Un nuovo metodo di correzione Adenine Adenine nicotinamide per la misurazione intracellulare Ca2o con Fura-2-Analog nelle cellule vive
20 settembre 2019
A causa della sovrapposizione spettrale delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione degli analoghi NADH e fura-2, l'interferenza del segnale da entrambe le sostanze chimiche nelle cellule vive è inevitabile durante la misurazione quantitativa di [Ca2 ']. Così, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell'interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2 ].
Le sonde plurali eccitabili UV, hanno una contaminazione intrinseca del segnale, a causa dei suoni auto-plurali. La maggior parte del problema con il NADH, è limitare l'uso di una sonda plurale. Un metodo può essere usato, per correggere con precisione la florescenza esterna dal NADH, al fine di estrarre un vero segnale di sonda plurale incontaminato.
A dimostrare la procedura sarà Jeong Hoon Lee, il nostro assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver permesso ai miociti di depositarsi sul fondo del tubo, aspirare il supernatante. Etichettare le cellule con due millilitri di una soluzione diluizione millimolare fura-2-FFAM preparata al momento per 60 minuti a quattro gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti in posizione verticale prima di rimuovere il supernatante. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura a temperatura ambiente per lo stoccaggio a temperatura ambiente. Per l'identificazione isobestica in situ del punto fura-2-ffa montare le cellule diluite sullo stadio del microscopio e attendere tre minuti affinché le cellule sprofondno sul fondo.
Abbondante soluzione priva di NADH di 37 gradi Celsius priva di calcio nella coltura cellulare e individuare una cellula bersaglio. Abbondante soluzione di saponina per 60 secondi prima di riprosaciare con la soluzione priva di calcio senza NADH. Misurare contemporaneamente i segnali emessi da fura-2-ff a 450 e 500 nanometri, utilizzando una scansione di eccitazione da 350 a 365 nanometri con un passo di 0,1 nanometri e ri-profusi con una soluzione priva di calcio senza NADH.
Quindi sottrarre i segnali nella soluzione satura di calcio dai segnali nelle condizioni libere dal calcio. Quindi calcolare le deviazioni standard dell'emissione ad ogni eccitazione e selezionare la lunghezza d'onda di eccitazione che mostra i valori minimi di deviazione standard come singoli punti isobestici. Per utilizzare un sistema di misurazione multi-parametrico per rilevare il segnale di fondo e correggere il segnale all'interno dell'area cellulare, montare le cellule senza coloranti nel bagno del microscopio e consentire alle cellule di depositarsi per tre minuti.
Abbondante soluzione priva di calcio NADH nel bagno per circa cinque minuti a una velocità da due a tre millilitri al minuto e impostare il campo dell'oggetto per coprire la cellula mirata. Dopo aver spostare la cella fuori dal campo, misurare i segnali di fondo della finestra senza celle e impostare i segnali come offset. Quindi riportare la cella nella posizione iniziale e misurare i segnali di sfondo della cella e l'area della cella.
Per calcolare il fattore R utilizzare lo sfondo cellulare acquisito e i segnali di area prima di rimontare le cellule senza coloranti al microscopio e profuse con soluzione priva di calcio. Misurare i segnali come indicato prima di abbondante la sospensione cellulare con soluzione malato. Dopo aver misurato i segnali profuse le cellule con soluzione piruvata seguita da profusione con soluzione malato-piruvato e soluzione di rotenone.
Quindi calcolare la pendenza per ogni segnale. Qui vengono mostrati i cambiamenti nel calcio mitocondriale prima e dopo la correzione. I risultati rivelano chiaramente cambiamenti sostanziali nel calcio mitocondriale con una concentrazione di calcio a riposo mitocondriale senza calcio citosolico di 1,03 più o meno 0,13 micromolare e calcio mitocondriale massimo ad un micromolare di calcio di 29,6 più o meno 1,61 micromolare.
Il potenziale transmembrana mitocondriale è stato monitorato con una profusione di due nanomolari TMRE. La variazione del potenziale mitocondriale è stata calcolata sulla base di un presunto potenziale iniziale di membrana mitocondriale di meno 150 millivolt, dimostrando una diminuzione del NADH in risposta all'aggiunta di calcio, con un effetto negliabile sul potenziale della membrana mitocondriale. Il pH mitocondriale non è stato fatto dall'aumento del calcio mitocondriale indotto dal carico carbossi SNARF-1.
Punti isobestici errati ducono una correzione R e NADH errata. Quindi fai attenzione a misurare sempre correttamente lo sfondo e l'area cellulare senza cellule. Questa tecnica viene utilizzata per preparare studi dinamici mitocondriali sul calcio nelle fuoriuscite bioanalitiche.
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Panoramica
Questo studio affronta la sfida dell'interferenza del segnale da NADH e analoghi della fura-2 nella misurazione delle concentrazioni di calcio in cellule vive. È stato sviluppato un nuovo metodo di correzione in linea per migliorare l'accuratezza delle misurazioni di [Ca2+] in presenza di contaminazione del segnale da NADH.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Interferenza del segnale nelle misurazioni della fluorescenza
- Misurazione del calcio in cellule vive
- Sviluppo di tecniche di correzione
Sfondo
- L'ampio sovrapposizione spettrale tra le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione complica le misurazioni.
- L'NADH può limitare l'utilità di sonde multiple nella microscopia a fluorescenza.
- Misurazioni accurate della [Ca2+] sono fondamentali negli studi cellulari.
Metodi Utilizzati
- Misurazione della fluorescenza con fura-2
- Saggi cellulari con miociti
- Tecniche di correzione del segnale e misurazione del fondo
Risultati principali
- Modifiche significative nelle concentrazioni di calcio mitocondriale osservate.
- Sviluppato un approccio sistematico per correggere l'interferenza da NADH.
- Tecnica validata attraverso procedure sperimentali rigorose.
Conclusioni
- Lo studio dimostra con successo un metodo per migliorare l'accuratezza delle misurazioni della fluorescenza.
- Questo ha implicazioni per le analisi quantitative in biologia cellulare.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione accurata del calcio intracellulare è fondamentale per la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci, in particolare per le vie di segnalazione mitocondriali. L'autofluorescenza del NADH introduce un'interferenza significativa nei saggi basati sul fura-2, compromettendo l'affidabilità dei dati e aumentando i tassi di falsi positivi nei test iniziali. Questo metodo di correzione del NADH migliora l'affidabilità predittiva isolando i veri segnali di calcio, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nei programmi di bersaglio cardiovascolare e metabolico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del controllo del calcio mitocondriale come ipotesi terapeutica in modelli di malattia.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica separando l'autofluorescenza di NADH dai veri segnali di fura-2.
- Valore predittivo: Migliora la fiducia sul bersaglio attraverso misurazioni quantitative dei flussi di calcio prive di interferenze.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo una fluorescenza corretta per il NADH di base.
- Riproducibilità: Standardizza la selezione della lunghezza d'onda di eccitazione mediante la determinazione del punto isobestico, riducendo al minimo la variabilità tra saggi.
- Capacità di multiplexing: Consente la misurazione simultanea di NADH, calcio e pH o potenziale di membrana utilizzando diverse coppie di eccitazione/emissione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Direttamente applicabile ai modelli di disfunzione mitocondriale nei disturbi neurodegenerativi e metabolici.
- Continuità traslazionale: Collega le osservazioni della fase di scoperta sui flussi di calcio alla validazione preclinica mediante segnali corretti di fura-2-FF.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Permette decisioni più affidabili sul proseguimento o meno dello sviluppo riducendo i segnali falsi nei saggi del calcio mitocondriale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla validazione meccanicistica preclinica, specificamente per bersagli mitocondriali.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi isolando i segnali dipendenti dal calcio da interferenze metaboliche in saggi su cellule vive.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio attraverso la sottrazione del fondo e la correzione dell'offset, aumentando il rapporto segnale-rumore per la valutazione dei composti.
- Analisi: Consente misurazioni raziometriche quantitative mediante il calcolo del fattore R usando l'emissione corretta a 450 nm e 500 nm.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici tramite il monitoraggio simultaneo del calcio e del potenziale della membrana mitocondriale utilizzando TMRE.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un framework di correzione riutilizzabile applicabile a diversi tipi cellulari e sonde fluorescenti soggette a interferenze da NADH.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi eliminando i falsi positivi indotti dal NADH nella segnalazione del calcio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso l'identificazione sistematica del punto isobestico e la sottrazione del fondo.
- Valore strategico: Supporta decisioni più accurate di tipo go/no-go riducendo il rumore biologico nei flussi di screening delle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi mitocondriali grazie a letture funzionali affidabili e prive di interferenze.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e nella manipolazione di sonde raziometriche.
- Necessita di strumentazione in grado di effettuare la scansione delle lunghezze d'onda di eccitazione (350–365 nm) e la rilevazione a doppia emissione (450 nm, 500 nm).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la misurazione del segnale di fondo e per i protocolli di correzione delle deviazioni.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il metodo a diversi flussi operativi di preparazione delle cellule privi di coloranti.
- Dipende da una misurazione accurata del segnale di fondo in assenza di cellule e dell'area cellulare, per evitare una selezione errata del punto isobestico.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
