Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils
28 settembre 2019
Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.
In questo video, descriviamo uno studio modello per il meccanismo della tossicità amiloide a livello di membrana usando i mitocondri cerebrali del ratto come modello biologico in vitro. Nonostante accumuli un rapporto che descrive il meccanismo delle perturbazioni della membrana per aggregato amiloide in sistemi modello fosfolipidi studiati direttamente mirati agli eventi che iniziano a sviluppare membrana biologica. Nel presente video, descriviamo fibrille amiloide di alfa-sinuleina analizzando la membrana mitocondriale cerebrale del ratto come un modello biologico in vitro.
Crediamo che i mitocondri come organelli con membrane ben caratterizzate possano fornire un sistema di modelli biologici estremamente utile per studi molecolari relativi al meccanismo della citotossicità amiloide a livello di membrana relativa alle malattie neurodegenerative. Decapitare il topo con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dalla scala entro un minuto dalla decapitazione del ratto per limitare il possibile deterioramento delle proprietà mitocondriali. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio durante tutta la procedura.
Lavare il tessuto due volte con 30 millilitri di tampone di isolamento. Trasferire in un becher contenente tampone di isolamento freddo e tritare finemente il cervello con le forbici. Trasferire la sospensione del tessuto in un omogeneizzatore a dounce freddo da 20 millilitri.
Omogeneizzare i pezzi di tessuto usando nove tratti su e giù con un pestello motorizzato. Lasciare la miscela sul ghiaccio per circa 30 secondi dopo ogni set di tre colpi di omogeneizzazione per assicurarsi che l'omogeneato rimanga freddo. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga pre-refrigerato e centrifugare a 1.300 G a quattro centigradi per tre minuti.
Decantare con cura il supernatante e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-refrigerato. Centrifuga a 21.000 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un mezzo gradiente di densità mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.
Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 G a quattro centigradi per cinque minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere l'estremità affilata del materiale accumulato nella parte superiore, che per lo più contiene mielina. Aggiungere otto tamponi di isolamento millilitro alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.
Centrifuga a 16.700 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante, lasciando il pellet sciolto inferiore indisturbato. Aggiungere un millilitro 10 milligrammo per BSA privo di acidi grassi millilitro al tubo di centrifuga mentre si mescola delicatamente la miscela con la punta della pipetta.
Impostare il volume a cinque millilitri aggiungendo il buffer di isolamento. Centrifuga a 6.900 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Questo dovrebbe produrre un pellet solido.
Decantare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet mitocondriale in tampone di isolamento. Diluire l'omogeneato mitocondriale a un milligrammo per millilitro con tampone di isolamento a freddo e posizionare in due tubi da 1,5 millilitri, tipicamente 195 microlitri di mitocondri per tubo. Aggiungere cinque microliter 20% volume per volume Triton X-100 a un tubo come controllo positivo per la massima attività enzimatica e cinque microliter acqua deionizzata ad un altro tubo per il controllo, seguito dalla miscelazione con un agitatore.
Incubare i tubi per 10 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi. Mitocondri a pellet per centrifugazione di tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 G quattro centigradi per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernatanti risultanti per valutare l'attività della malato mitocondriale deidrogenasi utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella parte successiva.
Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue. Per la determinazione dell'attività della deidrogenasi malato, pipetta 890 e 880 microliter 50 millimolare tampone Tris-HCL rispettivamente a cuvette vuote e campione seguite da 100 microlitri 50 millimolare ossaloacetato e 10 microlitri di beta-NADH millimolare. Mettere le cuvette in uno spettrofotometro e fare riferimento a vuoto.
Aggiungere 10 microlitri mitocondriali omogeneati di un milligrammo per millilitro per assaggiare la cuvetta. Mescolare immediatamente per inversione. Diminuzione record dell'assorbanza dovuta all'ossidazione del NADH a 340 nanometri per un minuto.
Per la fibrillazione amiloide alfa-sinucleina, aggiungere 294 microlitri di soluzione proteica, 200 micromolari a ciascun tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere sei microlitri ThT soluzione un millimolare. Mescolare le soluzioni e incubare i tubi in un termomixer a 37 centigradi sotto agitazione costante a 800 giri/min.
Per la fibrillazione amiloide dell'insulina bovina, aggiungere 637 microlitri di soluzione proteica, da 250 micromolari a 1,5 millilitri tubo. Quindi aggiungere 13 microlitri Soluzione ThT un millimolare seguito da agitazione. Aggiungere aliquote 200 microliter di soluzioni proteiche ad ogni pozzo di una piastra chiara inferiore di 96 pozzetti.
Sigillare la piastra con nastro adesivo cristallino. Caricare la piastra nel lettore di lastre di fluorescenza Cytation 5. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti per 12 ore.
Utilizzare l'eccitazione a 440 nanometri e l'emissione a 485 nanometri. Selezionare i pozzi. Agitare la piastra per cinque secondi prima di ogni misurazione.
Impostare la temperatura a 57 Centigradi senza agitazione. Preparare due serie di tubi da 1,5 millilitri contenenti omogeneati mitocondriali, una serie per il saggio di rilascio MDH e l'altra per la misurazione del ROS mitocondriale. Aggiungere aliquote di fibrille fresche o amiloidi di alfa-sinuleina, insulina bovina o lisozima di uova di gallina all'omogeneato mitocondriale seguito da pipettazione delicata.
Incubare tubi contenenti sospensioni mitocondriali per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 Centigradi. Per il saggio di rilascio della malato deidrogenasi, la centrifuga ha incubato omogeneati mitocondriali a 16.000 G per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernaganti risultanti per saggiare l'attività dell'MDH mitocondriale come descritto nella sezione del protocollo parte quarta.
Calcolare il rilascio di MDH come segue. Per la misurazione mitocondriale del ROS, pipetta 191 microliter di omogeneato mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetto. Aggiungere quattro microliter di 50 micromolare DCFDA.
Quindi aggiungere cinque microlitri di succinato da 200 millimolare. Incubare il piatto per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi mescolando delicatamente. Caricare la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza Cytation 5 e misurare l'intensità della fluorescenza in base alla sezione del protocollo.
L'integrità della membrana mitocondriale è stata valutata misurando l'attività dell'MDH nei mitocondri isolati prima e dopo l'interruzione della membrana e il rilascio enzimatico da parte di Triton X-100. Come vedete, in genere abbiamo scoperto che i preparati mitocondriali sono intatti per circa il 93%. Il test di fluorescenza ThT è stato effettuato per monitorare la crescita delle fibrille amiloide.
La curva per la fibrillazione amiloide di tre proteine ha mostrato un tipico modello sigmoidale, raggiungendo un plateau a circa 96, 12 e 96 ore rispettivamente per alfa-sinucleina, insulina bovina e lisozima dell'albume di gallina, suggerendo la formazione di fibrille amiloide che è stata più confermata dalla misurazione AFM. La possibile permeabilizzazione e il danno della membrana mitocondriale da parte delle fibrille amiloide sono stati studiati con il rilascio di MDH mitocondriale e misurazione del ROS mitocondriale. Come vedete nel grafico sinistro, è stato osservato un rilascio sostanziale di MDH dopo l'aggiunta delle fibrille amiloide alfa-sinuleina ai mitocondri.
Mentre un leggero rilascio è stato rilevato dalle fibrille di insulina, le fibrille di lisozima dell'uovo di gallina sono state trovate inefficaci. Il grafico a destra mostra l'effetto delle fibrille amiloidi sul contenuto di ROS mitocondriale. Mentre non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel ROS mitocondriale dopo l'aggiunta di lisozima di uova di gallina o fibrille amiloide di insulina, il trattamento con fibrille alfa-sinuleina ha portato a un notevole aumento del contenuto di ROS nei mitocondri cerebrali.
Il presente video descrive uno studio modello per il meccanismo della citotossicità aggregata della fibula a livello di membrana, dimostrando come le fibrille amiloide derivanti da varie proteine possano causare diversi gradi di danno alla membrana e permeabilizzazione. Mentre alcuni argomenti delle fibrille amiloide e della loro specifica membrana legante sembrano fornire la capacità di interagire e causare destabilizzazione e successive perturbazioni delle membrane. Dopo questo video, sarai in grado di indagare l'interazione di forma nativa, fibrillari pre-fibrillari e amiloidi maturi di diversi peptidi e con mitocondri isolati da diversi tessuti o varie aree del cervello.
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Panoramica
Questo protocollo analizza le interazioni tra fibrille amiloidi e mitocondri isolati da diversi tessuti cerebrali. Si concentra sul meccanismo della tossicità amiloide a livello della membrana, utilizzando mitocondri cerebrali di ratto come modello in vitro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Malattie neurodegenerative
Sfondo
- Si sa che gli aggregati amiloidi alterano le membrane biologiche.
- Comprendere la loro interazione con i mitocondri è fondamentale per lo studio delle malattie neurodegenerative.
- I mitocondri del cervello di ratto forniscono un modello ben caratterizzato per questi studi.
- L'isolamento rapido dei mitocondri è essenziale per preservarne le proprietà.
Scopo dello studio
- Studiare il meccanismo della citotossicità amiloide sulla membrana mitocondriale.
- Utilizzare i mitocondri cerebrali di ratto come modello biologico per questa indagine.
- Analizzare gli effetti di diverse fibrille amiloidi sull'integrità mitocondriale.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di mitocondri da tessuto cerebrale di ratto.
- Analisi delle fibrille amiloidi dell'alpha-sinucleina.
- Esperimenti in vitro per valutare le perturbazioni della membrana.
- Mantenimento di temperature basse per prevenire il deterioramento mitocondriale.
Risultati principali
- Caratterizzazione degli effetti dei fibrilli amiloidi sulle membrane mitocondriali.
- Evidenze di perturbazioni della membrana indotte da aggregati amiloidi.
- Approfondimenti sul rapporto tra tossicità amiloide e funzione mitocondriale.
- Stabilimento di un modello in vitro affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- I mitocondri rappresentano un modello prezioso per lo studio della tossicità degli amiloidi.
- Comprendere queste interazioni potrebbe portare a nuove intuizioni sui meccanismi neurodegenerativi.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo modello per esplorare strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
Questo protocollo fornisce un modello in vitro biologicamente rilevante per valutare la permeabilizzazione della membrana mitocondriale indotta da amiloide, un meccanismo chiave nella patologia delle malattie neurodegenerative. Utilizzando mitocondri isolati dal cervello di ratto, l'approccio consente una valutazione diretta delle interazioni tra fibrille amiloidi e membrane nativi degli organelli, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. Gli effetti dipendenti dalla struttura, osservati in particolare con le fibrille di alfa-sinucleina, offrono informazioni predittive utili per prioritizzare candidati terapeutici in base ai profili di tossicità mitocondriale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni tra fibrille amiloidi e membrane mitocondriali per chiarire le relazioni struttura-tossicità.
- Valore operativo: Fornisce un saggio riproducibile per valutare l'integrità mitocondriale mediante il rilascio di MDH e la produzione di ROS come parametri funzionali.
- Valore predittivo: Permette l'identificazione precoce di specie amiloidi con elevato potenziale di alterazione della membrana, guidando la selezione dei composti promettenti e la riduzione dei rischi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione di mitocondri cerebrali con integrità della membrana confermata, destinati a screening di composti o fibrille.
- Output quantitativo: Fornisce parametri misurabili – rilascio di MDH e fluorescenza delle ROS – che permettono analisi dose-risposta e confronti tra diverse preparazioni di amiloide.
- Scalabilità: Il protocollo è compatibile con formati multi-pozzetto (ad esempio, piastre a 96 pozzetti) per la misurazione delle ROS, facilitando lo screening di media capacità di varianti di fibrille o composti inibitori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Modella direttamente un meccanismo proposto di tossicità dell'amiloide nelle malattie neurodegenerative, collegando risultati ottenuti in vitro a processi patofisiologici.
- Continuità Traduzione: Supporta studi allineati ai biomarcatori mediante la quantificazione del malfunzionamento mitocondriale, un aspetto osservato in modelli derivati da pazienti e in campioni clinici.
- Riduzione del Rischio Preclinico: Aiuta a selezionare interventi mirati all'amiloide identificando le forme fibrillari più probabili di compromettere la funzione mitocondriale in contesti tissutali rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, in particolare dopo il legame al bersaglio e prima dell'ottimizzazione del composto leader, fornendo un'analisi meccanicistica del danno agli organelli indotto dagli amiloidi. Complementa i saggi biochimici e cellulari aggiungendo un contesto di membrana nativa alla valutazione della tossicità.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni tra amiloide e mitocondri e la chiarificazione dei percorsi associati allo stress ossidativo e al fallimento bioenergetico.
- Screening: Permette la standardizzazione del saggio e la verifica della riproducibilità durante la valutazione degli effetti di composti sulla permeabilizzazione mitocondriale indotta da amiloide.
- Analisi: Produce letture quantitative (attività della MDH, livelli di ROS) che consentono il confronto del potenziale tossico tra diverse preparazioni di amiloide o varianti genetiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici modellando un meccanismo conservato di disfunzione mitocondriale osservato nei modelli di malattie neurodegenerative.
- Riutilizzo aziendale: I passaggi di isolamento mitocondriale e di validazione dell'integrità creano una piattaforma riutilizzabile applicabile ad altre proteine amiloidogeniche o a mitocondri specifici per tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio collegando la struttura delle fibrille amiloidi alla rottura della membrana mitocondriale.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità attraverso l'isolamento standardizzato, la conferma dell'integrità (attività MDH) e condizioni di incubazione controllate.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando specie amiloidi con elevato potenziale di tossicità mitocondriale, riducendo gli investimenti in bersagli non rilevanti dal punto di vista meccanicistico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento basato sulla valutazione del rischio segnalando precocemente fenomeni di tossicità a livello di organelli che potrebbero prevedere problemi di sicurezza in fasi avanzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di isolamento mitocondriale e nei saggi di attività enzimatica per garantire la qualità della preparazione.
- Richiede l'uso di attrezzature per la centrifugazione in grado di garantire forze g precise e controllo della temperatura (4°C) per mantenere l'integrità mitocondriale.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la valutazione dell'integrità della membrana (ad esempio, soglie di attività della MDH) al fine di permettere il confronto tra studi.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il modello a mitocondri provenienti da diverse regioni cerebrali o specie, il che potrebbe influenzare la suscettibilità di base.
- È limitato dalla natura in vitro del modello, che potrebbe non rappresentare pienamente gli ambienti cellulari dinamici o i meccanismi compensatori presenti in vivo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Brain Homogenization and Mitochondrial Isolation
4:33
Mitochondrial Membrane Integrity Determination
5:58
Malate Dehydrogenase Activity Determination
7:07
In vitro α-synuclein, Bovine Insulin, and HEWL Fibril Formation
10:11
Treatment of Mitochondria with Amyloid Fibrils, MDH Release Assay, and ROS Measurement
12:14
Results
14:07
Conclusion
