Name: Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 s
Description: Scopri il meccanismo di tossicità delle fibrille amiloidi a livello della membrana mitocondriale utilizzando mitocondri cerebrali di ratto come modello biologico in vitro per studiare malattie neurodegenerative.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio di ricerca dell'Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), s.r.l.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) di Scienze Mediche dell'Università di Teheran. Sono stati compiuti sforzi massimi per ridurre al minimo la sofferenza e gli effetti dannosi per i ratti affilando le lame della ghigliottina e applicando movimenti risoluti e rapidi della lama.
1. omogeneizzazione cerebrale e isolamento mitocondriale
NOTA: Tutti i reagenti per l'isolamento mitocondriale sono stati preparati secondo Sims e Anderson14.
<ol><li>Preparazione di buffer per l'isolamento mitocondriale<ol>
<li>Preparare una soluzione Tris-HCl da 100 mM: pesare 0,605 g di Tris-HCl e dissoluzione in circa 40 mL di acqua deionizzata (DW) in un becher. Trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 50 ml e aumentare il volume finale a 50 mL aggiungendo DW.</li>
		<li>Preparare una soluzione EDTA da 10 mM: pesare 0,202 g di EDTA e scioglierla in circa 40 mL di DW in un becher. Trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 50 ml e aumentare il volume finale a 50 mL aggiungendo DW. NOTA: Entrambe le soluzioni possono essere conservate a 4 gradi centigradi per almeno 4 settimane.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock Tris-HCl/EDTA/sucrose: aggiungere 30 mL di 100 mM Tris-HCl e 30 mL di 10 mM EDTA in un bicchiere. Pesare 32,86 g di saccarosio e aggiungerlo al becher mescolando con un agitatore magnetico. Quando il saccarosio viene disciolto, trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml e aumentare il volume finale a 100 mL aggiungendo DW. NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.</li>
		<li>Preparare un buffer di isolamento (IB): aggiungere 100 mL di tris-HCl/EDTA/sucrose a circa 150 mL di DW. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 0,1 M HCl. Aumentare il volume finale a 300 mL aggiungendo DW.</li>
		<li>Preparare il mezzo di pendenza a 15% (v/v) con IB aggiungendo 1,5 mL di mezzo gradiente di densità a 8,5 mL di IB freddo.</li>
		<li>Preparare 10 mg/mL di installazione di un albumina di siero bovino (BSA): pesare 20 mg di BSA senza acidi grassi e dissolverlo in circa 1,5 mL DW in una fiala da 2 mL. Aumentare il volume finale a 2 mL aggiungendo DW e conservarlo sul ghiaccio fino all'uso. NOTA: Preparare le soluzioni dai passi 1.1.4–1.1.6 il giorno dell'isolamento mitocondriale e conservarle sul ghiaccio fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento del cervello di ratto NOTA: La decapitazione e la rimozione del cervello di ratti maschi (150-200 g) sono state eseguite secondo Sims e Anderson14.<ol>
<li>Mettere un becher da 30 mL in un secchio di ghiaccio e aggiungere 10 mL di IB freddo al becher.</li>
		<li>Decapitare il ratto con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dal cranio entro 1 min di decapitazione per limitare il deterioramento delle proprietà mitocondriali.</li>
		<li>Trasferisci rapidamente il cervello al becher contenente IB freddo.</li>
	</ol></li>
	<li>Omogeneizzazione cerebrale e preparazione dei mitocondri NOTA: le frazioni mitocondriali sono state isolate in base al protocollo descritto da Sims e Anderson14, con alcune modifiche come descritto in precedenza15. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio per tutta la procedura.<ol>
<li>Lavare il tessuto 2x con 30 mL di IB, trasferire in un becher contenente Freddo IB, e tritare finemente il cervello con le forbici.</li>
		<li>Aggiungere 10 volumi di IB pre-raffreddato (circa 10 mL di IB per cervello di ratto).</li>
		<li>Trasferire la sospensione del tessuto a un omogeneizzatore Dounce freddo da 20 mL.</li>
		<li>Omogeneizzare i pezzi di tessuto utilizzando nove colpi su e giù con un pestello motorizzato. NOTA: Lasciare il composto sul ghiaccio per circa 30 s dopo ogni serie di tre tratti di omogeneizzazione per garantire che l'omogenea rimanga fredda.</li>
		<li>Trasferire l'omogeneità in un tubo di centrifuga di 10 mL pre-raffreddato e centrifugare a 1.300 x g e 4 gradi centigradi per 3 min.</li>
		<li>Decant accuratamente il supernatore e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-raffreddato da 10 mL e centrifugarlo a 21.000 g a 4 gradi centigradi per 10 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante e risospendere il pellet in una soluzione media a gradiente di densità fredda del 15% (5 mL per ogni cervello) mescolando delicatamente la miscela con una pipetta.</li>
		<li>Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 x g a 4 min per 5 min utilizzando un'accelerazione lenta (45 s da 0 rpm a 500 rpm seguita da un'accelerazione normale) e decelerazione (senza freni). Questo dovrebbe produrre due bande distinte di materiale (Figura 1A, a sinistra).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere la banda affilata di materiale accumulato nella parte superiore del gradiente, che contiene per lo più mielina. Quindi, rimuovere la soluzione media di pendenza densità sovrastante il materiale (nella banda 2) il più possibile senza perdere la frazione mitocondriale arricchita nella banda 2. NOTA: La banda 2 contiene sia i mitocondri sinaptici che quelli non sinaptici.</li>
		<li>Aggiungere 8 mL di IB alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente il composto con una pipetta.</li>
		<li>Centrifuga a 16.700 x g a 4 gradi centigradi per 10 min e rimuovere con cura il supernatante, lasciando indisturbato il pellet sciolto inferiore.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 10 mg/mL di bilogio grasso senza acidi BSA al tubo di centrifuga mentre mescolando delicatamente la miscela con la punta di una pipetta. Aumentare il volume finale a 5 mL per cervello aggiungendo IB.</li>
		<li>Centrifuga a 6.900x g a 4 gradi centigradi per 10 min, che dovrebbe produrre un pellet fermo (Figura 1A, destra).</li>
		<li>Decant il supernatante e resospendere delicatamente il pellet mitocondriale in IB, in loro aliquota 0,5 mL, e conservare in azoto liquido fino all'uso.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Determinazione della concentrazione proteica
NOTA: La concentrazione proteica viene misurata utilizzando il metodo di Lowry etal.
<ol><li>Preparazione di soluzioni per Lowry assay<ol>
<li>Preparare la soluzione A: pesare 0,4 g di NaOH e 2 g di Na2CO3 e sciogliere in 80 mL di DW, quindi trasferire la soluzione a un pallone volumetrico da 100 ml e aumentare il volume a 100 mL aggiungendo DW.</li>
		<li>Preparare la soluzione B: pesare 0,1 g di crostata di sodio di potassio e 0,05 g di CuSO4 e sciogliere in 8 mL di DW, quindi trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 10 ml e aumentare il volume a 10 mL aggiungendo DW. NOTA: Entrambe le soluzioni A e B possono rimanere stabili a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.</li>
		<li>Preparare la soluzione C: Aggiungere 0,5 mL di soluzione folina a 7,5 mL di DW. NOTA: Preparare la soluzione C fresco e tenere lontano dalla luce fino all'uso.</li>
		<li>Preparare gli standard BSA con concentrazioni finali di 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 g/mL combinando rispettivamente 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 , luna di 1 mg/mL BSA, con abbastanza DW per fare 1000 L di soluzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurazione della concentrazione proteica NOTA: per una maggiore precisione, eseguire questo passaggio in triplice copia.<ol>
<li>Aggiungete 50 l di soluzioni standard e l'omogenea mitocondriale ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozze, seguita dall'aggiunta di 45 l di soluzione A. Quindi, incubare la piastra per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 50 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere 5 - L della soluzione B e incubare la piastra per 10 min al buio a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Aggiungere 150 l di soluzione C e incubare la piastra per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 50 gradi centigradi.</li>
		<li>Caricare la piastra in un lettore di piastre e registrare i valori di assorbimento per gli standard e le sospensioni mitocondriali a 650 nm. Quindi, utilizzando una curva di calibrazione, calcolare il contenuto proteico dei mitocondri.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Determinazione dell'integrità della membrana mitocondriale
NOTA: L'integrità della membrana mitocondriale è confermata misurando l'attività di dehydrogenasi di malata (MDH) nei mitocondri isolati prima e dopo la rottura della membrana da parte del Triton X-100.
<ol><li>Diluire l'omogeneità mitocondriale a 1 mg/mL con IB freddo e collocato in due tubi da 1,5 mL (tipicamente 195 -L di mitocondri per tubo).</li>
	<li>Aggiungere 5 -L di 20% (v/v) Triton X-100 (diluito con DW) a un tubo (come controllo positivo per la massima attività enzimatica) e 5 -L di DW a un altro tubo (per il controllo) seguito dalla miscelazione con un agitatore.</li>
	<li>Incubare i tubi per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 30 gradi centigradi.</li>
	<li>I mitocondri di Pellet per centrifugazione dei tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Raccogliere attentamente i supernatanti risultanti per aver analizzato l'attività di MDH mitocondriale utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella sezione seguente.</li>
	<li>Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ01v4.jpg">
</li>
</ol>4. Determinazione dell'attività MDH
NOTA: L'attività MDH è stata misurata in modo spettrofotometrico come descritto da Sottocasa etal.
<ol><li>Preparazione di soluzioni per il saggio di attività MDH<ol>
<li>Preparare una soluzione Tris-HCl da 50 mM (pH - 7,5): preparare una soluzione da 7,9 mg/mL in DW utilizzando Tris-HCl e regolare il pH a 7,5 a 25 gradi centigradi con 1,0 M NaOH.</li>
		<li>Preparare una soluzione oxaloacetate da 50 mM: preparare una soluzione da 6,6 mg/mL utilizzando l'oxaloacetate in Tris-HCl. NOTA: questa soluzione non è stabile una volta nella soluzione e deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 10 mM: preparare una soluzione da 7,81 mg/mL utilizzando il sistema di</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione dell'attività MDH NOTA: le concentrazioni finali di analisi in una miscela di reazione di 1,0 mL sono 50 mM Tris-HCl, 5 mM di oxaloacetate e 0,1 mM-NADH.<ol>
<li>Impostare lo spettrofotometro su 25 e 340 nm. Pipetta 890 - Buffer Tris-HCl L, 100 -L di soluzione oxaloacetate e 10 l di soluzione NADH per una cuvette vuota e 880L Buffer Tris-HCl, 100 - L di soluzione oxaloacetate, e 10 L di soluzione NADH in una cuvette campione.
</li>
		<li>Incuba le cuvette nello spettrometro per 3-4 min e fai riferimento a i vuoti.</li>
		<li>Quindi aggiungere 10 l di omogeneami mitocondriale (1 mg/mL) alla cuvette del campione, mescolare immediatamente per inversione, e registrare le diminuzioni di assorbimento dovute all'ossidazione NADH a 340 nm per 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. In vitro- sinucleina, insulina bovina, e formazione di fibrille HEWL
<ol><li>Preparazione delle proteine<ol>
<li>- sinucleina: NOTA: L'espressione e la purificazione della sintebina ricombinante viene eseguita come descritto da Hoyer et al.18 con alcune modifiche, e la purezza della sintassi a synucleina è confermata da SDS-PAGE.<ol>
<li>Dialyze purificato durante la notte contro la salina con buffer fosfato (PBS).</li>
			<li>Determinare la concentrazione proteica utilizzando un coefficiente di estinzione di 5600 M-1 cm-1 a 275 nm19.</li>
			<li>Proteine aliquote in tubi da 1,5 mL e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Insulina bovina e HEWL:<ol>
<li>Fornire insulina bovina e HEWL.</li>
			<li>Sciogliere ogni proteina in un buffer di glicina da 50 mM (pH - 1,6; regolare il pH con HCl).</li>
			<li>Determinare la concentrazione di insulina bovina e HEWL utilizzando un coefficiente di estinzione di 1,0 e 2,63 per 1,0 mg/mL a 276 nm e 280 nm, rispettivamente20,21.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Induzione fibrillazione amiloide<ol>
<li>Preparazione di soluzioni per la fibrillazione amiloide:<ol>
<li>Preparare il buffer t.t. tramite thioflavin T (ThT): pesare 0,3 g di NaH2PO4 e scioglierlo in 80 mL di DW, regolare il pH a 6,5 e aumentare il volume a 100 mL aggiungendo DW.</li>
			<li>Preparare la soluzione di stock ThT (5 mM): pesare 1,6 mg di ThT e scioglierlo in 1 mL di tampone ThT, passare attraverso una carta da filtro da 0,22 m e tenere lontano dalla luce a 4 gradi centigradi fino all'uso. NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane.</li>
			<li>Preparare la soluzione ThT (1 mM): aggiungere 200 -L di soluzione di supporto ThT (5 mM) a 800 -L di buffer ThT. NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Formazione di fibrilla amiloidi in vitro:<ol>
<li>Aggiungere l'aliquota della soluzione proteica (200 m) e di 6 -L di soluzione ThT (1 mM) a 1,5 mL, seguita da agitazione.</li>
			<li>Incubare i tubi in un termomixer a 37 gradi sotto agitazione costante a 800 giri/min per 4 giorni.</li>
			<li>Prendere le aliquote (10 gradi centigradi) di campioni incubati dopo intervalli di tempo regolari e aggiungere 490 l di tampone ThT, mescolato accuratamente, e incubare per 5 min a RT.</li>
			<li>Impostare le larghezze di slit di eccitazione ed emissione rispettivamente su 5 e 10 nm e misurare la fluorescenza ThT per eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm utilizzando uno spettrometro a fluorescenza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Formazione di fibrilla di insulina amiloide in vitro:<ol>
<li>Aggiungete 637 ldi di soluzione proteica (250 m) a tubo da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 13 l di soluzione ThT (1 mM) seguita da agitazione.</li>
			<li>Aggiungete le aliquote (200) di soluzione proteica (250 m) contenenti 20 M ThT ad ogni pozzo di una piastra trasparente di 96 pozzetti e sigillate la piastra con nastro di saltellazione cristallino.</li>
			<li>Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e incubare a 57 gradi centigradi senza agitazione.</li>
			<li>Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti, con eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm, per 12 h. NOTA: Agitare la piastra per 5 s prima di ogni misurazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Formazione di fibrilla amiloide IN vitro HEWL:<ol>
<li>Aggiungere le aliquote (200) della soluzione proteica )1 mM) contenenti 20 M ThT ad ogni pozzo di una piastra trasparente 96 e sigillare la piastra con nastro di salazione cristallino.</li>
			<li>Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e incubare a 57 gradi centigradi senza agitazione.</li>
			<li>Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 2 h, con eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm, per 4 giorni. NOTA: per tutte e tre le proteine, la formazione di fibrille amiloide è confermata dalla microscopia a forza atomica (Figura 2B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Trattamento dei mitocondri con fibrille amiloidi, analisi del rilascio MDH e misurazione ROS
<ol><li>Incubazione di mitocondri isolati con fibrille amiloidi<ol>
<li>Accendere la centrifuga e il bagno d'acqua calda e impostare rispettivamente a 4 e 30 gradi centigradi.</li>
		<li>Utilizzando IF, diluire l'omogeneami a una concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
		<li>Preparare due serie di tubi da 1,5 mL contenenti omogenei mitocondriali (una per l'analisi del rilascio MDH e un'altra per la misurazione del ROS mitocondriale).</li>
		<li>Aggiungere le fibrille fresche o amiloidi di sintetali, insulina bovina o HEWL (a concentrazioni finali di 5 M, 10 M, 20 M e 25 M; utilizzare il buffer PBS o glicina come controllo) per mitocondriale homogenate (volume finale di 200 gradi) (cfr. tabella 1, tabella 2) , e Tabella 3) seguiti da una delicata smuovere delicatamente la soluzione con una pipetta. NOTA: per il test di rilascio MDH, utilizzare Triton X-100 (a una concentrazione finale dello 0,5% [v/v]) come controllo positivo per il massimo rilascio dell'enzima.</li>
		<li>Tubi di incubatura contenenti sospensioni mitocondriali per 30 min in bagno d'acqua calda impostato a 30 gradi centigradi.</li>
		<li>Misurare la versione MDH mitocondriale e il contenuto ROS come descritto nelle sezioni 6.2 e 6.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assaggio di assaggio di rilascio MDH mitocondriale<ol>
<li>Centrifugare gli omogenati mitocondriali incubati a 16.000 x g per 15 min, quindi raccogliere con attenzione i supernatanti risultanti per annotare l'attività di MDH mitocondriale come descritto nella sezione 4.</li>
		<li>Calcolare il rilascio di MDH come frazione dell'effetto massimo (Triton X-100) come segue:</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ02v4.jpg">
<ol start="3"><li>Misurazione ROS mitocondriale NOTA: Il contenuto di ROS mitocondriale è determinato con il precursore fluorogenico sensibile all'ossidazione dihydrodichlorocarboxyfluorescein diacetate (DCFDA)22.<ol>
<li>Preparare soluzioni per la misurazione mitocondriale del ROS. Preparare una soluzione DCFDA da 50 M sciogliendosi nel metanolo (preparare fresco) e una soluzione succinata da 200 mM sciogliendosi in DW.</li>
		<li>Pipetta 191 - L di omogmina mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozze e aggiungere 4 M DCFDA (1 m di concentrazione finale) e 5 di 200 mM di succinazione (5 mM di concentrazione finale).</li>
		<li>Incubare la piastra per 30 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 30 gradi centigradi mescolando delicatamente.</li>
		<li>Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e misurare l'intensità della fluorescenza, con eccitazione a 485 nm ed emissione a 530 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analisi statistica
<ol><li>Eseguire tutti gli esperimenti almeno 2x o 3x con saggi triplicati e condurre test statistici appropriati. In questo caso, i risultati sono presentati come media : SD, e un test taccoppiato di Student è stato utilizzato per calcolare la significatività statistica. I valori P inferiori a 0,01 e 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi (Sezione &lt; 0,05; .p &lt; 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li>
<li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modeling+amyloid+disease+in+Drosophila+melanogaster%2C+Link%C3%B6ping+Studies+in+Science+and+Technology++No.+1320%22">Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320</a>. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).</li>
<li>Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKagan%2C+BL+%22Protein+Misfolding%2C+Aggregation%2C+and+Conformational+Diseases%22">Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases</a>. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).</li>
<li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li>
<li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li>
<li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer%27s+disease%3A+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li>
<li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+alterations+in+Parkinson%27s+disease%3A+new+clues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li>
<li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+%CE%B2-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li>
<li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+import+and+accumulation+of+%CE%B1-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li>
<li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li>
<li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+peptide+channels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li>
<li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease%3A+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291(2002).</li>
<li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li>
<li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+A%CE%B2+%2825-35%29+Fibrillation+Products+with+Mitochondria%3A+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li>
<li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li>
<li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NACP%2C+a+protein+implicated+in+Alzheimer%27s+disease+and+learning%2C+is+natively+unfolded%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li>
<li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li>
<li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li>
<li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria%3A+studies+using+myxothiazol%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li>
<li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity%3A+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li>
<li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation%2C+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li>
<li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li>
<li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li>
<li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+%CE%B1-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li>
<li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins%3A+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li>
<li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles%3A+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li>
<li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li>
<li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li>
<li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li>
<li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+import+and+accumulation+of+%CE%B1-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li>
<li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%CE%B1-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson%27s+disease-role+of+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li>
<li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+%CE%B2-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li>
<li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li>
<li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una ricchezza di risultati sperimentali supporta l'ipotesi che la citotossicità degli aggregati fibrillare sia significativamente associata alla loro capacità di interagire con le membrane biologiche4,5. Tuttavia, la maggior parte dei dati si basa su bistrati lipidici artificiali che non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, che sono strutture eterogenee con un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine. Qui, usando i mitocon...

I disturbi correlati all'amiloide, noti come amiloidosi, costituiscono un grande gruppo di malattie definite dalla comparsa di depositi di proteine insolubili in diversi tessuti e organi1,2. Tra questi, i disturbi neurodegenerativi sono le forme più frequentemente in cui gli aggregati proteici compaiono nel sistema nervoso centrale o periferico2. Sebbene siano stati proposti diversi meccanismi coinvolti nella tossicità degli aggregati amiloidi3, un corpo crescente di prove indica l'interruzione della membrana cellulare e la permeabilizzazione come meccanismo primario della patologia amiloide4, 5. Oltre alla membrana plasmatica, possono essere colpiti anche organelli interni (cioè mitocondri).
È interessante notare che le evidenze emergenti suggeriscono che la disfunzione mitocondriale svolge un ruolo critico nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi, tra cui il morbo di Alzheimer e Parkinson6,7. In conformità con questo problema, numerose relazioni hanno indicato il legame e l'accumulo di proteine amiloidi di amiloide, di SOD1 mutanti amiloidi, di sinucleina, huntingtina e di SOD1 mutanti legati alla SLA alle proteine dei mitocondri8,9,10, 11.Si ritiene che il meccanismo della permeabilizzazione della membrana mediante aggregati amiloidi avvenga attraverso la formazione di canali discreti (pori) e/o attraverso un meccanismo non specifico simile al detergente5,12, 13. È interessante notare che la maggior parte di queste conclusioni si sono basate su relazioni che coinvolgono sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che mirano direttamente agli eventi che si verificano nelle membrane biologiche sono rari. Chiaramente, questi bistrati lipidi artificiali non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, comprese quelle dei mitocondri, che sono strutture eterogenee e composte da un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine.
Nel presente studio, i mitocondri isolati dal cervello del ratto sono utilizzati come modello biologico in vitro per esaminare gli effetti distruttivi delle fibrille amiloidi derivanti da omologia strutturale significativa con insulina umana coinvolta nell'amiloidosi imdovelva-localizzata) e lisozima bianco d'uovo di gallina (HEWL; come proteina modello comune per lo studio dell'aggregazione di amiloide). Le interazioni e i possibili danni delle membrane mitocondriali indotte dalle fibrille amiloidi vengono quindi studiati osservando il rilascio di dihydrogenasi di malata malato mitocondriale (MDH) (situato nella matrice mitocondriale) e ossigeno reattivo mitocondriale (ROS).

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diclorodiidrofluoresceina diacetato</td><td>Sigma</td><td>35845</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Merck</td><td>1012171000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra nera a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra nera a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina bovina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA essenzialmente privo di acidi grassi</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante cristallino</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>Sacca per dialisi (tagliata 2 KDa)</td><td>Sigma</td><td>D2272</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td> <td>a dilagaPotter Elvehjem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre a fluorescenza</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a fluorescenza</td><td>Cary Eclipse VARIAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folin</td><td>Merck</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Ghigliottina</td><td>Made in Iran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima dell'albume d'uovo di gallina (HEWL)</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Ossalacetato</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>CS0030</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Tartrato di potassio e sodio</td><td>Sigma</td><td>217255</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro analitico</td><td>jena</td><td>SPEKOL 2000 modello</td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck</td><td>1076871000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Merck</td><td>1082191000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>QUELAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>QUELAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr></tbody></table>

interazioni con e membrana permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di amyloid fibrils

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Un numero crescente di prove indica che la permeabilizzazione della membrana, comprese le membrane interne come i mitocondri, è una caratteristica comune e un meccanismo primario della tossicità indotta dall'aggregazione amiloide nelle malattie neurodegenerative. Tuttavia, la maggior parte dei rapporti che descrivono i meccanismi di interruzione della membrana si basano su sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che si rivolgono direttamente agli eventi che si verificano a livello di membrane biologiche sono rari. Descritto qui è un modello per studiare i meccanismi di tossicità amiloide a livello di membrana. Per l'isolamento mitocondriale, il mezzo di pendenza di densità viene utilizzato per ottenere preparati con contaminazione da mielina minima. Dopo la conferma dell'integrità della membrana mitocondriale, viene studiata l'interazione delle fibrille amiloidi derivanti da z-sinucleina, insulina bovina e lisozomina dell'uovo di gallina (HEWL) con mitocondri cerebrali, come modello biologico in vitro. I risultati dimostrano che il trattamento dei mitocondri cerebrali con gruppi di fibrillari può causare diversi gradi di permeabilizzazione della membrana e miglioramento del contenuto ROS. Ciò indica interazioni dipendenti dalla struttura tra fibrille amiloidi e membrana mitocondriale. Si suggerisce che le proprietà biofisiche delle fibrille amiloidi e il loro legame specifico alle membrane mitocondriali possono fornire spiegazioni per alcune di queste osservazioni.

Il protocollo descrive un modello per studiare le interazioni della fibrilla amiloide con i mitocondri cerebrali di ratto come modello biologico in vitro. Per la preparazione mitocondriale, 15% (v/v) grado di gradiente di densità è stato utilizzato per rimuovere la mielina come contaminazione principale del tessuto cerebrale14. Come mostrato nella Figura 1A, la centrifugazione a 30.700 x g ha prodotto due bande distinte di materiale, la mielina <span style="f...

Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In questo video, descriviamo uno studio modello per il meccanismo della tossicità amiloide a livello di membrana usando i mitocondri cerebrali del ratto come modello biologico in vitro. Nonostante accumuli un rapporto che descrive il meccanismo delle perturbazioni della membrana per aggregato amiloide in sistemi modello fosfolipidi studiati direttamente mirati agli eventi che iniziano a sviluppare membrana biologica. Nel presente video, descriviamo fibrille amiloide di alfa-sinuleina analizzando la membrana mitocondriale cerebrale del ratto come un modello biologico in vitro.Crediamo che i mitocondri come organelli con membrane ben caratterizzate possano fornire un sistema di modelli biologici estremamente utile per studi molecolari relativi al meccanismo della citotossicità amiloide a livello di membrana relativa alle malattie neurodegenerative. Decapitare il topo con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dalla scala entro un minuto dalla decapitazione del ratto per limitare il possibile deterioramento delle proprietà mitocondriali. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio durante tutta la procedura.Lavare il tessuto due volte con 30 millilitri di tampone di isolamento. Trasferire in un becher contenente tampone di isolamento freddo e tritare finemente il cervello con le forbici. Trasferire la sospensione del tessuto in un omogeneizzatore a dounce freddo da 20 millilitri.Omogeneizzare i pezzi di tessuto usando nove tratti su e giù con un pestello motorizzato. Lasciare la miscela sul ghiaccio per circa 30 secondi dopo ogni set di tre colpi di omogeneizzazione per assicurarsi che l'omogeneato rimanga freddo. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga pre-refrigerato e centrifugare a 1.300 G a quattro centigradi per tre minuti.Decantare con cura il supernatante e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-refrigerato. Centrifuga a 21.000 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un mezzo gradiente di densità mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 G a quattro centigradi per cinque minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere l'estremità affilata del materiale accumulato nella parte superiore, che per lo più contiene mielina. Aggiungere otto tamponi di isolamento millilitro alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.Centrifuga a 16.700 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante, lasciando il pellet sciolto inferiore indisturbato. Aggiungere un millilitro 10 milligrammo per BSA privo di acidi grassi millilitro al tubo di centrifuga mentre si mescola delicatamente la miscela con la punta della pipetta.Impostare il volume a cinque millilitri aggiungendo il buffer di isolamento. Centrifuga a 6.900 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Questo dovrebbe produrre un pellet solido.Decantare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet mitocondriale in tampone di isolamento. Diluire l'omogeneato mitocondriale a un milligrammo per millilitro con tampone di isolamento a freddo e posizionare in due tubi da 1,5 millilitri, tipicamente 195 microlitri di mitocondri per tubo. Aggiungere cinque microliter 20% volume per volume Triton X-100 a un tubo come controllo positivo per la massima attività enzimatica e cinque microliter acqua deionizzata ad un altro tubo per il controllo, seguito dalla miscelazione con un agitatore.Incubare i tubi per 10 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi. Mitocondri a pellet per centrifugazione di tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 G quattro centigradi per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernatanti risultanti per valutare l'attività della malato mitocondriale deidrogenasi utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella parte successiva.Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue. Per la determinazione dell'attività della deidrogenasi malato, pipetta 890 e 880 microliter 50 millimolare tampone Tris-HCL rispettivamente a cuvette vuote e campione seguite da 100 microlitri 50 millimolare ossaloacetato e 10 microlitri di beta-NADH millimolare. Mettere le cuvette in uno spettrofotometro e fare riferimento a vuoto.Aggiungere 10 microlitri mitocondriali omogeneati di un milligrammo per millilitro per assaggiare la cuvetta. Mescolare immediatamente per inversione. Diminuzione record dell'assorbanza dovuta all'ossidazione del NADH a 340 nanometri per un minuto.Per la fibrillazione amiloide alfa-sinucleina, aggiungere 294 microlitri di soluzione proteica, 200 micromolari a ciascun tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere sei microlitri ThT soluzione un millimolare. Mescolare le soluzioni e incubare i tubi in un termomixer a 37 centigradi sotto agitazione costante a 800 giri/min.Per la fibrillazione amiloide dell'insulina bovina, aggiungere 637 microlitri di soluzione proteica, da 250 micromolari a 1,5 millilitri tubo. Quindi aggiungere 13 microlitri Soluzione ThT un millimolare seguito da agitazione. Aggiungere aliquote 200 microliter di soluzioni proteiche ad ogni pozzo di una piastra chiara inferiore di 96 pozzetti.Sigillare la piastra con nastro adesivo cristallino. Caricare la piastra nel lettore di lastre di fluorescenza Cytation 5. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti per 12 ore.Utilizzare l'eccitazione a 440 nanometri e l'emissione a 485 nanometri. Selezionare i pozzi. Agitare la piastra per cinque secondi prima di ogni misurazione.Impostare la temperatura a 57 Centigradi senza agitazione. Preparare due serie di tubi da 1,5 millilitri contenenti omogeneati mitocondriali, una serie per il saggio di rilascio MDH e l'altra per la misurazione del ROS mitocondriale. Aggiungere aliquote di fibrille fresche o amiloidi di alfa-sinuleina, insulina bovina o lisozima di uova di gallina all'omogeneato mitocondriale seguito da pipettazione delicata.Incubare tubi contenenti sospensioni mitocondriali per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 Centigradi. Per il saggio di rilascio della malato deidrogenasi, la centrifuga ha incubato omogeneati mitocondriali a 16.000 G per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernaganti risultanti per saggiare l'attività dell'MDH mitocondriale come descritto nella sezione del protocollo parte quarta.Calcolare il rilascio di MDH come segue. Per la misurazione mitocondriale del ROS, pipetta 191 microliter di omogeneato mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetto. Aggiungere quattro microliter di 50 micromolare DCFDA.Quindi aggiungere cinque microlitri di succinato da 200 millimolare. Incubare il piatto per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi mescolando delicatamente. Caricare la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza Cytation 5 e misurare l'intensità della fluorescenza in base alla sezione del protocollo.L'integrità della membrana mitocondriale è stata valutata misurando l'attività dell'MDH nei mitocondri isolati prima e dopo l'interruzione della membrana e il rilascio enzimatico da parte di Triton X-100. Come vedete, in genere abbiamo scoperto che i preparati mitocondriali sono intatti per circa il 93%. Il test di fluorescenza ThT è stato effettuato per monitorare la crescita delle fibrille amiloide.La curva per la fibrillazione amiloide di tre proteine ha mostrato un tipico modello sigmoidale, raggiungendo un plateau a circa 96, 12 e 96 ore rispettivamente per alfa-sinucleina, insulina bovina e lisozima dell'albume di gallina, suggerendo la formazione di fibrille amiloide che è stata più confermata dalla misurazione AFM. La possibile permeabilizzazione e il danno della membrana mitocondriale da parte delle fibrille amiloide sono stati studiati con il rilascio di MDH mitocondriale e misurazione del ROS mitocondriale. Come vedete nel grafico sinistro, è stato osservato un rilascio sostanziale di MDH dopo l'aggiunta delle fibrille amiloide alfa-sinuleina ai mitocondri.Mentre un leggero rilascio è stato rilevato dalle fibrille di insulina, le fibrille di lisozima dell'uovo di gallina sono state trovate inefficaci. Il grafico a destra mostra l'effetto delle fibrille amiloidi sul contenuto di ROS mitocondriale. Mentre non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel ROS mitocondriale dopo l'aggiunta di lisozima di uova di gallina o fibrille amiloide di insulina, il trattamento con fibrille alfa-sinuleina ha portato a un notevole aumento del contenuto di ROS nei mitocondri cerebrali.Il presente video descrive uno studio modello per il meccanismo della citotossicità aggregata della fibula a livello di membrana, dimostrando come le fibrille amiloide derivanti da varie proteine possano causare diversi gradi di danno alla membrana e permeabilizzazione. Mentre alcuni argomenti delle fibrille amiloide e della loro specifica membrana legante sembrano fornire la capacità di interagire e causare destabilizzazione e successive perturbazioni delle membrane. Dopo questo video, sarai in grado di indagare l'interazione di forma nativa, fibrillari pre-fibrillari e amiloidi maturi di diversi peptidi e con mitocondri isolati da diversi tessuti o varie aree del cervello.

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