimento più rapido, ma mostrano anche un esaurimento proteico indesiderato prima dell'aggiunta di auxina. In confronto, il Dcp1 più abbondante è impoverito solo a circa il 30% con lo stesso trattamento.Tuttavia, 60 minuti di tempo di pre-incubazione si trae dall'esaurimento al 13% con lo stesso trattamento con auxina a costo di esaurimento prima dell'aggiunta dell'auxina. Ottimizza il tempo di pre-incubazione e non perdere traccia del tempo tra i tuoi punti di tempo. Cosa fare dopo dipende dalla tua domanda.Abbiamo scoperto che il campione di coltura da 10 mils è sufficiente per l'analisi di proteine, DNA o RNA. La procedura di campionamento è facilmente adattabile anche per il ChIP. Ora c'è un modo rapido e specifico per esaurire le proteine.Quindi la funzione anche delle proteine essenziali può essere trovata. Il protocollo è abbastanza sicuro. Il metanolo è l'unica sostanza chimica pericolosa.Fai attenzione mentre lo dispensa. Fallo in un cappuccio di fumi e indossa due paia di guanti, poiché il metanolo può superare la maggior parte dei guanti di nitrile.

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