Analisi dell'andatura a basso costo per la fenotipizzazione comportamentale dei modelli murini delle malattie neuromuscolari

L'analisi dell'impronta è un'alternativa a basso costo per digitalizzare i programmi di analisi dell'andatura per i ricercatori quantificando le anomalie del movimento nei topi. A causa della sua velocità, semplicità e potenziale longitudinale, questo metodo è ideale per la fenotipizzazione comportamentale di modelli di topi tra cui modelli di malattia neurodegenerativa, malattia neuromuscolare o ictus. A dimostrare la procedura sarà Virginia Wertman, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.

Prima di iniziare l'esperimento, acclimatare i topi che sono stati completamente svegli e avvisare per almeno cinque minuti nella sala saggi per 30 minuti. Posizionare il tunnel su una striscia di carta leggermente più larga e più lunga della lunghezza e della larghezza del tunnel. Contrassegnare la carta con l'ID mouse e la data di test.

Aggiungere semi di girasole alla camera obiettivo per la motivazione se necessario e scruffare saldamente il primo mouse da testare. Utilizzando punte del pennello rastrefocate di circa 0,5 centimetri di diametro, dipingere l'intera parte inferiore di tutte le dita dei piedi e il centro di ogni ara anteriore con un colore di vernice a base d'acqua lavabile non tossico. Rivestire le zampe posteriori con un colore di vernice a base d'acqua lavabile non tossico a contrasto in modo simile.

Utilizzare un panno umido pulito per rimuovere qualsiasi vernice che il mouse ottiene su altre parti del corpo per evitare macchie che potrebbero interferire con la raccolta dei dati. Quindi posizionare il mouse all'inizio del tunnel. Lasciare che il mouse cammini fino alla camera di gol prima di recuperare l'animale per pulire delicatamente i piedi con un panno inumidito dall'acqua.

Quindi riportare il mouse nella gabbia di casa e pulire l'area di prova e il tunnel con un disinfettante prima di testare l'animale successivo. Per un punteggio accurato, consenti alle impronte di asciugarsi completamente prima di selezionare i passaggi che sono costantemente distanziati con impronte chiare e non sbavate. Per generare dati di punteggio sufficienti, devono esserci almeno due passaggi consecutivi da ogni piede.

Non includere la prima e l'ultima impronta sulla carta in quanto è improbabile che rappresentino un'andatura normale perché il mouse stava cambiando la sua velocità di camminata. Per definire la lunghezza del passo come la distanza tra due impronte sequenziali create dallo stesso piede, usate una matita per disegnare un cerchio da due a quattro millimetri attorno alla regione dell'avampiede di entrambe le impronte dell'avampiede in un singolo passo e usate un righello per tracciare una linea tra i cerchi. Registrare la distanza tra due stampe dal centro di ogni cerchio come prima destra o prima sinistra, a seconda dei casi, e ripetere la misurazione per ciascuno dei passaggi che possono essere valutati.

Quindi media tutte le singole distanze di passo registrate per ogni arto che mediano i singoli punteggi all'interno di una coorte insieme come sperimentalmente appropriato. Per definire la larghezza della falcata come distanza tra gli arti anteriori sinistro e destro o gli arti posteriori, disegnare e misurare una linea dalla regione dell'avampiede cerchiata di un arto posteriore che si interseca perpendicolarmente con la linea per la lunghezza della falcata sull'arto posteriore controlaterale. Ripetere questa misurazione per tutte le stampe hindlimb che possono essere valutate e medie le misurazioni.

Per definire la punta di diffusione come la distanza tra il primo e l'ultimo dito su un singolo ingombro della parte posteriore o posteriore, utilizzare le pinze per misurare la distanza tra la punta della prima punta di punta e la punta dell'ultima punta di stampa. Quindi ripetere la misurazione per tutte le stampe hindlimb che possono essere valutate e mediare le misurazioni. Con un numero sufficiente di animali, questa procedura è in grado di rilevare le differenze di andatura tra i genotipi del topo all'interno dello stesso ceppo nel tempo.

Ad esempio, qui vengono mostrate tracce rappresentative di immagini di impronte raccolte utilizzando un modello di topo di atrofia muscolare spinale e bulbare legata all'x, un disturbo neurodegenerativo che colpisce i motoneuroni inferiori e il muscolo scheletrico. L'analisi dell'andatura dei topi maschi transgenici pre-sintomatici e post-sintomatici e del controllo del mate della lettiera rivela che prima dell'insorgenza della malattia, i topi transgenici mostrano una lunghezza del passo, una larghezza del passo e una diffusione simili rispetto ai loro controlli non transgenici. Dopo l'insorgenza della malattia, tuttavia, gli animali transgenici mostrano lunghezze del passo significativamente più brevi.

Un'analisi longitudinale simile non ha rivelato differenze nella larghezza del passo a nessuna delle due età testate. I topi transgenici post-sintomatici hanno anche una diffusione del dito posteriore significativamente più stretta rispetto ai controlli dell'accoppiamento dei rifiuti abbinati all'età. Una corretta applicazione della vernice alle zampe produrrà i migliori risultati.

Ricorda che devono essere segnati solo i passaggi che sono costantemente distanziati con impronte chiare e non sbavate. Questa tecnica è abbastanza sensibile da rilevare piccoli cambiamenti nel passo. E grazie al suo approccio non invasivo, consente di testare i gruppi durante la loro presentazione fenotipico della durata della vita e gli interventi terapeutici.