Studiare la plasticità sinaptica a lungo termine nell'Ippocampo Interlamellar CA1 di Electrophysiological Field Recording
11 agosto 2019
Abbiamo usato elettrodi di registrazione e stimolazione in fette di cervello ippocampali longitudinali e elettrodi di registrazione e stimolazione longitudinalmente posizionati nell'ippocampo dorsale in vivo per evocare potenziali post-ynaptici extracellulari e dimostrare plasticità sinaptica a lungo termine lungo l'interlamellar longitudinale CA1.
La plasticità sinaptica a lungo termine, in particolare, il potenziamento a lungo termine e la depressione a lungo termine sono stati ampiamente studiati lungo l'orientamento trasversale dell'ippocampo. È stato anche esaminato lungo l'orientamento longitudinale. Tuttavia, quando si tratta dell'orientamento longitudinale, è stata prestata pochissima attenzione all'asse longitudinale CA1 dell'ippocampo rispetto alla plasticità sinaptica.
Una precedente pubblicazione del nostro laboratorio ha dimostrato che i neuroni piramidali CA1 dell'ippocampo formano connessioni associazioniali che potrebbero supportare la plasticità sinaptica. Per ulteriori informazioni su questo protocollo, si consiglia di fare riferimento alla pubblicazione precedente con il riferimento riportato di seguito. Iniettare uretano per anestetizzare il mouse.
Posizionare il mouse completamente anestetizzato su una pastiglia di riscaldamento impostata su 37 gradi Celsius. Applicare il gel per gli occhi per inumidire gli occhi. Fissare saldamente il cranio del mouse utilizzando il morsetto per gli occhi.
Il morsetto per gli occhi offre la libertà di mobilità per lo sperimentatore durante le procedure chirurgiche. E può essere particolarmente utile anche per gli esperimenti che coinvolgono la corteccia uditivo. Tuttavia, occorre fare molta attenzione per ottenere le coordinate stereotassiche esatte.
Separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli alla fine dell'osso interparietale e occipitale del topo con il bisturi. Asciugare la materia dura con tampone di cotone. Quindi si fora la cisterna magna per drenare il liquido cerebrospinale.
Attaccare un batuffolo di cotone per continuare a drenare il liquido cerebrospinale. Tagliare e rimuovere la pelle sul cuoio capelluto e mantenere asciutta la regione esposta. Contrassegnare i punti corrispondenti alla regione ippocampale usando l'aiuto di una pinza veniyar.
Fai un'incisione nel cranio sopra la regione dorsale dell'ippocampo lungo i punti contrassegnati usando un bisturi o un trapano ad alta velocità mentre osservi al microscopio. Mantenere il tessuto cerebrale esposto umido applicando fisiologicamente salina o un olio inerte. Fissare e posizionare saldamente gli elettrodi di stimolazione e registrazione nel supporto stereotassico.
Regolare gli elettrodi di stimolazione e registrazione sopra l'ippocampo dorsale CA1. Usa il cervello del mouse in coordinata stereotassica come guida per localizzare la coordinata per la regione ippocampale dorsale longitudinale CA1. Per le registrazioni che utilizzano elettrodi multicanale, individuare innanzitutto le coordinate stereotassiche per la regione ippocampale CA1 utilizzando il primo canale.
Posizionare gli elettrodi rimanenti in modo che l'angolo di stimolazione e gli elettrodi di registrazione siano nell'intervallo da 30 gradi a 60 gradi rispetto alla linea mediana dal punto bregma. Questo angolo corrisponde all'orientamento longitudinale della regione ippocampale CA1. Accendere il sistema di registrazione.
Aprire il software neurale per la registrazione e l'acquisizione dei dati. Abbassare lentamente gli elettrodi di registrazione e stimolazione utilizzando il micromanipolatore fino a quando non tocca solo la superficie del cervello. Osserva un aumento dell'impedenza proprio quando l'elettrodo tocca la superficie cerebrale.
Questo può essere osservato nel canale rosso mostrato sullo schermo. Abbassare lentamente gli elettrodi alla profondità approssimativa corrispondente alle coordinate stereotassiche scelte per l'ippocampo CA1. Dare stimolazione fino a quando non si osserva un potenziale eccitatorio post-sinaptico evocato stabile.
Eseguire una curva input-output per rilevare la massima intensità di stimolo. Utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità della linea di base e impostare l'intensità dello stimolo per evocare la stimolazione ad alta frequenza o la stimolazione a bassa frequenza. Registrare il potenziale locale per un'ora dopo la stimolazione ad alta frequenza o la stimolazione a bassa frequenza.
Esportare i dati e analizzare utilizzando il software di scelta. Poveri 400 ml di soluzione di affezione già preparata in un pallone separato e ossigenati per circa 20 minuti. Poveri 200 ml della soluzione di affezione ossigenata.
Coprire in pellicola para e trasferire in un congelatore di 80 gradi per circa 20 minuti per fare una granita. Poveri i restanti 200 ml di soluzione di affettare in una camera di tenuta della fetta cerebrale e tenere in acqua bot di 32 gradi Celsius con gorgogliamento continuo. Esegni la soluzione di affezione refrigerata e povera di circa 50 ml in un bicchiere.
Decapitare il topo anestetizzato. Tagliare la pelle che copre il cranio del topo e tagliare il pezzo del cranio lungo la linea mediana fino all'osso occipitale. Apri il cranio con le forcep smussate.
Raccogliere delicatamente il cervello con una spatola e posizionare nella soluzione di affettamento refrigerata nel becher. Separare i due emisferi cerebrali lungo la linea mediana con una lama bisturi. Isolare l'ippocampo staccandolo delicatamente dalla corteccia con una spatola.
Ritaglia l'estremità setto e temporale dell'ippocampo isolato. Applicare una piccola quantità di colla sulla piastra di affettamento. Per una fetta ippocampale CA1 longitudinale, attaccare la regione CA3 dell'ippocampo alla piastra di affettare con la colla.
Per la fetta trasversale, che fungerà da controllo, attaccare l'estremità ventrale dell'ippocampo alla piastra di affettare del vibratoma. Mettilo nella camera di affezione. Impostare i parametri del vibratomo.
Affettare l'ippocampo attaccato con il vibratoma. Una buona fetta longitudinale del cervello ippocampale CA1 avrà uno strato di CA1 e due strati di giro dentato. Inoltre, saranno presenti gli oriens dello strato e il radiorato di strato della regione CA1.
In alternativa, una fetta cerebrale ippocampale trasversale avrà le regioni dentate di giro CA3 e CA1 in tatto. Trasferire le fette cerebrali nella camera di tenuta della fetta cerebrale nel bot dell'acqua. Incubare per 20 minuti a una temperatura di 32 gradi Celsius e portare a temperatura ambiente per il recupero.
Sovrasfondere continuamente il servo ACS nella camera di registrazione alla velocità di 2 ml al minuto. Trasferire la fetta cerebrale nella camera di registrazione, regolare la posizione della fetta cerebrale con le forcep smussate e tenerla in posizione con un hap. Attivare il software per l'acquisizione dei dati.
Fetta cerebrale longitudinale. Per le fette longitudinali, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nello strato oriens. Posizionare l'elettrodo di stimolazione sul lato setto o temporale della fetta cerebrale con la registrazione dallo stesso strato.
In alternativa, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nel radiorato dello strato, posizionare l'elettrodo di stimolazione nel lato setto o temporale della fetta cerebrale. Per le fette trasversali come controllo, posizionare l'elettrodo di stimolazione sulla regione del percorso collaterale CA3 Schaffer e l'elettrodo di registrazione sulla regione CA1. Accendere il generatore di stimolo isolatore e dare stimolazione.
Regolare la profondità dell'elettrodo di registrazione fino a quando non si osserva un potenziale eccitatorio post-sinaptico stabile. Eseguire una curva input-output per rilevare la massima intensità di stimolo. Utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità di stimolo per la registrazione di base che evoca stimolazione ad alta frequenza o stimolazione a bassa frequenza.
Fare riferimento al PDF allegato per i parametri che inducono il potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine. Il potenziale eccitatorio post-sinaptico evocato è aumentato in risposta alla stimolazione ad alta frequenza in vivo. Ciò dimostra che l'ippocampale longitudinale CA1 supporta il potenziamento a lungo termine.
Per le fette cerebrali longitudinali di CA1 ippocampali, è stato osservato un aumento della risposta alla stimolazione ad alta frequenza sia sul lato setto che temporale degli oriens dello strato e del radiato di strato. Ciò dimostra che la plasticità sinaptica indotta lungo la regione longitudinale dell'ippocampo CA1 non è lineare o specifica della direzione. Utilizzando protocolli già stabiliti per la depressione a lungo termine, nessuna depressione a lungo termine è stata indotta sia in vivo che in vitro.
Come conclusione, vi abbiamo mostrato come indagare la plasticità sinaptica a lungo termine nella regione longitudinale dell'ippocampo CA1 sia in vivo che in vitro. Maggiori dettagli del protocollo sono disponibili nel PDF che accompagna questo video per aiutarti a indagare la plasticità sinaptica a lungo termine lungo la regione longitudinale dell'ippocampale CA1 nei tuoi laboratori.
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Panoramica
Questo studio esplora la plasticità sinaptica a lungo termine lungo l'asse longitudinale della regione CA1 dell'ippocampo, utilizzando fette cerebrali longitudinali e registrazioni in vivo. L'indagine si concentra sul chiarimento dei potenziali postsinaptici extracellulari per comprendere le modifiche sinaptiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Plasticità Sinaptica
Sfondo
- La plasticità sinaptica a lungo termine è fondamentale per l'apprendimento e la memoria.
- Studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'orientamento trasversale dell'ippocampo.
- La ricerca dedicata alla plasticità sinaptica longitudinale del CA1 è stata limitata.
- Le connessioni associative dei neuroni piramidali del CA1 potrebbero sostenere la plasticità.
Scopo dello studio
- Studiare la plasticità sinaptica lungo l'asse longitudinale della regione CA1.
- Esplorare l'evocazione di potenziali postsinaptici extracellulari in vivo.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi alla base delle modifiche sinaptiche.
Metodi Utilizzati
- Lo studio ha utilizzato sezioni cerebrali ippocampali longitudinali e registrazioni in vivo.
- I topi sono stati anestetizzati con uretano per le procedure sperimentali.
- Gli elettrodi sono stati posizionati con attenzione utilizzando coordinate stereotassiche per raccogliere i dati.
- Sono stati impiegati protocolli di stimolazione ad alta e bassa frequenza per le registrazioni.
- I dati sono stati analizzati mediante software neurale per la valutazione delle forme d'onda e dei potenziali.
Risultati principali
- Sono stati registrati potenziali postsinaptici eccitatori evocati stabili.
- Lo studio ha convalidato i meccanismi dei cambiamenti sinaptici a lungo termine lungo l'asse longitudinale del CA1.
- Le registrazioni elettrofisiologiche indicano un'attività sinaptica significativa durante la stimolazione.
- Le curve input-output hanno dimostrato la capacità di diverse intensità di stimolo di produrre risposte sinaptiche potenziate.
Conclusioni
- Questa ricerca chiarisce la plasticità sinaptica longitudinale, finora poco esplorata, dei neuroni CA1.
- Le implicazioni riguardano la comprensione dei meccanismi neuronali apprendimento e memoria.
- I risultati potrebbero orientare futuri studi volti a indagare la dinamica e la plasticità sinaptica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La comprensione della plasticità sinaptica longitudinale nelle reti ippocampali CA1 fornisce informazioni meccanicistiche sul funzionamento dei circuiti neurali, rilevanti per la validazione di bersagli nel sistema nervoso centrale. Questo studio colma una lacuna nei modelli basati sulla lamina trasversale, caratterizzando le connessioni associative CA1-CA1 e supportando la riduzione del rischio nelle ipotesi relative ai processi cognitivi dipendenti dall'ippocampo. L'approccio elettrofisiologico bidirezionale consente la valutazione dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso in sistemi pertinenti alla patologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche che coinvolgono la circuitria ippocampale longitudinale e i meccanismi di plasticità dipendenti dai recettori NMDA.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale del bersaglio mediante letture elettrofisiologiche specifiche per strato e direzione in reti integre.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo stati di rete con capacità di LTP da stati con deficit di LTD in modelli preclinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara fette ippocampali longitudinali validate per misurazioni riproducibili di potenziali di campo extracellulari.
- Output quantitativo: Genera potenziali postsinaptici eccitatori evocati stabili, adatti alla profilazione dose-risposta e alla frequenza di stimolazione.
- Riutilizzo della piattaforma: La preparazione standardizzata delle fette e il posizionamento degli elettrodi permettono il confronto tra studi e il monitoraggio longitudinale dei dati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si allinea a domini cognitivi dipendenti dall'ippocampo nei modelli di malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative.
- Continuità meccanicistica: Collega i saggi di plasticità nella fase di scoperta alla validazione preclinica degli effetti sinaptici mediati dal bersaglio.
- Decisioni basate sul rischio: L'assenza di LTD nel CA1 interlaminare orienta la selezione dei biomarcatori e i criteri di avanzamento/cessazione nello screening dei modulatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo evidenze elettrofisiologiche di una modulazione sinaptica in un sottosistema ippocampale rilevante per la malattia.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sull'attivazione longitudinale della via CA1 e sulla dipendenza dai recettori NMDA mediante curve input-output e induzione del potenziamento a lungo termine (LTP).
- Screening: Fornisce letture standardizzate del potenziale di campo che consentono il confronto degli effetti dei composti lungo gli assi settale-temporale.
- Analisi: I risultati includono l'entità del LTP, le soglie di stimolazione e l'assenza di depotenziamento a lungo termine (LTD), parametri quantitativi per la valutazione della modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici attraverso la conservazione della microcircuitazione CA1 e della dipendenza dai recettori NMDA tra diverse specie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi longitudinale dell'ippocampo, estendendone l'applicazione oltre lo studio singolo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi risolvendo l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione longitudinale dell'ippocampo.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati e riproducibili per la registrazione in vivo e in vitro con criteri definiti per il posizionamento degli elettrodi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando reti competenti per la potenziamento a lungo termine (LTP) e riducendo i falsi negativi nei test mirati alla plasticità.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti in base a profili di plasticità bidirezionale in sistemi rilevanti per la malattia, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica, anatomia dell'ippocampo e interpretazione dei segnali elettrofisiologici.
- Si basa su sistemi di registrazione stabili, micromanipolatori e software in grado di generare curve input-output e indurre LTP/LTD.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo all'orientamento delle fette, ai parametri di stimolazione e alla durata della registrazione di base.
- L'adattamento ad altri modelli richiede la validazione dell'omologia longitudinale del CA1 e della conservazione delle connessioni associative.
- I limiti pratici includono la sensibilità tecnica all'angolo dell'elettrodo (30–60 gradi rispetto alla linea mediana) e al drenaggio del liquido cerebrospinale durante la preparazione in vivo.
